Tesis presentada para optar al Grado de Doctor en Farmacología / La periodontitis es una enfermedad infecciosa con un componente inflamatorio crónico que se produce como resultado del desbalance entre los microorganismos que conforman la biopelícula subgingival y la respuesta inmune del hospedero. La colonización de microorganismos patógenos y la respuesta inmunológica desencadenada que conducen a la destrucción de los tejidos de inserción de los dientes, como son el hueso alveolar, el ligamento periodontal y el cemento radicular, resultan finalmente en la pérdida de dientes. La presencia de bacterias anaerobias Gram-negativo específicas en la biopelícula subgingival es relevante en la etiología y progresión de la periodontitis. Dentro de ellas Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) es considerada un patógeno “clave” en el inicio de la enfermedad periodontal. A pesar de presentarse en una baja abundancia en sitios enfermos comparado con la microbiota oral total, esta bacteria es capaz de inducir cambios en el microbioma oral y causar disbiosis, conduciendo al desarrollo de la periodontitis. P. gingivalis además, es la bacteria más frecuentemente aislada en pacientes con periodontitis crónica (P. crónica) y ha sido relacionada con la progresión de esta enfermedad. No obstante, no está claro por qué su presencia en individuos sanos no se asocia con la enfermedad y los mecanismos que utiliza para el desarrollo y/o progresión de la periodontitis tampoco han sido totalmente dilucidados. Entre los factores de virulencia de P. gingivalis, el LPS destaca por su variabilidad estructural la cual le otorga la capacidad de dirigir e incluso evadir la respuesta inmunológica del hospedero, así como la actividad antimicrobiana de los péptidos endógenos, como es el caso de las defensinas (hBDs). P. gingivalis es capaz de reducir su interacción electrostática con péptidos catiónicos como Polimixina B (PMB), incrementando su resistencia por una de-fosforilación mediada por una fosfatasa en la posición 4´ del lípido A (gen PGN_0524). Junto con modificar su lípido A, P. gingivalis sintetiza dos tipos de LPS (A-LPS y O-LPS) que difieren en la región del Antígeno O polimérico (APS y AgO, respectivamente). Varios estudios sugieren que el lípido A es relevante en la resistencia a PMB, sin embargo su relación con la resistencia a otros péptidos catiónicos presentes en la cavidad oral (hBDs) no ha sido estudiada, así como tampoco se conoce el rol que pudieran tener otras estructuras del LPS, como el APS y AgO en dicha resistencia. Por lo anteriormente expuesto, en el presente trabajo se propuso determinar la susceptibilidad de aislados clínicos de P. gingivalis, provenientes de individuos clínicamente diagnosticados con periodontitis crónica (P. crónica) e individuos periodontalmente sanos, en presencia de PMB y evaluar la participación de la fosfatasa 4´ del lípido A de P. gingivalis en la resistencia a PMB y las hBDs-1 a -4. Además, se evaluó el rol de otras regiones del LPS como el AgO y/o APS en la resistencia a péptidos catiónicos, utilizando como modelo la PMB. Nuestros resultados muestran que aislados de P. gingivalis de pacientes con P. crónica presentan mayor resistencia a PMB respecto a aquellos obtenidos de individuos sanos. Además, aislados de individuos sanos son significativamente menos susceptibles a PMB respecto de la cepa de referencia ATCC 33277. Si bien una mutante que carece del gen de la fosfatasa en la posición 4´ del lípido A es totalmente susceptible a PMB, la presencia de este gen en los aislados no se correlaciona con la resistencia diferencial observada, ya que todos los aislados presentaban el gen. Más aún, en el análisis estructural del lípido A de los aislados se demostró la presencia de estructuras fosforiladas en la posición 4´, tanto en aislados susceptibles como resistentes a PMB, indicando que la composición del lípido A de P. gingivalis no es el único factor determinante en la resistencia de los aislados clínicos a PMB, y muy probablemente frente a otros péptidos catiónicos, puesto que la mutante fue capaz de crecer incluso a las concentraciones más altas de las hBDs-1 a -4. Aislados de individuos sanos carecen de moléculas de AgO de alto peso molecular y APS, sugiriendo que P. gingivalis presente en individuos periodontalmente sanos no produce A-LPS o lo pierde. Finalmente, aislados de pacientes con P. crónica carecen de moléculas de APS de bajo peso molecular, sugiriendo que moléculas de AgO y APS de alto peso molecular son relevantes en la resistencia diferencial de P. gingivalis a los péptidos catiónicos PMB y hBDs-1 a -4. / Periodontitis