En France, la consommation d'énergie finale de bioénergies a crû de 35 % lors de la dernière décennie pour atteindre une part de 8,1 % de la demande finale en 2012. Leur développement a été incité car elles sont une source d'énergie renouvelable, elles permettent de réduire la dépendance aux importations d'énergies fossiles et de diminuer les émissions de gaz à effet de serre (GES). Elles sont aussi un moyen de dynamiser les secteurs agricoles et sylvicoles et de maintenir et de créer des emplois non délocalisables.Mais ce développement est soumis à des incertitudes : compétitivité économique vis-à-vis des ressources fossiles et d'autres alternatives renouvelables, disponibilité de la biomasse, choix technologiques, et mécanismes incitatifs. De plus, il est confronté à des controverses. L'accroissement de la demande en ressources biomasse a créé de la tension sur leurs prix et menacé les usages existants, comme le secteur des panneaux bois pour la construction au niveau français et le secteur de l'alimentation à l'échelle mondiale. Leur bénéfice environnemental a aussi été remis en cause, en termes d'émissions de particules fines pour la valorisation chaleur et électricité et en termes d'émissions de GES pour les biocarburants. De nouveaux procédés de valorisation, ne suscitant pas ces controverses, pourraient être privilégiés par le législateur au détriment des procédés actuels.Le but de cette thèse est de baliser un certain nombre de ces incertitudes afin de proposer des stratégies technologique et réglementaire pour les filières bioénergies françaises. Pour cela, nous avons développé un modèle de prospective qui décrit de façon détaillée le secteur des bioénergies et ses technologies de conversion actuelles et futures. Il est basé sur un paradigme d'optimisation qui permet de calculer les trajectoires technologiques de moindre coût, de 2010 à 2050, selon un grand nombre de contraintes qui représentent les spécificités du secteur : disponibilité et coût des ressources, paramètres techniques, économiques et environnementaux des procédés de conversion, etc.Dans une première partie, la démarche prospective est décrite. Elle consiste à analyser dans le détail les filières bioénergies : leur structure actuelle, les points de controverse et les systèmes techniques prometteurs, puis à développer un modèle de réflexion prospective basé sur ces données.Quatre questions d'intérêt stratégique pour la filière sont discutées dans la suite du document. Premièrement, la question du niveau de la demande à laquelle pourrait répondre le secteur selon deux scénarios contrastés de disponibilité de ressources métropolitaines est envisagée. Les trajectoires technologiques sont aussi analysées. Deuxièmement, l'impact d'une évolution du contexte réglementaire ainsi que les bénéfices environnementaux des biocarburants sont appréhendés. La troisième question est celle de l'impact de l'essor de la chimie du végétal sur les bioénergies. Enfin, les stratégies technologiques des biocarburants sont étudiées à l'aide d'une méthode Monte Carlo afin de comprendre les conditions du déploiement des diverses technologies disponibles. / French bioenergy consumption increased by 35 % over the last decade. It reached an 8.1% share in final energy demand by 2012. Bioenergy has been fostered for its many benefits as it is a renewable energy source that increases energy supply independence and that reduces greenhouse gases (GHG) emissions. This sector also maintains and provides job at local level and promotes agricultural and forestry economic development.But the sustainability of this development is now subject to uncertainties: economic performance in comparison to fossil fuels, biomass availability, technological choices, and level of incentives. In addition, it faces several controversial points. Firstly, rise in global biomass demand has implied a rise in prices and it has threatened existing uses, such as wood panel manufacturing in the French building sector and food supply at a world scale. Secondly, environmental performance has been criticized: biomass combustion could emit fine particulate matter and GHG emissions of current biofuel processes may be higher than initially assessed. Consequently, new bioenergy pathways, avoiding these controversies, could be promoted by the policy maker.This PhD thesis aims at assessing these uncertainties to elaborate technological and regulatory strategies for French bioenergy sector. So, we created a prospective model which precisely describes this sector and its current and future conversion pathways. It relies on linear programming optimization paradigm that calculates least cost technological trajectories, from 2010 to 2050. Bioenergy sector is modelled by a large number of constraints: availability and cost of biomass, technical, economic and environmental parameters of transformation processes, etc.In the first part, we describe the prospective approach. It consists in analysing precisely bioenergy pathways: the current structure, the controversial points and the promising processes. Then, we explicit the conception of the prospective model: its data and its assumptions.In the second part, four main strategic points of bioenergy sector are discussed. Firstly, we assess the level of demand that could be fulfilled according to two contrasting scenarios of French biomass availability. Technological mix is then analysed. Secondly, we investigate the consequences of a change in biofuel regulatory context and a reconsideration of their environmental benefits. Thirdly, bio-based chemistry development impact on bioenergy production is evaluated. Finally, biofuel technological strategies are studied with a Monte Carlo approach to enhance the comprehension of the economic and environmental conditions of technology deployment.

