Le laboratoire d’Embryologie Moléculaire étudie les mécanismes moléculaires contrôlant le développement embryonnaire et utilise comme système expérimental l’embryon de xénope. En collaboration le laboratoire du Dr Daniel Christophe, nous avons abordé l’étude du gène XHRT1 chez le xénope. Ce gène est l’orthologue du gène HRT-1/Hey1/Hesr-1/HERP2/CHF2 de souris. Celui-ci, avec deux autres protéines apparentées (HRT2 et HRT3) forme une sous-famille de facteurs de transcription de type bHLH-O qui se différencient des autres facteurs bHLH-O par l’absence d’un motif carboxy-terminal de séquence « WRPW » et par la présence d’un nouveau motif carboxy-terminal conservé de séquence « TEI/VGAF ». Le rôle de ces facteurs HRT dans le développement est encore actuellement mal connu. Dans un premier temps, nous avons déterminé le profil d’expression de XHRT1 au cours de l’embryogenèse. Nous avons observé que ce gène est fortement exprimé au stade neurula dans le plancher du tube neural, et que plus tardivement celui-ci est exprimé dans différentes régions du système nerveux, dans les somites et le dans le pronéphros. Comme attendu pour un membre de la famille des facteurs bHLH-O, nous avons également observé que l’expression précoce de HRT1 au niveau du plancher du tube neural est bien régulée par la voie de signalisation Notch. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés au rôle et au mode d’action du facteur XHRT1 dans le développement du plancher du tube neural. Nous avons pu montrer que XHRT1 agit comme répresseur transcriptionnel et que cette répression nécessite la présence du domaine bHLH et de séquences en aval de celui-ci. Nous avons montré en embryon que la surexpression précoce de XHRT1 induit un blocage de l’expression des marqueurs du mésoderme et une augmentation de marqueur du plancher du tube neural, ce qui est en accord avec le modèle selon lequel la voie de signalisation Notch interviendrait dans le choix de la destinée des cellules de la région médiane en inhibant la différenciation des cellules en notocorde et en favorisant leur différenciation en cellules du plancher du tube neural. XHRT1 n’étant cependant activé qu’à partir du stade neurula, nous avons conclu que les effets observés n’étaient probablement pas dus à XHRT1 mais à un autre facteur bHLH-O apparenté exprimé plus précocement dans les cellules de la ligne mediane de l’embryon. Afin d’éviter ces effets non spécifiques précoces, nous avons utilisé un vecteur d’expression de XHRT1 permettant un contrôle temporel de l’activité de la protéine. Nous avons ainsi montré que l’activation de XHRT1 au stade neurula dans l’ectoderme inhibe la différenciation des cellules précurseurs neurales en neurones et qu’il pourrait ainsi jouer un rôle important dans le développement du plancher du tube neural. Nos résultats ont montré également que XHRT1 est capable d’homo- et hétérodimériser in vivo avec les facteurs Xhairy1 et Xhairy2b coexprimés avec XHRT1 dans le plancher du tube neural. Enfin, nous avons montré que les propriétés de dimérisation de XHRT1 sont dépendantes non seulement du domaine bHLH, mais aussi du domaine Orange et des séquences situées en aval, séquences jouant un rôle important dans le choix du partenaire. Des travaux récents ayant montré que la voie de signalisation Notch joue un rôle important dans le développement du rein, nous avons voulu déterminer l’importance de XHRT1 dans le développement du pronéphros. Nos résultats ont montré que XHRT1 ainsi que d’autres facteurs bHLH-O sont exprimés de manière dynamique, d’abord dans le glomus puis dans la partie dorso-antérieure de l’ébauche du pronéphros à l’origine des tubules proximaux, et que leur expression est régulée positivement par Notch. La surexpression de XHRT1 à la fin de la neurulation inhibe la formation du canal et du tubule distal, tandis que l’inhibition de la traduction de la protéine entraîne une réduction de l’expression de marqueurs spécifiques des tubules proximaux et du glomus. Ces résultats démontrent que XHRT1 joue un rôle important comme médiateur de la voie de signalisation Notch dans le pronéphros.

