Abstract Apoptosis is a biochemically regulated mechanism leading to the destruction of an individual cell. An inadequate apoptosis is partly responsible for uncontrolled survival of malignantly transformed cells and formation of cancer. The growth of a tumor depends on the proliferative capacity and destruction of tumor cells either through apoptosis or necrosis. In this work, the extent of apoptosis and the expression of apoptosis-regulating proteins were studied by 3'-end labeling of fragmented DNA (TUNEL) and immunohistochemistry in a set of 166 tissue samples consisting of 33 HCCs, 39 gallbladder carcinomas, 7 gallbladder dysplasias and 87 pancreatic carcinomas. In addition, p53 protein and P-glycoprotein expression was studied immunohistochemically. The extent of apoptosis was estimated by using apoptotic index, defined as a percentage of apoptotic cells in the entire tumor cell population. The present results show an average apoptotic index of 0.73% in HCC, 0.68% in gallbladder and 0.69% in pancreatic carcinoma. Bcl-2 positivity was found in only 3% of the HCCs, 10% of gallbladder and 13% of pancreatic carcinomas. Bax positivity was seen in all of the gallbladder and pancreatic carcinoma cases. Mcl-1 positivity was found in 87% of gallbladder and 86% of pancreatic tumors. The apoptotic index in bcl-2 positive cases was lower (0.35%) than in cases showing no immunoreactivity (0.64%) in pancreatic tumors (P = 0.013). Apoptotic index was higher in pancreatic tumors with strong bax immunoreactivity (0.70%) than in other cases (0.34%) (P = 0.002). Caspase 3, 6 and 8 expression was found in 92%, 92% and 73% of HCC, 95%, 77% and 77% of gallbladder carcinoma and 80%, 80% and 74% of pancreatic carcinoma cases, respectively. p53 positivity was found in 23% of hepatocellular, 57% of gallbladder and 41% of pancreatic carcinomas. P-glycoprotein was observed in 65% of the HCCs. Patients with Pgp positive tumors had a significantly shorter disease-free interval than those with Pgp negative tumors (P < 0.05). To evaluate the growth potential of HCC and pancreatic carcinoma, a growth index from the scores obtained for apoptosis, necrosis and cell proliferation was designed. Patients with a high degree of proliferation relative to the degree of necrosis and apoptosis (i.e. had a positive growth index) in HCC lesions had a significantly shorter survival (P = 0.004) and disease-free interval after operation (P = 0.019) than those with a tumor predominated by apoptosis and necrosis. Results were in line with HCC in pancreatic carcinoma, but the association did not reach statistical significance (P = 0.09). According to the results the extent of apoptosis was similar in HCCs, gallbladder and pancreatic carcinomas. These tumors also showed here a similar expression pattern of the bcl-2 family of proteins and caspases. None of the individual parameters associated significantly with apoptosis except for bcl-2 and bax in pancreatic carcinoma, neither was there any association between p53 and P-glycoprotein expression and apoptosis. Calculation of a growth index might be helpful in assessing the prognosis of patients with tumors with a scant stroma, such as HCC.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第22688号 / 医博第4632号 / 新制||医||1045(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 武藤 学, 教授 小川 誠司, 教授 溝脇 尚志 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Apoptosis is a type of programmed cell death which plays a fundamental role in maintaining homeostasis in multi-cellular organisms. The Bcl-2 family has been identified as the central players in regulation of apoptosis. It consists of anti-apoptotic proteins (e.g Bcl-XL) and pro-apoptotic proteins which are further classified as BH3 proteins (e.g Bim, Bid) and effector proteins (e.g Bax, Bak). BH3-proteins regulate apoptosis by activating the pro-apoptotic proteins Bax and Bak to permeabilize mitochondria, and/or by inhibiting anti-apoptotic proteins such as Bcl-XL and Bcl-2. In this study, we employed fluorescence spectroscopy and functional assays with full-length Bim and showed that major Bim isoforms have similar activities in vitro. Bim preferably activates Bax over Bak while Bid preferably activates Bak. Bim displayed a unique binding to Bcl-XL so that the Bim-Bcl-XL complex is resistant to BH3-mimic drug ABT-263 treatment while Bid does not. A Bcl-XL enhancer BH3 TCTP was also shown to interact with Bim-Bcl-XL and Bid-Bcl-XL complex differently, where a single mutation abolished its enhancement of Bid-Bcl-XL but not Bim-Bcl-XL. Closer investigation of the dual apoptotic functions of the BH3-protein Bim revealed that the C-terminal membrane binding domain (MBD) is unexpectedly also involved both in binding of Bim to Bax in solution and in activating Bax. Multiple mutations in this domain reduced or abolished binding to membranes but did not affect binding to Bax or correlate with Bax activation. Deletion eliminated binding to and activation of Bax, but not binding to or inhibition of Bcl-XL. Thus MBD mediates binding to both membranes and Bax separately. On the other hand, although the MBD is not the determining factor for interactions with Bcl-XL, our data demonstrates Bim MBD also plays a major role in binding to Bcl-XL. The C-terminal MBD was shown to be contributing to the ABT-263 resistance of Bim-Bcl-XL complex by directly interacting with Bcl-XL. We discovered additional interactions between the MBD of Bim and both Bcl-XL and Bcl-2. Our data suggested a novel topology and mechanism for the Bim-MBD that positions the central hydrophobic residues of the MBD appropriately for binding to Bcl-XL. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD) / Apoptosis is a type of programmed cell death which plays a fundamental role in maintaining homeostasis in multi-cellular organisms. The Bcl-2 family has been identified as the central players in regulation of apoptosis. It consists of anti-apoptotic proteins (e.g Bcl-XL) and pro-apoptotic proteins which are further classified as BH3 proteins (e.g Bim, Bid) and effector proteins (e.g Bax, Bak). Here we showed that Bim is constitutively active in vitro and preferably activates Bax, distinguishing itself from Bid which preferably activate Bak. We showed that the C-terminus membrane binding domain (MBD) of Bim plays a crucial role in reguating binding and activation of Bax, as well as providing extra binding support to Bcl-XL, independent of its membrane binding feature.

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A major challenge in cancer therapy is the emergence of acquired resistance to a wide range of chemotherapeutic drugs with unrelated structures and activities. Possible mechanisms to explain drug resistance are induction of efflux pumps, activation of scavenging pathways and/or changes in the oncogene status of a cell. A number of studies have shown that overexpression of Bcl-2 confers resistance by preventing drug induced apoptosis. In this thesis, Madin Darby canine kidney epithelial (MOCK) cells were used to investigate the relationship between cisplatin resistance and Bcl-2 expression. In our studies overexpression of Bcl-2 was sufficient in preventing apoptosis induced by serum deprivation. However, treatment with varying cisplatin doses did not induce an apoptotic response. Electron microscopy and in situ DNA end labelling experiments show changes distinct from those associated with serum deprivationinduced apoptosis. Survival as assessed by DNA fluorometry and clonogenic assays clearly demonstrate that the overexpression of Bcl-2 fails to protect against the cytotoxic effects of cisplatin in MOCK cells. Our results show that cisplatin induces a form of cell death distinct from apoptosis and suggests that multiple pathways to cell death exist which are differentially regulated in a cell type-specific and stimuli-specific fashion. / Thesis / Master of Science (MS)

La mort cellulaire programmée est un phénomène essentiel retrouvé chez pratiquement toutes les formes de vie. Chez les mammifères, l'apoptose est une forme de mort importante et très étudiée qui a beaucoup influencé l'étude de la mort cellulaire programmée chez les végétaux. Si la plupart des régulateurs et des effecteurs de l'apoptose animale ne sont pas retrouvés chez les plantes, la similarité de certaines caractéristiques morphologiques et biochimiques laisse croire que certains sentiers de régulation sont évolutivement conservés entre ces deux règnes. Dans ce travail, nous démontrons que les homologues végétaux de BI-1, l'un des rares régulateurs de l'apoptose retrouvé chez les plantes, sont très bien conservés structurellement; certaines caractéristiques déduites des BI-1 végétaux permettent de supposer un mode d'action dans la régulation de la mort. Aussi, nous montrons que les homologues végétaux de BI-1 inhibent l'apoptose induite par la surexpression de Bax chez les cellules humaines 293. Le développement et la caractérisation d'un modèle de mort cellulaire induite par Bax chez les végétaux ont aussi été entrepris. Dans un premier temps, l'expression transitoire de Bax murin par infiltration d'Agrobacterium dans des feuilles de tabac n'a pas causé de phénotype de mort. Par contre, des lignées stables de cellules de tabac BY-2 exprimant constitutivement Bax, seul ou en fusion avec les rapporteurs GFP ou GUS, présentent une mort cellulaire prématurée. La mort de ces cellules est accompagnée d'un changement de l'aspect des cultures, de la fragmentation de l'ADN génomique et de modifications morphologiques caractéristiques des cellules végétales en PCD. Ces lignées ont aussi une sensibilité accrue à la mort causée par un milieu de culture sans sucrose. L'ensemble de ces données, remis dans un contexte plus large, renforce l'idée de l'existence une forme de mort évolutivement ancienne à l'origine de toutes les formes de PCD retrouvées aujourd'hui.