L'utilisation de plantes dédiées pour la production d'énergie est souvent présentée comme l'une des solutions pour limiter le réchauffement climatique et contribuer au remplacement des énergies fossiles. La production de biocarburants sera durable si elle contribue à réduire les impacts négatifs de l'agriculture au niveau global (émissions de GES), mais aussi local (lessivage des nitrates, consommation en eau). Les cultures énergétiques doivent satisfaire ces exigences tout en alliant un rendement élevé à l'hectare, afin de limiter la concurrence entre productions alimentaires et non alimentaires. Nous avons orienté la thèse vers la quantification du rôle des organes de réserve de Miscanthus x giganteus dans la nutrition azotée de la plante et l'analyse du cycle interne de l'azote dans la culture, en vue d'une modélisation fonctionnelle de ces processus à long terme. L'approche expérimentale s'appuie sur un essai de longue durée de 3 ans, croisant 2 doses d'azote et 2 dates de coupe. Dans une première partie, nous montrons que les traitements ont différencié la production de biomasse aérienne et la teneur en azote des rhizomes. Les réserves souterraines jouent sur l'accumulation d'azote et de carbone dans les parties aériennes au cours de la croissance le printemps suivant. Il existe des relations linéaires étroites entre les flux d'azote et l'état des organes source d'azote lors des phases de remobilisation de l'azote au printemps et à l'automne. Dans une deuxième partie, nous montrons que ce sont principalement les réserves en azote des parties souterraines avant le redémarrage de la culture qui expliquent les différences de production de biomasse en affectant l'efficience de bioconversion des rayonnements (RUE). Dans une troisième partie, nous mettons en évidence la faible proportion de recouvrement dans la plante de l'azote apporté par la fertilisation, grâce à un traçage au 15N de l'azote apporté. Nous montrons également que le rhizome absorbe en même temps qu'il remobilise. M. giganteus est capable de maintenir un cycle de l'azote conservatif : la quantité d'azote remobilisée à l'automne est du même ordre de grandeur que l'azote remobilisé au printemps. Enfin, nous concluons sur les acquis et questions sur le rôle de la mise en réserve de l'azote dans la nutrition azotée de M. giganteus. Ce rôle est primordial, via les processus de remobilisation et de mise en réserve de l'azote. Il a un impact direct sur la production de biomasse par la culture. Prendre en compte les réserves azotées des organes souterrains est indispensable pour aboutir à une modélisation opérationnelle qui permette de simuler la production de biomasse par la culture et les bilans d'azote sur le long terme.