Mammalian promoters often contain DNA-elements that can be bound by a number of closely related transcription factors (TFs) that cannot bind to the same DNA-element simultaneously. It is possible that each TF responds to distinct cues, allowing the gene to be activated in response to multiple stimuli. An alternative possibility is that each TF binds sequentially, each contributing to the pre-initiation events leading up to transcription. Here, we explore the exchange of basic-Helix-Loop-Helix-Leucine-Zipper (bHLH-LZ) factors, USF1, USF2 and MITF at the TYROSINASE promoter following induction by UVB-irradiation and methotrexate-administration. We demonstrate, for the first time in human melanoma, differential induction kinetics of TYROSINASE gene in response to an initial or re-induction, a phenomenon akin to "transcription memory" previously described in yeast. We also show that USF2, specifically detected by two different antibodies targeting the N-terminal region, is largely cytoplasmic, at least in the cell lines we have investigated. We also showed that nucleo-cytoplasmic shuttling of these USF2 species is partly regulated by glucose. Using deletion mutants, we demonstrated the requirement of the amino-acids surrounding the USF-specific region and the basic domain in nuclear localisation of USF2, and that amino-acids 1−193 appear to enhance dimerization of USF2 in addition to the classical HLH-LZ dimerization domain. We will further investigate the role(s) played by MYC, MITF, HIF and USF exchange at common targets (which we identified through our ChIP-seq analysis) in gene activation and the effect on the (re)activation potential of these genes when DNA-binding by one or more of these factors are abolished, as well as when the promoter is monopolised by one of these factors through overexpression using cell lines expressing one of the bHLH-TFs under a tet-inducible promoter. In the long run, we aim to understand the potential differences in the role(s) of each bHLH-factors co-occupying E-box elements.

[ES] El éxito de la fertilización en las Angiospermas depende del adecuado y coordinado desarrollo de los diferentes tejidos del gineceo: ovario, estilo y estigma. Los mecanismos moleculares asociados a la correcta formación y desarrollo del gineceo han sido bien estudiados en la especie modelo Arabidopsis thaliana. Diversos genes pertenecientes a múltiples familias de factores de transcripción han sido sugeridos como reguladores indispensables en la correcta formación del estilo y el estigma de las Angiospermas. Entre ellas se encuentran la familia basic Helix Loop Helix, bHLH. Los genes HECATE (HEC) pertenecen al linaje de genes HEC1/2/3/IND. Análisis filogenéticos han revelado que las Angiospermas poseen, al menos, tres copias de genes HEC (HEC1/2/3), mientras que el gen INDEHISCENT (IND) es un parálogo especifico de HEC3 en Brassicaceae; las demás Angiospermas poseen homólogos preduplicación más similares a HEC3 que a IND. Funcionalmente, en Arabidopsis, los genes HEC1/2/3 son redundantes en la correcta formación de gineceo, mientras que IND tiene funciones en la diferenciación de la zona de dehiscencia del fruto. Así, nos propusimos conocer las funciones de los genes HEC, previas a la diversificación de Brassicaceae. Particularmente estudiamos los ortólogos de los genes HEC1/2/3 en Nicotiana benthamiana. En nuestro estudio, los genes NibeHEC1/2 solo se expresan en meristemos vegetativos y hojas, mientras que NibeHEC3 se expresa predominantemente durante el desarrollo de la flor y aumenta su expresión progresivamente hasta la antesis en el tracto de transmisión del estilo, el estigma y las zonas de dehiscencia de anteras y frutos, de un modo similar al que lo hacen conjuntamente los genes HEC1/2/3/IND en Arabidopsis. La caracterización funcional por VIGS y CRISPR-Cas9 nos confirmó que NibeHEC3 está implicado en la elongación de la región estilar y la diferenciación de las papilas estigmáticas. Además, NibeHEC3 es importante en el desarrollo de las anteras y los frutos de Nicotiana benthamiana. En conjunto, los datos reportados más nuestra caracterización funcional sugieren que los genes HEC3, previos al evento de duplicación del linaje HEC3/IND, conservan las funciones ancestrales en el desarrollo de la región más distal del gineceo y la diferenciación de la zona de dehiscencia de frutos, mientras que en Brassicacaceae, luego de la duplicación del linaje HEC3/IND, estas dos funciones parecen haberse subfuncionalizado durante la diversificación de la familia Brassicaceae entre los genes HEC1/2/3 e IND respectivamente. Además, describimos una novedosa función para los genes HEC3 asociada al desarrollo de las anteras en Nicotiana benthamiana, una función con la cual no se había asociado a los genes HEC con anterioridad. Así, el dilucidar detalles adicionales acerca de las funciones de los genes HEC y sugerir como estos interactúan para la formación del gineceo en eudicotiledóneas fuera de Brassicaceae ayudará a proporcionar información sobre diversos aspectos en la evolución y desarrollo del gineceo y del fruto en Angiospermas. / [CA] L'èxit de la fertilització en les Angiospermes depén de l'adequat i coordinat desenvolupament dels diferents teixits del gineceu: ovari, estil i estigma. Els mecanismes moleculars associats a la correcta formació i desenvolupament del gineceu han sigut ben estudiats en l'espècie model Arabidopsis thaliana. Diversos gens pertanyents a múltiples famílies de factors de transcripció han sigut suggerits com a reguladors indispensables en la correcta formació de l'estil i l'estigma de les Angiospermes. Entre elles es troben la família basic Helix Loop Helix, bHLH. Els gens HECATE (HEC) pertanyen al llinatge de gens HEC1/2/3/IND. Anàlisis filogenètiques han revelat que les Angiospermes posseeixen, almenys, tres còpies de gens HEC (HEC1/2/3), mentre que el gen INDEHISCENT (IND) és un paràleg específic d'HEC3 en Brassicaceae; les altres Angiospermes posseeixen homòlegs preduplicació més similar a HEC3 que a IND. Funcionalment, en Arabidopsis, els gens HEC1/2/3 són redundants en la correcta formació de gineceu, mentre que IND té funcions en la diferenciació de la zona de dehiscència del fruit. Així, ens vam proposar conéixer les funcions dels gens HEC, previs a la diversificació de Brassicaceae. Particularment estudiem els ortòlegs dels gens HEC1/2/3 en Nicotiana benthamiana. En el nostre estudi, els gens NibeHEC1/2 només s'expressen en meristemes vegetatius i fulles; mentre que NibeHEC3 s'expressen predominantment durant el desenvolupament de la flor i augmenten la seua expressió progressivament fins a l'antesi; aquests es mantenen expressats en el tracte de transmissió de l'estil, l'estigma i les zones de dehiscència d'anteres i fruits. Igual que ho fan conjuntament els gens HEC1/2/3/IND en Arabidopsis. La caracterització funcional per VIGS i CRISPR-Cas9 ens va confirmar que NibeHEC3 està implicat en l'elongació de la regió estilar i la diferenciació de les papil·les estigmàtiques. A més, NibeHEC3 és important en la diferenciació de les anteres y la zona de dehiscència de fruits de Nicotiana. Així mateix, les variacions detectades entre les seqüències dels ortòlegs del clade HEC3/IND podria explicar els canvis funcionals i els patrons d'expressió diferencials entre les espècies d'angiospermes. En conjunt, les dades reportades més la nostra caracterització funcional suggereixen que els gens HEC3, previs a la duplicació del llinatge HEC3/IND, conserven les funcions ancestrals en el desenvolupament de la regió més distal del gineceu i la diferenciació de la zona de dehiscència de fruits, mentre que en Brassicacaceae, després de la duplicació del llinatge HEC3/IND, aquestes dues funcions semblen haver-se subfuncionalitzat durant la diversificació de la família Brassicaceae entre els gens HEC1/2/3 i IND respectivament. A més, descrivim una nova funció per als gens HEC3 associada a la diferenciació de les anteres en Nicotiana benthamiana, una funció amb la qual no s'havia associat als gens HEC amb anterioritat. Així, el dilucidar detalls addicionals sobre les funcions dels gens els HEC i suggerir com aquests interactuen per a la formació del gineceu en eudicotiledònies fora de Brassicaceae ajudarà a proporcionar informació sobre diversos aspectes en l'evolució i desenvolupament del gineceu i del fruit en Angiospermes. / [EN] Successful fertilization in Angiosperms depends on the proper and coordinated development of the different tissues of the gynoecium: ovary, style and stigma. The molecular mechanisms associated with the correct formation and development of the gynoecium have been well studied in the model species Arabidopsis thaliana. Several genes belonging to multiple families of transcription factors have been suggested as indispensable regulators in the correct formation of the style and stigma in Angiosperms. Among them are the basic Helix Loop Helix family, bHLH. The HECATE (HEC) genes belong to the HEC1/2/3/IND gene lineage. Phylogenetic analyses have revealed that Angiosperms possess at least three copies of HEC genes: HEC1/2/3, whereas the INDEHISCENT (IND) gene is a specific HEC3 paralog in Brassicaceae; the other Angiosperms possess pre-duplication homologs more like to HEC3 than to IND. Functionally, in Arabidopsis, HEC1/2/3 genes are redundant in proper gynoecium formation while IND has functions in the differentiation of the fruit dehiscence zone. Thus, we set out to understand the functions of HEC genes prior to diversification of Brassicaceae In particular, we studied the orthologs of the HEC1/2/3 genes in Nicotiana benthamiana. In our study, NibeHEC1/2 genes are only expressed in vegetative meristems and leaves; while NibeHEC3 genes are predominantly expressed during flower development and increase their expression progressively until anthesis; they remain expressed in the style transmission tract, stigma and dehiscence zones of anthers and fruits. The same is true for the HEC1/2/3/IND genes in Arabidopsis. Functional characterization by VIGS and CRISPR-Cas9 confirmed that NibeHEC3 is involved in the elongation of the stylar region and differentiation of stigmatic papillae. In addition, NibeHEC3 is important in anther development and the differentiation of the dehiscence zone of Nicotiana benthamiana fruits. Taken together, the reported data plus our functional characterization suggest that HEC3 genes, prior to the HEC3/IND lineage duplication event, retain ancestral functions in the