La protéine proapoptotique Bax joue un rôle fondamental au cours de la voie intrinsèque de l’apoptose. Elle participe au déclenchement de la mort en permettant la libération de facteurs apoptogéniques mitochondriaux vers le cytosol. Un des points-clé de la fonction de Bax est son activation, caractérisée par la transition entre une forme cytosolique, globulaire et inactive de la protéine et une conformation mitochondriale, membranaire et active. Les différentes étapes de l’activation de Bax sont relativement bien connues, toutefois un grand nombre de questions reste en suspens quant-à leur régulation.Ce travail s’est focalisé sur la régulation de l’activation de Bax par les kinases Akt et GSK-3β ainsi que par la protéine antiapoptotique Bcl-xL . Ces régulations ont été caractérisées en exprimant la protéine Bax humaine chez la levure Saccharomyces cerevisiae, un paradigme d’étude simplifié qui permet d’accéder aux composantes individuelles des mécanismes d’activation de Bax.Les données obtenues suggèrent qu’il existe deux étapes régulées indépendamment au cours de l’activation de Bax. Nous avons montré que la protéine kinase GSK-3β favorise l’adressage de Bax vers la mitochondrie mais qu’elle n’entraîne pas un changement de conformation suffisant à son activation complète et à la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe. Des changements de conformations complémentaires de Bax sont requis pour conduire à une forme capable d’entraîner la libération des facteurs apoptogéniques mitochondriaux. La protéine kinase Akt est impliquée dans le contrôle de Bax via la phosphorylation de la sérine 184 et participe à l’inhibition de l’apoptose. Nous avons mis en évidence qu’une mutation phosphomimétique de la sérine 184 ou l’expression d’Akt, en l’absence de partenaires antiapoptotiques, stimulent un changement de conformation de Bax vers une forme active. Akt semble donc plus jouer un rôle sur la conformation de Bax qu’entraîner une inhibition directe. La présence de protéines antiapoptotiques serait ainsi requise pour l’inhibition de Bax en présence d’Akt.D’autre part, nous nous sommmes intéressés aux mécanismes d’action de la protéine antiapoptotique Bcl-xL . Nous avons déterminé que Bcl-xL pouvait favoriser l’adressage de Bax vers la membrane mitochondriale tout en exerçant un rôle antiapoptotique. Ceci suggère que Bcl-xL intervienne dans le contrôle des étapes tardives de l’activation de Bax. Ce contrôle est dépendant d’une interaction stable entre les deux protéines. Inversement, un variant de Bcl-xL n’interagissant que de façon transitoire avec Bax (Bcl-xL ∆C) entraîne l’activation de Bax. Cette observation est en faveur d’un modèle d’activation indirecte de Bax consécutive à la rupture de l’interaction avec Bcl-xL et dans lequel les protéines à BH3-seulement telles que Bad joueraient un rôle crucial. / Proapoptotic protein Bax plays a major role during apoptosis intrinsic pathway. Bax promotes cell death by inducing the release of apoptogenic factors from mitochondria to cytosol. Bax activation is a key step of its function which involves a change from a globular, cytosolic and inactive conformation to an active mitochondrial, membrane inserted conformation. Bax activation substeps are rather well known, however their regulation remains to be characterized.This work focuses on the study of the regulation of Bax activation by kinases Akt and GSK-3β and by antiapoptotic protein Bcl-xL . Human Bax regulations have been studied by expressing the protein in yeast Saccharomyces cerevisiae which represents a simplified paradigm for the understanding of the individual components of Bax activation mecha- nisms.Our data suggest that there are two independently regulated steps during Bax activation. We showed that GSK-3β expression led to Bax addressing to mitochondria but was not sufficent to promote a complete activation and mitochondrial outer membrane premeabilization. Further conformational changes are required to promote Bax full activation and the release of mitochondrial apoptotic factors. Protein kinase Akt is involved in Bax activation control through the phosphorylation of serine 184 and contributes to apoptosis inhibition. We observed that either a phosphomimetic mutation of serine 184 or coexpression of Akt, in the absence of antiapoptotic partners, were responsible of Bax conformational change into an active form. By itself Akt did not inhibit Bax but appeared more likely to control its conformational change. Thus, implication of antiapoptotic proteins seems to be critical in a model of Bax inhibition by Akt.Furthermore, we tried to understand the molecular mechanisms of antiapoptotic protein Bcl-xL inhibition on Bax. We determined that Bcl-xL could increase Bax mitochondrial localization while leading to its inhibition suggesting that Bcl-xL controled Bax late activation steps. Bax inhibition was dependent on a stable interaction with Bcl-xL . Conversely, a variant of Bcl-xL having a transitory interaction with Bax (Bcl-xL ∆C) was able to promote Bax activation. This supports a model of Bax indirect activation following the rupture of interaction with Bcl-xL in which BH3-only proteins like Bad would play an important role.