Les alcanes et les alcènes sont des hydrocarbures non cycliques important dans l’industrie. Ils sont synthétisés à partir d'acides gras par une grande variété d’organismes mais les connaissances à ce sujet sont très limitées chez les microalgues. Le but de ces travaux était donc de rechercher la présence d’alcanes ou d’alcènes dans diverses microalgues modèles, et d’essayer d’identifier la ou les enzymes responsables de la synthèse de ces composés. Nous avons mis en évidence la présence d’hydrocarbures linéaires en C15-C17 chez les microalgues Chlorella et Chlamydomonas. Ces composés étaient synthétisés uniquement en présence de lumière. L’absence dans le génome de ces microalgues d’homologues de gènes codant pour des enzymes connues de synthèse d’alcanes/alcènes a permis de conclure à la présence d’un nouveau système de synthèse d’hydrocarbures. Des purifications enzymatique et des analyses protéomique ont permis d’identifier une enzyme candidate qui exprimée chezE. coli est suffisante à la synthèse d’hydrocarbures. L'étude de cette enzyme révella qu'il s'agissait d'une photoenzyme utilisant l'énergie des photons bleue pour décarboxyler les acides grass en alca(e)ne. La structure de cette photoenzyme montre la présence un tunnel hydrophobe contenant l’acide gras et le cofacteur FAD. Cette nouvelle enzyme nommée « alcane photosynthase » amène de nombreuses question: qu'elle est la fonction des hydrocarbures chez ces microorganismes? Quel est le mécanisme catalytique de l’alcane photosynthase? Enfin, elle offre de nouvelles possibilités pour la production de biocarburants utilisant directement l’énergie solaire. / Alkanes and alkenes are important in industry. Alkanes and alkenes are synthesized from fatty acids by a variety of organisms, such as plants and insects. However, the presence in microalgae of enzymes converting fatty acids into hydrocarbons has been poorly studied. The aim of this work was to investigate the presence of alkanes and alkenes in various microalgae models, and try to identify the enzymes responsible for the synthesis of these compounds.We have first demonstrated the presence of linear hydrocarbons C15-C17 in microalgae Chlorella and Chlamydomonas. Then we have shown that the main hydrocarbon formed in Chlorella and Chlamydomonas was derived from cis-vaccenic acid and was synthesized only in the presence of light. Absence of homologues of genes coding for known alkane/alkene biosynthetic enzymes in the genome of Chlorella and Chlamydomonas indicate the presence of an unknown pathway. Enzymatic purification and proteomic analysis allowed to identify a candidate enzyme which, expressed in E. coli lead to the formation of hydrocarbons with variable chain lengths, thus demonstrating that it was really an synthase alkane. Characterization showed that the enzyme was a photoenzyme, which used blue light to catalyse the decarboxylation of fatty acid to an alka(e)ne. The three-dimensional structure of this enzyme revealed a hydrophobic tunnel containing the fatty acid and the FAD cofactor.

Un rattachement ou une formation disciplinaire, pas plus que la relation à des espaces de travail et des instruments spécialisés, ne suffisent seuls à définir une culture scientifique. Ce sur quoi des chercheurs issus d’horizons divers travaillent, construit un mode singulier de conception de leurs activités, pratiques et rapport au monde. Leur réussite est irrémédiablement liée à un sujet, à la fortune que rencontre celui-ci comme innovation dans un contexte social qui le borne et qu’il crée simultanément. Comment s’organise cette (re)conversion vers une nouvelle thématique, alors que l’évolution des modes de financement privilégie aujourd’hui précisément ce cadrage ? Cette thèse propose une enquête sur la notion de « domaine de recherche », que nous définissons a priori comme le cadre des interactions entre l’activité professionnelle de chercheurs et la société autour d’un thème partagé ; elle défend sa dimension épistémique.Ce manuscrit décrit en parallèle le développement des bioénergies, une des principales formes d’énergie dites renouvelables ou encore durables, issue de la biomasse, ses acteurs et leurs jeux d’actions, dans un contexte de forte incitation à conduire une transition énergétique globale, mais aussi de controverses sociales vives. Les deux objectifs de cette thèse convergent :décrire le style de pensée inhérent à un domaine de recherche particulier est nécessaire à l’appréhension, au-delà des seuls discours et promesses, des modes effectifs de développement d’une innovation (ici la mobilisation à grande échelle de végétaux, microorganismes ou déchets pour produire des biocarburants) et donc in fine, à l’évaluation par tout un chacun, de sa pertinence. / Neither academic training within scientific disciplines, nor the daily work in the lab involving specialised equipments, define alone a scientific culture. What diverse researchers from various backgrounds work on, builds a specific way of designing their own activities, practices and relationships with the world. Their individual success is irrevocably bound to a subject, to its fortune as an innovation within the boundaries of a social context it simultaneously changes. How do they perform this (re)conversion to a new domain, as funding agencies nowaday favor this thematic framing? This thesis proposes an investigation into the notion of “research area”, which we a priori define as the frame of interactions between the professional activity of researchers and society around a shared theme; it stands up for its epistemic dimension.This manuscript parallelly describes the “bioenergy” development, a major form of renewable or sustainable energy derived from biomass, its social actors and their interrelations, as strong incentives towards a global energy transition meet sharp social controversies. The two objectives of this thesis meet: describing the inherent style of thinking within a particular research area is required to grasp, beyond the hopes and promises, the actual patterns of development of an innovation (in this case, the large-scale mobilisation of plants, microorganisms or waste to produce biofuels) and thus, ultimately, to collectively evaluate its relevance.