development of the most distal region of the gynoecium and the differentiation of the fruit dehiscence zone, whereas in Brassicaceae, after the duplication of the HEC3/IND lineage, these two functions appear to have been sub-functionalized during the diversification of the Brassicaceae family between the HEC1/2/3 and IND genes, respectively. In addition, we describe a novel function for the HEC3 genes associated with anther development in Nicotiana benthamiana, a function not previously reported for the HEC genes. Thus, elucidating additional details about the functions of the HEC genes and suggesting how they interact for gynoecium formation in eudicots outside Brassicaceae will help to provide insights into various aspects of gynoecium and fruit evolution and development in Angiosperms. / Agradezco a la beca Santiago Grisolia (GRISOLIA/2017/170), al Ministerio de Ciencias e Innovación BIO2015-64531-R, RTI2018-099239-B-I00 y el ExpoSeed H2020-MSCA- RISE-2015-691109 por facilitar la realización de esta investigación. / Ortiz Ramírez, CI. (2023). Evolución y caracterización funcional de los genes HEC3 en el desarrollo de flores y fruto de Nicotiana benthamiana [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/193298

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Le contrôle combinatoire de l’ expression des gènes est une caractéristique importante du profil spatio-temporel de l'accumulation des flavonoïdes chez les plantes. Des résultats précédents avaient démontré chez Arabidopsis thaliana, que la régulation de l’accumulation des anthocyanes et des proanthocyanidines repose sur l'activité de facteurs de régulation de la transcription de type R2R3-MYB et bHLH qui forment des complexes ternaires ("MBW") avec la protéine TTG1 (WDR). L'objectif de la thèse était de caractériser les complexes MBW impliqués et leurs cibles, pour avoir une compréhension globale des mécanismes transcriptionnels qui contrôlent la biosynthèse des flavonoïdes.En utilisant différentes approches génétiques et moléculaires, nous avons montré que seuls les gènes « tardifs » (c’est à dire DFR, LDOX, BAN, TT19, TT12 et AHA10) sont des cibles directes des complexes MBW. Bien que le complexe de régulation impliquant les protéines TT2-TT8-TTG1 ait un rôle majeur dans la régulation de ces gènes structuraux dans la graine d’Arabidopsis, trois autres complexes contenant MYB5, GL3 ou EGL3 sont également impliqués de façon tissu-spécifique. Comme l’expression du gène TT8 joue un rôle clef dans ces régulations, une dissection fonctionnelle de son promoteur a été entreprise. Elle a montré la nature modulaire de ce promoteur avec deux domaines impliqués dans l’expression tissu-spécifique et un troisième dans la force du promoteur. Les résultats obtenus suggèrent également l’existence d’autres régulateurs qui restent à caractériser. Enfin, nous avons développé une nouvelle technique de caractérisation des interactions entre les facteurs de transcription et les promoteurs, basée sur l’expression transitoire dans des protoplastes de mousse (i.e. Physcomitrella patens). Nous avons ainsi pu identifier les éléments cis des promoteurs impliqués dans la régulation de l’expression de TT8 et de chacun des promoteurs cibles des complexes MBW.L’ensemble de ces travaux permet de fournir un modèle plus complet du réseau de régulations transcriptionnelles qui contrôle la biosynthèse des proanthocyanidines et des anthocyanes, ainsi que des outils et de nouvelles pistes pour poursuivre ces études chez Arabidopsis et d’autres plantes. / The combinatorial control of gene expression is a key feature of the spatio-temporal pattern of flavonoid accumulation in plants. Previous results have shown that the regulation of anthocyanins and proanthocyanidins (PAs or tannins) pigmentation relies on the transcriptional activity of R2R3-MYB and bHLH proteins that form “MBW” ternary complexes with TTG1 (WD-Repeats), in Arabidopsis thaliana. The purpose of the thesis was to figure out the nature and spatio-temporal activity of these MBW complexes and to identify their direct targets, which were essential steps toward a comprehensive understanding of the transcriptional mechanisms that control flavonoid biosynthesis. Using different molecular and genetic approaches this thesis has demonstrated that only late biosynthetic genes (namely DFR, LDOX, BAN, TT19, TT12 and AHA10) are direct targets of the MBW complexes. Interestingly, although the TT2-TT8-TTG1 complex was shown to play the major role in regulating the expression of these structural genes in developing seeds, three additional MBW complexes that contain MYB5, GL3 or EGL3 are also involved, in a tissue-specific manner. Because the expression of TT8 is largely involved in these regulations, a functional dissection of its promoter was carried out. Two modules drive the tissue-specific activity of the TT8 promoter in PA- and anthocyanin-accumulating cells, and a third module is responsible for the strength of the promoter. Interestingly, this regulation involves at least six different MBW complexes. Our results also suggest that some putative new regulators remain to be discovered. Last, use of a newly developed fast and sensitive transient expression system that relies on protoplasts of the moss Physcomitrella patens has allowed the identification of both, specific cis-regulatory elements through which TT8 expression is regulated and the minimal promoter for each of the genes that are targeted by the MBW complexes.Altogether, by answering fundamental questions and by demonstrating or invalidating previously made hypotheses, we have provided a new and comprehensive view of the regulatory mechanisms controlling PA and anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis, as well as new clues and tools for further investigation of this pathway in Arabidopsis and other plant species.