Des signes d'apoptose, une forme de suicide cellulaire programmé, ont été décrits dans les gamètes et l'embryon préimplantatoire de nombreuses espèces de mammifères y compris l'homme, à la fois in vitro et in vivo. Parce que le développement embryonnaire serait lié à un équilibre entre prolifération et mort cellulaire, l'étude du contrôle génétique de l'apoptose dans les embryons préimplantatoires est d'une importance considérable. Par ailleurs, on sait que la qualité des gamètes (en particulier des ovocytes) influencerait leur propre survie mais également le développement embryonnaire précoce. Les régulateurs d'apoptose appartenant à la famille Bcl-2 occupent une place centrale dans les voies de décision de vie ou de mort cellulaire. Dans le premier volet de ce travail de thèse, nous avons analysé l'expression des membres de la famille Bcl-2 lors de la transition ovocyte-embryon au troisième jour (J3) et montré que les trois sous-groupes de la famille Bcl-2 présentent un profil d'expression dynamique tout au long du développement embryonnaire précoce humain. La régulation des niveaux d'expression de ces gènes au cours du développement embryonnaire précoce pourrait donc s'avérer cruciale pour le contrôle de la survie embryonnaire, notamment sous des conditions de culture suboptimales. Dans le second volet, nous nous sommes intéressés à l'analyse du transcriptome au cours du développement embryonnaire précoce humain, et plus particulièrement lors de la spécification du trophectoderme. La confrontation du transcriptome des embryons à J3 avec celui des cellules du trophectoderme nous a permis de mettre en évidence des processus moléculaires qui pourraient jouer un rôle important lors de la différenciation du TE, tels que la stéroïdogenèse et les régulations épigénétiques. En plus de son intérêt fondamental, la connaissance de l'expression génique et des mécanismes moléculaires régulant des processus clés tels que l'apoptose et la différenciation cellulaire au cours du développement embryonnaire préimplantatoire peut permettre d'ouvrir des pistes de recherche diagnostique et thérapeutique intéressantes. / Apoptosis, a form of cell death by self-destruction, has been reported in gametes and preimplantation embryos both in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that cell death processes can impact embryo developmental competence. Moreover, quality of the gametes (particularly of the oocytes) is relevant not only for their own survival but can also influence embryonic development during the early cleavage stages. Thus, the investigation of apoptosis-related genes and mechanisms in early embryos is crucial. Bcl-2 family proteins, through balanced interactions between pro- and anti-apoptotic members, play a pivotal role in controlling cell life and death. In a first part, we analyzed the expression patterns of Bcl-2 family members during the human oocytes-to-day 3 embryo transition and showed that several members were differentially regulated. The regulation of the expression levels of anti- and pro-apoptotic Bcl-2 family members during early embryonic development may therefore be crucial for the control of early embryo survival, especially under suboptimal culture conditions. In a second part, we were interested in studying the transcriptome during human early embryonic development, and particularly during the trophectoderm specification. The comparison of the transcriptome of embryos on day 3 with that of trophectoderm cells allowed us to identify new molecular processes that could play an important role during trophectoderm differentiation and development, such as steroidogenesis and epigenetic regulations. In addition to its fundamental interest, a better knowledge of gene expression and molecular mechanisms regulating key processes such as apoptosis and cell differentiation during human early embryonic development may provide new guides for diagnosis and therapeutic strategies.

La thématique du laboratoire de l’équipe d’Adam Telerman porte sur la réversion tumorale, un processus rare au cours duquel les cellules cancéreuses perdent leur phénotype malin, et deviennent des cellules dites révertantes. Plusieurs protéines clefs impliquées dans cette transformation ont été mises en évidence, dont TCTP (Translationally Controlled Tumor Protein). La protéine TCTP est également impliquée dans la régulation de l’apoptose en interagissant et en renforçant l’activité anti-apoptotique de Mcl-1 et de Bcl-xl, deux protéines appartenant à la famille des Bcl-2. Ce projet s’attache à comprendre en termes moléculaires le mode d’action de TCTP au cours de l’apoptose. / Adam Telerman’s team research focuses on tumor reversion, a rare process in which cancer cells lose their malignant phenotype, and therefore become revertant. Many key proteins were showed to be involved in this transformation, including TCTP (translationally Controlled Tumor Protein). TCTP protein is also involved in apoptosis regulation by interacting and strengthening the anti-apoptotic activity of Mcl-1 and Bcl-xl, two proteins from Bcl-2 family.