Face à une préoccupation environnementale croissante, les pays du monde accentuent leurs efforts pour réduire leur dépendance aux ressources fossiles, sources majeures d’émissions de gaz à effet de serre, en les remplaçant par des énergies propres, dont la bioénergie. Dans le contexte induit par l’Accord de Paris et les objectifs d’atténuation du changement climatique, la bioénergie connait une attention croissante dans le monde comme moyen de décarbonation de notre société. Ce travail de thèse se concentre sur les perspectives de développ- ement de la bioénergie en s’attachant à analyser l’évolution de la production de bioénergie au regard des politiques d’incitation, des échanges de ressources biomasses et leur utilisation soutenable à long terme dans un contexte de décarbonation des sociétés. Dans ce contexte d’analyse, ce travail porte également sur une meilleure implémentation de la bioénergie dans notre modèle d’optimisation du système énergétique mondial, TIAM-FR. Ce manuscrit est structuré en quatre chapitres. Le premier chapitre présente le positionnement actuel de la bioénergie, les stratégies mises en œuvre pour son développement et la manière dont cela s’intègre dans notre approche de modélisation. Le deuxième chapitre est consacré à la présentation du développement apporté à la filière de bioénergie dans le modèle TIAM-FR. Le troisième chapitre montre notre travail par rapport à l’évaluation du potentiel de la biomasse. Enfin, le dernier chapitre analyse le rôle futur de la bioénergie dans un contexte de lutte contre le réchauffement climatique, à l’échelle mondiale et par un focus réalisé sur quatre pays asiatiques, la Chine, l’Inde, le Japon et la Corée du Sud. / With growing concerns about the environment, countries are increasing efforts to reduce their fossil fuel dependency, the major source of greenhouse gas emissions, by replacing them with clean energy sources including bioenergy. In this context induced by the Paris’ Agreement and climate change mitigation targets, the bioenergy is being highlighted in the pathway to the decarbonization of our society. The work of this thesis concentrates on the perspectives of bioenergy development aiming to analyze the evolution of bioenergy production in view of policies, global exchange of biomass resources and the sustainable utilization of bioenergy in the long term in a context of decarbonization of societies. In terms of analysis, this thesis focuses also on the better implementation of bioenergy chain in our global energy system optimization model, TIAM-FR. This manuscript is structured in four chapters. The first chapter presents the actual position of bioenergy, bioenergy development strategy as well as the way how they are integrated into our modeling approach. The second chapter is dedicated to present the developments effectuated for the bioenergy chain in the model TIAM-FR. The third chapter shows our work regarding the evaluation of biomass resources potentials. Lastly, the role of bioenergy in the climate change mitigation context has been discussed at a global scale and by a focus on four Asian countries, China, India, Japan and South Korea.

Le développement d'organismes photosynthétiques (piégeant le C02 en préservant l'eau douce et les terres cultivables sans ajout d'engrais) capables d'utiliser l'énergie solaire pour produire du dihydrogène (H2) passe par une meilleure compréhension du rôle de l'hydrogénase dans le métabolisme cyanobactérien. Le Laboratoire de Biologie et Biotechnologie des Cyanobatéries où j'ai travaillé durant ma thèse utilise une approche de "Biologie Intégrative" pour analyser le métabolisme qui conduit à la photo-production d’H2 chez la cyanobactérie modèle Synechocystis sp. PCC6803. Mon travail s'est focalisé sur l’analyse des réseaux de régulation amenant à la production d'H2 par l’hydrogénase bidirectionnelle à centre Ni-Fe (composée de 5 sous-unités) codée par l’opéron hox. Lorsque j’ai débuté ce travail, 2 activateurs de l’opéron hox avaient été identifiés: AbrB1 et LexA. Un article dont je suis co-premier auteur est paru (Dutheil et al. 2012 J Bact.), il décrit l'identification par l'utilisation de diverses approches d'un nouveau facteur de transcription de l'opéron hox: AbrB2 (homologue d'AbrB1). J'ai ainsi montré que l'expression de l’opéron hox était régulée négativement par AbrB2 en utilisant des fusions transcriptionnelles au gène rapporteur cat (introduites dans la souche sauvage ou dépourvues d'AbrB2) ainsi que des expériences de qRT-PCR. Par la technique de retard sur gel, nous avons confirmé une interaction directe entre AbrB2 et la région promotrice de l’opéron hox. En collaboration avec deux laboratoires du CEA, nous avons montré qu'un mutant dépourvu d’AbrB2 possède une activité hydrogénase augmentée, confirmant ainsi qu'AbrB2 est un régulateur négatif de la production d'H2.Dans un deuxième temps et en collaboration avec deux post-doc du laboratoire, nous avons mis en évidence le rôle de la cystéine unique d'AbrB2 dans le contrôle redox de son activité de régulation transcriptionnelle.Par la technique du retard sur gel,j’ai montré que cette cystéine n’est pas cruciale pour la fixation d'AbrB2 sur le promoteur hox, mais que par contre, la modification redox de celle-ci l’affecte de manière drastique. Dans le cadre de collaborations, nous avons identifié la modification post-traductionnelle qui peut avoir lieu sur la cysteine