Transcription factors are proteins that regulate transcription of genes by binding to specific DNA sequences proximal to the gene. The specificity and affinity of protein-DNA recognition is critical for proper gene regulation. This thesis explores the mechanisms of binding to the sequence 5’CACGTG, a common recognition sequence both in plants where it is known as the G-box and in mammalian cells where it is termed the E-box. This sequence is of clinical interest because it is the target of the transcription factor Myc, an oncogene linked to many cancers. A number of alpha-helical proteins with different dimerization elements, from the basic region-leucine zipper (bZIP), basic region helix-loop-helix leucine zipper (bHLHZ) and basic region helix-loop-helix-PAS (bHLH-PAS) protein families, are capable of binding to this sequence. The basic regions of all these protein families contain residues that contact DNA and determine DNA sequence specificity while the other subdomains are responsible for dimerization specificity. First, the influence of protein-DNA contacts on sequence specificity of the plant bZIP protein EmBP-1 was probed by point mutations in the basic region. Residues that contact the DNA outside the core G-box sequence and residues that contact the phosphate backbone were found to be important for sequence specificity. Second, the impact of the dimerization subdomains of bHLHZ protein Max, the required heterodimerization partner of the Myc protein, and bHLH-PAS protein Arnt was probed by mutation, deletion and inter-family subdomain swapping studies. All studied protein families are intrinsically disordered, forming structure upon dimerization and DNA binding. The dimerization domains were found to indirectly influence DNA binding by affecting folding, dimerization ability or proper orientation of the basic regions relative to DNA. Lastly, a new strategy for selection of G-box binding proteins in the Yeast One-hybrid system is explored. Together, these studies broaden our understanding of the structure-function relationship of the DNA-binding activities of these closely related families of transcription factors. The creation and characterization of mutants with altered specificity, affinity and dimerization specificity may also be useful for biotechnology applications.

Transcription factors are proteins that regulate transcription of genes by binding to specific DNA sequences proximal to the gene. The specificity and affinity of protein-DNA recognition is critical for proper gene regulation. This thesis explores the mechanisms of binding to the sequence 5’CACGTG, a common recognition sequence both in plants where it is known as the G-box and in mammalian cells where it is termed the E-box. This sequence is of clinical interest because it is the target of the transcription factor Myc, an oncogene linked to many cancers. A number of alpha-helical proteins with different dimerization elements, from the basic region-leucine zipper (bZIP), basic region helix-loop-helix leucine zipper (bHLHZ) and basic region helix-loop-helix-PAS (bHLH-PAS) protein families, are capable of binding to this sequence. The basic regions of all these protein families contain residues that contact DNA and determine DNA sequence specificity while the other subdomains are responsible for dimerization specificity. First, the influence of protein-DNA contacts on sequence specificity of the plant bZIP protein EmBP-1 was probed by point mutations in the basic region. Residues that contact the DNA outside the core G-box sequence and residues that contact the phosphate backbone were found to be important for sequence specificity. Second, the impact of the dimerization subdomains of bHLHZ protein Max, the required heterodimerization partner of the Myc protein, and bHLH-PAS protein Arnt was probed by mutation, deletion and inter-family subdomain swapping studies. All studied protein families are intrinsically disordered, forming structure upon dimerization and DNA binding. The dimerization domains were found to indirectly influence DNA binding by affecting folding, dimerization ability or proper orientation of the basic regions relative to DNA. Lastly, a new strategy for selection of G-box binding proteins in the Yeast One-hybrid system is explored. Together, these studies broaden our understanding of the structure-function relationship of the DNA-binding activities of these closely related families of transcription factors. The creation and characterization of mutants with altered specificity, affinity and dimerization specificity may also be useful for biotechnology applications.