is an infectious disease with a chronic inflammatory component that occurs as result from imbalance between microorganisms forming biofilm and subgingival host immune response. Pathogenic microorganisms colonization and the immune response elicited lead to destruction of teeth insertion tissue such as: alveolar bone, periodontal ligament and cementum, finally resulting in tooth loss. The presence of specific Gram-negative anaerobic bacteria in subgingival biofilm is relevant for the etiology and progression of periodontitis. Among them, Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) is a "key" pathogen for the onset of periodontal disease. Although present in diseased sites in low abundance compared to the total oral microbiota, this bacterium is able to induce changes in the oral microbiome and cause dysbiosis, leading to development of periodontitis. P. gingivalis is the bacteria most frequently isolated in patients with chronic periodontitis and has been linked to progression of disease. However, it is unclear how their presence in healthy individuals is not associated with disease and the mechanisms for the development and/or progression of periodontitis have not been completely understood. Among P. gingivalis virulence factors the LPS noted for its structural changes conferring the ability to orchestrate and subvert the host immune response, and to resist endogenous peptides antimicrobial activity, such as defensins (hBDs). P. gingivalis reduces its electrostatic interaction with cationic peptides as Polymyxin B (PMB) and increases resistance by phosphatase lipid A 4´dephosphorylation (PGN_0524 gene). Besides modify their lipid A, P. gingivalis synthesizes two different types of LPS (A-LPS and O-LPS) differing at region of polymeric O antigen (OAg and APS, respectively). Several studies suggest that relevance for lipid A in PMB resistance, but its relationship with other cationic peptides resistance, relevant in the oral cavity (hBDs) has not been studied, and the possible role for the other known structures in LPS, such as APS and OAg in resistance. By the above, the present work proposed to determine the susceptibility of P. gingivalis clinical isolates, from chronic periodontitis (P. chronic) patients and periodontally healthy individuals to PMB and evaluate participation of lipid A 4' phosphatase in resistance to PMB and hBDs-1 to -4. In addition, the role of other regions of LPS as OAg and/or APS in resistance to cationic peptides was evaluated using as a model the PMB. Our results showed that isolates of P. gingivalis from P. chronic patients are more resistant to PMB respect from healthy individuals. Furthermore, healthy isolates are less resistant to PMB respect to the reference strain ATCC 33277. While, a mutant lacking phosphatase gene in the lipid A 4' position is totally susceptible to PMB, the presence of this gene in isolates does not correlate with the differential resistant observed since all isolates had the gene. Moreover, the lipid A structural analysis of the isolates shown 4' phosphorylated structures in both, susceptible and resistant PMB isolates, suggesting that P. gingivalis lipid A composition is not the only determining factor in clinical isolates PMB resistance, and probably to other cationic peptides, since the mutant was able to grow even to highest hBDs-1 to -4 concentrations. In healthy subject isolates lacked high molecular weight OAg and APS molecules, suggesting that P. gingivalis in healthy individuals do not produce or lose A-LPS. Finally, P. chronic isolates lacked APS molecules, suggesting that OAg and APS molecules are relevant in P. gingivalis resistance to cationic peptides PMB and hBDs -1 to -4 / Fondecyt

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1442239 bytes, checksum: 5f0041bc266aa2b219384708dc4dd876 (MD5) Previous issue date: 2012-11-20 / In response to an infection, blood cells such as neutrophils produce defensins within minutes to two hours to aid pathogens lysis and stimulate chemotaxis, reaching peak levels in the body in 24 hours. These peptides can also be produced without any stimulus by epithelial cells of the integumentary system. The aim of this work was to study the expression of β-defensins (cBD102 and cBD103) of canine skin diagnosed with canine visceral leishmaniasis (CVL). There were selected 43 skin samples from dogs positive to CVL and healthy, they were included in paraffin blocks and divided into three groups: I desquamative dermatitis (DD) with 16 blocks, II ulcerative dermatitis (UD) 21 blocks and the control group (6 blocks without canine skin problems). It was