d'AbrB2 et il s’agit de la première fois, qu’un tel mécanisme de régulation est identifié pour cette famille de régulateur et chez les cyanobactéries. J’ai construit une souche portant l'allèle muté abrB2 Cys>Ser sur le chromosome et exprimé par le promoteur sauvage d’abrB2. J’ai montré grâce à cette construction et en utilisant diverses techniques (activité hydrogénase, qRT-PCR, Western blot et transcriptome) que la cystéine d'AbrB2 joue un rôle dans son activité de régulation qui est 60% moins bonne sur les 529 gènes cibles (directes ou indirectes) du régulateur muté. L’effet est également visible sur l’activité hydrogénase. Ce résultat a été complété par des tests de surexpression thermoinduite d’AbrB2 qui montrent que la mutation C34S affecte la stabilité de la protéine qui ne s’accumule pas autant que la sauvage dans les même conditions et dont la surexpression est létale. Un manuscrit dont je suis copremier auteur et décrivant ces résultats est en cours de finalisation et sera prochainement soumis à l’Intern. Journ. of Hydrogen Energy.L’ensemble de ces travaux permet de mieux comprendre les mécanismes biologiques liés à l’expression de l’hydrogénase bidirectionnelle et vont dans le sens d’un rôle important de celle-ci dans la détoxification des stress redox. La détermination des relations entre les différents régulateurs de l’hydrogénase et les possibles modifications post-traductionnelles de chacun de ces facteurs que j’ai mises en évidence traduisent une enzyme à la régulation complexe. Ces nouvelles connaissances permettent d’éclairer sous un angle nouveau la photoproduction d’H2 par les cyanobactéries et permettront peut-être d’élaborer des stratégies de production d’H2 efficace. / Developing photosynthetic organism (trapping CO2 while preserving fresh water and arable soils without adding fertilizers) able to use Sun light to produce dihydrogen (H2) is depending on a better understanding of the role of hydrogenase in the cyanobacterial metabolism. The Laboratoire de Biologie et Biotechnologie des Cyanobactéries (LBBC) where I worked during my thesis uses « Integrative Biology » approach to analyze the metabolism leading to H2 photoproduction by the model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803. My work focused on analyzing the regulation network leading to H2 production by the bidirectionnal hydrogenase with Ni-Fe cluster (composed of 5 subunits) encoded by hox operon. When I started this work, two transcriptionnal activators were identified : AbrB1 and LexA. An article, of which I’m sharing first author position, is published (Dutheil et al. 2012 J Bact.), it describes the identification by different approachs of a new transcriptionnal factor of hox operon : AbrB2 (homologous to AbrB1). I showed that hox expression is negatively regulated by AbrB2 by using transcriptionnal fusion to cat reporter gene (introduced in the wild type background or the AbrB2-deleted one) and qRT-PCR experiments. By the electrophoretic mobility shift assay (EMSA) method, we confirmed a direct interaction between AbrB2 and the promoter region of hox operon. Collaborating with two CEA laboratories, we showed that a mutant lacking AbrB2 harbours an increased hydrogenase activity, validating that AbrB2 is a negative regulator of H2 production.In a second time of my thesis and colaborating with two post-doc of the laboratory, we evidenced the role of the unique cysteine of AbrB2 in redox-controlling the transcriptionnal regulator activity of the protein.Using the EMSA method, I showed that the cysteine is not crucial for AbrB2 fixing on hox promoter, but also that the redox modification occuring on this residue inhibits this same binding activity. Collaborating with other labs, we identified the post-translational modifications that may occur on AbrB2 cysteine and it is the first time that such a regulating mechanism is identified for this family of regulators and in cyanobacteria. I constructed a strand harbouring the abrB2C34S mutant allele on the chromosome and expressed by the abrB2 natural promoter. I showed with this construction and using diverse methods (hydrogenase activity, qRT-PCR, Western blot and transcriptome) that AbrB2 cysteine plays a role in its regulating activity : regulating activity is 60% less efficient towards the 529 target genes (either direct and indirect) of the mutated regulator. The effect is also seen on hydrogenase activity and hox genes. This result was completed by thermoinduced overexpression assays that show that C34S mutation of AbrB2 alters protein stability : the mutated protein accumulates less than wild type allele in the same conditions, which is lethal. A manuscript, of which I’m sharing first author position, and describing those results is being finalised and will be submitted soon to the IJHE (International Journal of Hydrogen Energy).Altogether, my results allow a better understanding of the biological mechanisms linked to bidirectionnal hydrogenase expression and agree with a possible role for hydrogenase in detoxifying redox stresses. The determination of the relationships between the different regulators of hydrogenase, and their possible post-translational modifications that I revealed, highlight an enzyme with complex regulation. This new knowledge brings an original outlook on hydrogen photoproduction by cyanobacteria and shall allow elaboration of efficient H2 production strategies.