Le laboratoire d’Embryologie Moléculaire étudie les mécanismes moléculaires contrôlant le développement embryonnaire et utilise comme système expérimental l’embryon de xénope. En collaboration le laboratoire du Dr Daniel Christophe, nous avons abordé l’étude du gène XHRT1 chez le xénope. Ce gène est l’orthologue du gène HRT-1/Hey1/Hesr-1/HERP2/CHF2 de souris. Celui-ci, avec deux autres protéines apparentées (HRT2 et HRT3) forme une sous-famille de facteurs de transcription de type bHLH-O qui se différencient des autres facteurs bHLH-O par l’absence d’un motif carboxy-terminal de séquence « WRPW » et par la présence d’un nouveau motif carboxy-terminal conservé de séquence « TEI/VGAF ». Le rôle de ces facteurs HRT dans le développement est encore actuellement mal connu. <p>Dans un premier temps, nous avons déterminé le profil d’expression de XHRT1 au cours de l’embryogenèse. Nous avons observé que ce gène est fortement exprimé au stade neurula dans le plancher du tube neural, et que plus tardivement celui-ci est exprimé dans différentes régions du système nerveux, dans les somites et le dans le pronéphros. Comme attendu pour un membre de la famille des facteurs bHLH-O, nous avons également observé que l’expression précoce de HRT1 au niveau du plancher du tube neural est bien régulée par la voie de signalisation Notch.<p>Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés au rôle et au mode d’action du facteur XHRT1 dans le développement du plancher du tube neural. Nous avons pu montrer que XHRT1 agit comme répresseur transcriptionnel et que cette répression nécessite la présence du domaine bHLH et de séquences en aval de celui-ci. Nous avons montré en embryon que la surexpression précoce de XHRT1 induit un blocage de l’expression des marqueurs du mésoderme et une augmentation de marqueur du plancher du tube neural, ce qui est en accord avec le modèle selon lequel la voie de signalisation Notch interviendrait dans le choix de la destinée des cellules de la région médiane en inhibant la différenciation des cellules en notocorde et en favorisant leur différenciation en cellules du plancher du tube neural. XHRT1 n’étant cependant activé qu’à partir du stade neurula, nous avons conclu que les effets observés n’étaient probablement pas dus à XHRT1 mais à un autre facteur bHLH-O apparenté exprimé plus précocement dans les cellules de la ligne mediane de l’embryon. Afin d’éviter ces effets non spécifiques précoces, nous avons utilisé un vecteur d’expression de XHRT1 permettant un contrôle temporel de l’activité de la protéine. Nous avons ainsi montré que l’activation de XHRT1 au stade neurula dans l’ectoderme inhibe la différenciation des cellules précurseurs neurales en neurones et qu’il pourrait ainsi jouer un rôle important dans le développement du plancher du tube neural. Nos résultats ont montré également que XHRT1 est capable d’homo- et hétérodimériser in vivo avec les facteurs Xhairy1 et Xhairy2b coexprimés avec XHRT1 dans le plancher du tube neural. Enfin, nous avons montré que les propriétés de dimérisation de XHRT1 sont dépendantes non seulement du domaine bHLH, mais aussi du domaine Orange et des séquences situées en aval, séquences jouant un rôle important dans le choix du partenaire.<p>Des travaux récents ayant montré que la voie de signalisation Notch joue un rôle important dans le développement du rein, nous avons voulu déterminer l’importance de XHRT1 dans le développement du pronéphros. Nos résultats ont montré que XHRT1 ainsi que d’autres facteurs bHLH-O sont exprimés de manière dynamique, d’abord dans le glomus puis dans la partie dorso-antérieure de l’ébauche du pronéphros à l’origine des tubules proximaux, et que leur expression est régulée positivement par Notch. La surexpression de XHRT1 à la fin de la neurulation inhibe la formation du canal et du tubule distal, tandis que l’inhibition de la traduction de la protéine entraîne une réduction de l’expression de marqueurs spécifiques des tubules proximaux et du glomus. Ces résultats démontrent que XHRT1 joue un rôle important comme médiateur de la voie de signalisation Notch dans le pronéphros. / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les lignines sont des hétéropolymères phénoliques de la paroi cellulaire, principalement à base de p-coumaryl, coniférylique et sinapylique alcools. Ces monolignols sont synthétisées dans le cytoplasme de la voie des phénylpropanoïdes, peut ensuite transportées vers les parois des cellules où ils sont polymérisés par oxydation en p-hydroxyphényl (H), guaiacyle (G) et syringyle (S) des unités de lignine. Cette étape de polymérisation