used the indirect immunoperoxidase technique (IIP) to confirm the LVC diagnosis and the identification of β-defensins, using human primary antibodies (hBD-2 and hBD-3, SIGMA®). The experimental delineation was completely casualized, with a confidence level of 0.95. Note that there was difference (p = 0.03) in the immunostaining intensity between groups, showing higher marcation intensity with cBD102 and cBD103 in the epidermis of the control group compared with DD and DU groups. In the dermis there was difference (p = 0.001) of the two β-defensins studied, being the cBD103 expression higher than the cBD102. This study is the first one relating to the immunological interaction of the extension and intensity expression between the β-defensin cBD102 and cBD103 and canine visceral leishmaniasis in the DD and DU dermatological standards, assessed by immunohistochemistry. / Em resposta a uma infeção as defensinas são produzidas em questão de minutos ou até 2 horas por células sanguíneas como neutrófilos, para auxiliar a lise de patógenos e estimular a quimiotaxia, alcançando níveis máximos no organismo em 24 horas. Também estes peptídeos podem ser produzidos sem estimulo algum pelas células epiteliais do sistema tegumentário. Com base no exposto anteriormente, o objetivo deste trabalho foi estudar a expressão de β-defensinas (cBD102 e cBD103) de pele de cães diagnosticados com leishmaniose visceral canina (LVC). Para tal, foram selecionados 43 amostras de pele entre cães acometidos por LVC e sadios incluídas em blocos de parafina, distribuídos em 3 grupos: I com dermatite descamativa (DD) por 16 blocos, II dermatite ulcerativa (DU) 21 blocos e o grupo controle (6 blocos de cães sem problemas dermatológicos). Foi empregada a técnica de imunoperoxidase indireta (IPI) para a confirmação do diagnóstico de LVC e identificação de β-defensinas, usando os anticorpos primários humanos (hBD102 e hBD103, SIGMA®). O delineamento foi inteiramente casualizado, adotando 0,05% de probabilidade para o erro Tipo I. Nota-se que houve diferença (p=0,003) na intensidade da imunomarcação entre os grupos, observando-se maior intensidade de marcação da cBD102 e cBD103 no grupo controle quando comparados com os grupos DD e DU. Na derme houve diferença (p=0,001) entre a expressão das duas β-defensinas estudadas, sendo a expressão de cBD103 superior a de cBD102. O presente estudo é o primeiro referente à interação imunológica da expressão de extensão e intensidade entre a β-defensina cBD102 e cBD103 e a leishmaniose visceral canina, nos padrões dermatológicos DD e DU, avaliados pela técnica de imunoistoquímica.

Objetivo: o presente estudo prospectivo avaliou a presença de microrganismos periodontopatogênicos, os níveis salivares de arginase e de HBD-2 em indivíduos com gengivite e periodontite tendo como controle indivíduos periodontalmente saudáveis, correlacionando-os aos respectivos parâmetros clínicos. Também foi avaliada expressão gênica do PAR2 crevicular em indivíduos saudáveis e com periodontite. Método: Inicialmente, foram avaliados 89 indivíduos sem doenças sistêmicas, nunca fumantes, sendo 31 saudáveis (média de idade 25,06 5,97), 27 com gengivite (média de idade 33,22 12,09) e 31 com periodontite (média de idade 52,16 11,54), todos submetidos à terapia periodontal não cirúrgica. Coleta salivar para avaliação dos níveis de arginase (quantificada por meio de espectrofotometria) foi realizada no início do tratamento em todos os indivíduos, e naqueles com gengivite e periodontite respectivamente em 30 e 50 dias pós-tratamento. Avaliação clínica de profundidade de sondagem, perda de inserção clínica e índices de placa e gengival e microbiana (Campylobacter rectus, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tanerella forsythia, Treponema denticola e Prevotella intermedia) foram também avaliados nos mesmos tempos. Dentre os 89 indivíduos, amostras do fluido gengival foram coletadas em 10 indivíduos saudáveis e 10 com periodontite para mensuração da atividade do PAR2 crevicular por meio de RT-PCR. Como esta relação foi positiva, foi verificada a quantidade de HBD-2 salivar por meio de ELISA de todos os 89 indivíduos e sua relação com os parâmetros clínicos e microbiológicos. A significância de todas as relações e quantificações foi analisada por meio de testes estatísticos apropriados. Resultados: foi observada uma melhora estatisticamente significativa dos parâmetros clínicos e microbianos após o tratamento periodontal. A arginase salivar estava significativamente mais elevada nos indivíduos com periodontite em relação àqueles com gengivite, e nestes em relação aos saudáveis. O