L’apoptose ou mort cellulaire programmée joue un rôle prépondérant dans l’homéostasie cellulaire. Ce processus est très finement régulé par les protéines de la famille BCL-2 qui contrôlent la perméabilité de membrane mitochondriale externe et la libération du cytochrome c, deux événements majeurs précédant la mort cellulaire. Les protéines anti-apoptotiques de la famille BCL-2 contribuent à la tumorigenèse et sont impliquées dans la résistance des cancers aux molécules chimiothérapeutiques ; à ce titre, elles représentent des cibles importantes pour le développement de nouvelles thérapies. BCL2A1 est un membre anti-apoptotique de la famille BCL-2 impliqué dans la chimiorésistance de nombreuses tumeurs. La protéine BCL2A1 a pour caractéristique d’avoir une demi-vie courte due à sa dégradation constitutive par le système ubiquitine-protéasome. Ceci régule la stabilité et la fonction anti-apoptotique de BCL2A1 et représente un mécanisme suppresseur de tumeur majeur. Cependant, les enzymes qui contrôlent les modifications post-traductionnelles impliquées dans l’ubiquitination et la dégradation de BCL2A1 demeurent, à ce jour, inconnues. Dans la présente thèse, nous donnons un aperçu des acteurs et des mécanismes impliqués dans la régulation de l’ubiquitination de BCL2A1. Nous présentons des preuves que TRIM28 est une E3 ubiquitine-ligase pour BCL2A1. En effet, les protéines TRIM28 et BCL2A1 endogènes interagissent ensemble au niveau des mitochondries et la déplétion de TRIM28 diminue l’ubiquitination de BCL2A1. Nous montrons aussi que TRIM17 stabilise BCL2A1 en empêchant son interaction avec TRIM28 et son ubiquitination médiée par TRIM28, et que l’activité de GSK3 est impliquée dans l’inhibition de la dégradation de BCL2A1. Ainsi, BCL2A1 et son proche homologue MCL-1 sont régulés par des facteurs communs mais de façon opposé. Finalement, la surexpression de TRIM28 ou l’inactivation de TRIM17 diminue le niveau protéique de BCL2A1 et restaure la sensibilité des cellules de mélanomes aux thérapies utilisant des inhibiteurs de la kinase BRAF. Globalement, nos résultats décrivent un rhéostat moléculaire au sein duquel deux protéines de la famille TRIM régulent de façon antagoniste la stabilité de BCL2A1 et modulent ainsi la mort cellulaire. / Apoptosis or programmed cell death plays a crucial role in tissue homeostasis and is regulated by the Bcl-2 proteins, which control mitochondria membrane permeability and cytochrome c release, two events that precede cell demise. Anti-apoptotic Bcl-2 family members can contribute to tumorigenesis and cause resistance to anti-cancer regimens, therefore representing important targets for novel therapeutics. BCL2A1 is an anti-apoptotic member of the BCL-2 family that contributes to chemoresistance in a subset of tumors. BCL2A1 has a short half-life due to its constitutive processing by the ubiquitin-proteasome system. This constitutes a major tumor-suppressor mechanism regulating BCL2A1 function. However, the enzymes involved in the regulation of BCL2A1 protein stability are currently unknown. Here we provide the first insight into the regulation of BCL2A1 ubiquitination. We present evidence that TRIM28 is an E3 ubiquitin-ligase for BCL2A1. Indeed, endogenous TRIM28 and BCL2A1 bind to each other at the mitochondria and TRIM28 knock-down decreases BCL2A1 ubiquitination. We also show that TRIM17 stabilizes BCL2A1 by blocking TRIM28 from binding and ubiquitinating BCL2A1, and that GSK3 is involved in the phosphorylation-mediated inhibition of BCL2A1 degradation. BCL2A1 and its close relative MCL1 are thus regulated by common factors but with opposite outcome. Finally, overexpression of TRIM28 or knock-out of TRIM17 reduced BCLA1 protein levels and restored sensitivity of melanoma cells to BRAF-targeted therapy. Therefore, our data describe a molecular rheostat in which two proteins of the TRIM family antagonistically regulate BCL2A1 stability and modulate cell death.Sommaire