par oxydation est conduite par les peroxydases dépendantes H₂O₂ et / ou laccases dépendantes O₂. Dans cette étude, nous avons signalé pour la première fois que les laccases sont également impliqués dans la lignification du les herbes. Un gène de laccase spécifique (BdLAC5) a été identifié parmi les 29 gènes de laccase non redondants dans Brachypodium génome, qui est responsable de la lignification dans les tiges de Brachypodium distachyon, une plante modèle pour les graminées. BdLAC5 gène a été retrouvé fortement exprimé dans les organes lignifiées (internodal, nœud et le pédoncule) et mal exprimé dans les organes avec faible niveau de lignine (jeunes feuilles et épillet), ni dans les tissus non-lignifiée (endosperme). Deux autres laccases BdLAC6 et BdLAC8 sont également trouvés coexprimés avec BdLAC5 et curieusement ils appartiennent à la même clade phylogénétique. BdLAC6 et BdLAC8 sont orthologues de Arabidopsis LAC4 et LAC2 respectivement. Dans les expériences d'hybridation in situ ont démontré le signal le plus intense dans les fibres interfasciculaires de l'entre-nœud a été détectée avec des sondes BdLAC5. En outre, des essais ont révélé que les protéines immunomarquages BdLAC5 pourraient être sécrétés dans la matrice de la paroi cellulaire, car nous avons détecté des particules fluorescentes dans ou à proximité de la paroi cellulaire. Le double mutant laccase touchée BdLAC5 et BdLAC8 a clairement montré que la lignification dans les fibres interfasciculaires impliqué différents gènes / protéines que la lignification dans les cellules métaxylème de Brachypodium. Métaxylème cellules ont été que faiblement affectés dans le double mutant lorsque les fibres interfasciculaires montré diminution dramatique de Wiesner coloration. Les différents mécanismes de lignification entre xylème et fibres est discutée. L'interaction physique et la synergie entre réglementation spécifique R2R3-MYB, bHLH et WDR protéines est bien étudiée dans la biosynthèse des flavonoïdes, racine des cheveux, trichomes et le développement en mucilage de graines de différentes espèces de plantes. Dans cette étude, nous avons essayé de comprendre les rôles de MYB-bHLH-WDR pour la régulation de la biosynthèse de la lignine. / Lignins are cell wall phenolic heteropolymers, mainly made from p-coumaryl, coniferyl, and sinapyl alcohols. These monolignols are synthesized in the cytoplasm from the phenylpropanoid pathway, then may transported to the cell walls where they are oxidatively-polymerized into p_hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) and syringyl (S) lignin units. This oxidative polymerization step is driven by H₂O₂-dependent peroxidases and/or O₂-dependent laccases. In this study we reported for the first time that laccases are also involved in lignification in grasses. A specific laccase gene (BdLAC5) was identified among 29 non-redundant laccase genes in Brachypodium genome, which is responsible for the lignification in stems of Brachypodium distachyon, a model plant for grasses. BdLAC5 gene was found highly expressed in lignified organs (internode, node and peduncle) and poorly expressed in organs with low lignin level (young leaf and spikelet) nor in non-lignified tissue (endosperm). Two other laccases BdLAC6 and BdLAC8 are also found coexpressed with BdLAC5 and interestingly enough they belong to the same phylogenetic clade. BdLAC6 and BdLAC8 are close orthologues of Arabidopsis LAC4 and LAC2 respectively. In situ hybridization experiments demonstrated the most intense signal in the interfascicular fibers of the internode was detected with BdLAC5 probes and then for BdLAC8 and BdLAC6 probes. Furthermore, immunolabelling assays revealed that BdLAC5 proteins might be secreted into the cell wall matrix because we detected some fluorescent particles close to or in the cell wall. The double laccase mutant affected in BdLAC5 and BdLAC8 (5ho8ho) clearly showed that the lignification in interfascicular fibers involved different genes/proteins than the lignification in metaxylem cells of Brachypodium. Metaxylem cells were only poorly affected in the double mutant when interfascicular fibers showed dramatic decrease of Wiesner staining. The different mechanisms of lignification between xylem and fibers is discussed. The physical interaction and regulatory synergy between specific R2R3-MYB, bHLH and WD repeat protein is well studied in the biosynthesis of flavonoids, root hair, trichome and seed mucilage development in different plant species. In this study, we were trying to figure out the roles of MYB- bHLH-WDR for the regulation of lignin biosynthesis.