tratamento periodontal promoveu melhora dos indivíduos doentes, cujos parâmetros avaliados tornaram-se estatisticamente semelhantes aos dos saudáveis. Houve maior atividade do PAR2 nos 10 indivíduos com periodontite em relação aos saudáveis e, após o tratamento, houve uma redução estatisticamente significativa deste parâmetro. Por fim, foram observados níveis estatisticamente mais elevados de HBD-2 salivar nos indivíduos com periodontite comparados àqueles com gengivite e aos saudáveis. Não foi possível observar uma correlação entre HBD-2 salivar e os microrganismos analisados. Conclusões: com base nos resultados observados, podemos concluir que: a arginase salivar está significativamente aumentada nos indivíduos periodontalmente comprometidos em relação aos saudáveis; o tratamento periodontal promoveu melhora dos indivíduos doentes em relação aos parâmetros avaliados; indivíduos com periodontite têm maior expressão gênica do PAR2 do que aqueles saudáveis e o tratamento tornou esta expressão semelhante nos dois grupos; indivíduos com periodontite têm níveis estatisticamente mais significativos de HBD-2 salivar do que aqueles saudáveis e aqueles com gengivite; a saliva parece ser uma ferramenta útil para o diagnóstico periodontal e para o monitoramento da eficácia do tratamento periodontal. / Objectives: This prospective study evaluated the presence of periodontopathogenics microorganisms, as it also examined the salivary levels of arginase and HBD-2 from subjects with gingivitis and periodontitis and periodontally healthy subjects as controls, correlating them to relevant clinical parameters. The gene expression of PAR2 crevicular in healthy subjects and periodontitis was also assessed. Methods: Initially, 89 individuals without systemic diseases, who were never smokers, were evaluated. Out of the 89, 31 were healthy subjects (average age 25.06 5.97), 27 have gingivitis (average age 33.22 12.09) and 31 were with periodontitis (average age 52.16 11.54), all underwent nonsurgical periodontal therapy. Saliva was collected for assessing levels of arginase at baseline in all subjects (quantified by spectrophotometry), and repeated on those with gingivitis and periodontitis respectively at 30 and 50 days post treatment. Clinical evaluation of probing depth, clinical attachment loss, both plaque and gingival index as well as microbial evaluation (Campylobacter rectus, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tanerella forsythia, Prevotella intermedia and Treponema denticola) were also assessed at the same time. Among the 89 individuals, gingival fluid samples were collected from 10 healthy ones and from 10 with periodontitis to measure crevicular PAR2 activity by RT-PCR. As the results came out positive, the amount of HBD-2 salivary was tested by ELISA for all 89 subjects assessing its relationship with clinical and microbiological parameters. The significance of all relationships and quantifications were analyzed using appropriate statistical tests. Results: we observed a statistically significant improvement of clinical and microbial parameters after periodontal treatment. Salivary arginase was significantly higher in subjects with periodontitis than in those with gingivitis, and those with gingivitis had higher results than the healthy ones. Periodontal treatment promoted improvement of the non-healthy individuals whose parameters became statistically similar to the healthy ones. There was a greater PAR2 activity in 10 individuals with periodontal disease compared to healthy ones, and after treatment the results showed a statistically significant reduction in this parameter. Finally, we observed statistically higher levels of salivary HBD-2 in individuals with periodontitis compared to both those with gingivitis and those individuals in the healthy group. It has not been possible to observe a correlation between HBD-2 and salivary microorganisms analyzed. Conclusion: Based on the observed results, we can conclude that salivary arginase is significantly increased in periodontally compromised individuals relative to the healthy ones; periodontal treatment promoted improvement of individuals in relation to the assessed parameters; individuals with periodontitis have higher gene expression of PAR2 than those healthy and the periodontal treatment brought similar results to both groups; individuals with periodontitis have statistically more significant levels of salivary HBD-2 than those with healthy gums and gingivitis; and, finally, saliva, besides being useful for periodontal diagnosis, appears to be also helpful for monitoring efficacy of periodontal treatment.