Le développement d'organismes photosynthétiques (piégeant le C02 en préservant l'eau douce et les terres cultivables sans ajout d'engrais) capables d'utiliser l'énergie solaire pour produire du dihydrogène (H2) passe par une meilleure compréhension du rôle de l'hydrogénase dans le métabolisme cyanobactérien. Le Laboratoire de Biologie et Biotechnologie des Cyanobatéries où j'ai travaillé durant ma thèse utilise une approche de "Biologie Intégrative" pour analyser le métabolisme qui conduit à la photo-production d'H2 chez la cyanobactérie modèle Synechocystis sp. PCC6803. Mon travail s'est focalisé sur l'analyse des réseaux de régulation amenant à la production d'H2 par l'hydrogénase bidirectionnelle à centre Ni-Fe (composée de 5 sous-unités) codée par l'opéron hox. Lorsque j'ai débuté ce travail, 2 activateurs de l'opéron hox avaient été identifiés: AbrB1 et LexA. Un article dont je suis co-premier auteur est paru (Dutheil et al. 2012 J Bact.), il décrit l'identification par l'utilisation de diverses approches d'un nouveau facteur de transcription de l'opéron hox: AbrB2 (homologue d'AbrB1). J'ai ainsi montré que l'expression de l'opéron hox était régulée négativement par AbrB2 en utilisant des fusions transcriptionnelles au gène rapporteur cat (introduites dans la souche sauvage ou dépourvues d'AbrB2) ainsi que des expériences de qRT-PCR. Par la technique de retard sur gel, nous avons confirmé une interaction directe entre AbrB2 et la région promotrice de l'opéron hox. En collaboration avec deux laboratoires du CEA, nous avons montré qu'un mutant dépourvu d'AbrB2 possède une activité hydrogénase augmentée, confirmant ainsi qu'AbrB2 est un régulateur négatif de la production d'H2.Dans un deuxième temps et en collaboration avec deux post-doc du laboratoire, nous avons mis en évidence le rôle de la cystéine unique d'AbrB2 dans le contrôle redox de son activité de régulation transcriptionnelle.Par la technique du retard sur gel,j'ai montré que cette cystéine n'est pas cruciale pour la fixation d'AbrB2 sur le promoteur hox, mais que par contre, la modification redox de celle-ci l'affecte de manière drastique. Dans le cadre de collaborations, nous avons identifié la modification post-traductionnelle qui peut avoir lieu sur la cysteine d'AbrB2 et il s'agit de la première fois, qu'un tel mécanisme de régulation est identifié pour cette famille de régulateur et chez les cyanobactéries. J'ai construit une souche portant l'allèle muté abrB2 Cys>Ser sur le chromosome et exprimé par le promoteur sauvage d'abrB2. J'ai montré grâce à cette construction et en utilisant diverses techniques (activité hydrogénase, qRT-PCR, Western blot et transcriptome) que la cystéine d'AbrB2 joue un rôle dans son activité de régulation qui est 60% moins bonne sur les 529 gènes cibles (directes ou indirectes) du régulateur muté. L'effet est également visible sur l'activité hydrogénase. Ce résultat a été complété par des tests de surexpression thermoinduite d'AbrB2 qui montrent que la mutation C34S affecte la stabilité de la protéine qui ne s'accumule pas autant que la sauvage dans les même conditions et dont la surexpression est létale. Un manuscrit dont je suis copremier auteur et décrivant ces résultats est en cours de finalisation et sera prochainement soumis à l'Intern. Journ. of Hydrogen Energy.L'ensemble de ces travaux permet de mieux comprendre les mécanismes biologiques liés à l'expression de l'hydrogénase bidirectionnelle et vont dans le sens d'un rôle important de celle-ci dans la détoxification des stress redox. La détermination des relations entre les différents régulateurs de l'hydrogénase et les possibles modifications post-traductionnelles de chacun de ces facteurs que j'ai mises en évidence traduisent une enzyme à la régulation complexe. Ces nouvelles connaissances permettent d'éclairer sous un angle nouveau la photoproduction d'H2 par les cyanobactéries et permettront peut-être d'élaborer des stratégies de production d'H2 efficace.