La réactivation aberrante du gène TWIST1 embryonnaire a été identifiée dans le laboratoire comme un mécanisme d'inactivation récurrente des voies dépendantes de p53 et Rb dans de nombreuses tumeurs. En diminuant la sénescence et l’induction de l'apoptose, TWIST1 coopère avec des protéines oncogéniques dans la transformation cellulaire in vitro et intervient dans l'initiation et la progression tumorale in vivo. Comme TWIST1 est très faiblement exprimée dans la plupart des cellules adultes différenciées, elle constitue une cible attrayante pour des thérapeutiques futures. Récemment, l’héterodimère TWIST1/E2A (E12 ou E47, deux produits d'épissage alternatif du gène TCF3) joue un rôle pro-métastatique dans le cancer de la prostate (Gajula et al., 2015), alors que ce complexe est la forme oncogénique de TWIST1 dans des cellules épithéliales mammaires humaines (Jacqueroud et al., 2016). L'hétérodimérisation par l'intermédiaire des domaines HLH est une condition sine qua non pour la formation de domaine de liaison d'ADN (Murre et Massari 2000). Une approche in silico basé que la modélisation par homologie des complexes de TWIST1 met en évidence le rôle déterminant des boucles inter-hélicales dans le maintien de complexes de TWIST1 à l’ADN en étudiant plusieurs insertions de TWIST1 observées chez les patients atteints de syndrome Saethre-Chotzen (Bouard et al., 2014). Ensuite des approches in silico et in vitro nous ont permis de comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la reconnaissance des séquences E-box des promoteurs de gènes cibles par l'héterodimère TE et leur stabilisation sur l'ADN (bouard et al., 2016). Nous avons décrit trois états différents du complexe TWIST1/E12 lié à l'ADN à des séquences E-box fonctionnels et modifiés en fonction de l'affinité de reconnaissance des E-box par TWIST1 / E12 (Bouard et al, 2016). Et enfin, cette approche in silico nous a permis de montrer l’impact de la phosphorylation de TWIST1 sur la dimérisation et sur la liaison à l’ADN des complexes de TWIST1. Cette dernière étude met en exergue l’importance des régulations post-traductionnelles dans l’étude de l’activité de la protéine TWIST1 et dans la recherche d’inhibiteurs / Aberrant reactivation embryonic TWIST1 gene has been identified in the laboratory as a recurrent inactivation mechanism dependent pathways of p53 and Rb in many tumors. Decreasing senescence and the induction of apoptosis, TWIST1 cooperates with oncogenic proteins in cell transformation in vitro and is involved in tumor initiation and progression in vivo. As TWIST1 is very weakly expressed in most adult differentiated cells, it is an attractive target for future therapies. Recently, the heterodimer TWIST1 / E2A (E12 or E47, two alternative splice product of the TCF3 gene) plays a pro-metastatic role in prostate cancer (Gajula et al., 2015), while the complex is the oncogenic form of TWIST1 in human mammary epithelial cells (Jacqueroud et al., 2016). The heterodimerization through HLH areas is a prerequisite for DNA binding domain of training (Massari and Murre 2000). An in silico approach that based homology modeling of complex TWIST1 highlights the key role of inter-hélicales loops in the DNA TWIST1 complex retention student TWIST1 several insertions observed in patients Saethre syndrome -Chotzen (Bouard et al., 2014). Then approaches in silico and in vitro have enabled us to understand the molecular mechanisms underlying the recognition of E-box sequences of the promoters of target genes by TE heterodimer and stabilize DNA (Bouard et al. 2016). We have described three different states of the complex TWIST1 / E12 bound to DNA to functional E-box sequences and modified according to the affinity recognition by E-box TWIST1 / E12 (Bouard et al, 2016). Finally, this approach in silico allowed us to show the impact of TWIST1 phosphorylation on dimerization and binding to DNA TWIST1 complexes. This latest study highlights the importance of post-translational regulation in the study of the activity of the protein and TWIST1 in the search for inhibitors