Les microorganismes photosynthétiques suscitent un intérêt biotechnologique grandissant pour la production de dihydrogène (H₂) à partir d'eau et d'énergie solaire en préservant l'eau douce et les terres cultivables sans ajout d'engrais. La cyanobactérie modèle Synechocystis PCC 6803 est capable de produire du H₂ de manière faible et transitoire grâce à une hydrogénase [NiFe] bidirectionnelle Hox. Cette enzyme possède 5 sous-unités protéiques (HoxEFUYH) qui catalysent la réaction réversible : 2H⁺ + 2e⁻ ↔ H₂. Le site actif [NiFe] de cette enzyme est assemblé par un complexe de six protéines HypABCDEF. L’hydrogénase est ensuite maturée par une protéase HoxW qui clive la sous-unité HoxH et active le site catalytique [NiFe]. L’ingénierie de cyanobactéries pour la photoproduction biologique d’H₂ passe par une meilleure compréhension du rôle de l'hydrogénase dans le métabolisme cyanobactérien. Au cours de ma thèse, j’ai construit et analysé 7 mutants sophistiqués de Synechocystis permettant la surexpression simultanée (constitutive ou régulée par la température de croissance) des gènes hoxEFUYHW et hypABCDEF. On a ainsi montré que la surproduction simultanée des protéines HoxEFUYHW et HypABCDEF combinée à une augmentation de la disponibilité de nickel dans le milieu conduit à une augmentation de l’activité hydrogénase d’un facteur 20. D’autre part, un mutant dépourvu de l'opéron hoxEFUYH a permis également de montrer que l'hydrogénase n'est pas indispensable à la croissance dans les conditions photoautotrophiques standard. La comparaison des phénotypes des divers mutants construits durant ce travail a permis également de montrer pour la première fois que l’hydrogénase joue un rôle dans la défense cellulaire contre le stress oxydant induit par le H₂O₂, par la présence de glucose ou de glycérol dans le milieu de culture. Par ailleurs, j'ai participé à la caractérisation d'un nouveau régulateur de l'expression de l’hydrogénase. Ce facteur de transcription (AbrB2) qui réprime l’opéron hoxEFUYH est impliqué dans la tolérance au stress induit par le diamide ou le nickel. Un contrôle redox de l'activité de ce régulateur par une modification post-traductionnelle de glutathionylation a été mise en évidence pour la première fois chez les cyanobactéries. L'ensemble de ces résultats démontre que l’on doit combiner plusieurs stratégies génétiques et physiologiques pour augmenter fortement la production d’hydrogène chez Synechocystis, et que nos mutants sont des outils très importants vers cet objectif. / Photosynthetic organisms are attractive organisms for hydrogen production using water and solar energy, while preserving fresh water and arable soils without adding fertilizers. The model cyanobacterium Synechocystis PCC 6803 produces small and transitory amounts of H₂ thanks to its bidirectional [NiFe] hydrogenase Hox. The Hox complex with its 5 protein subunits (HoxEFUYH) catalyzes the reversible reaction 2H⁺ + 2e⁻ ↔ H₂. The [NiFe] catalytic site of the Hox enzyme is assembled using a six-subunits HypABCDEF complex and matured by the HoxW protease that cleaves HoxH and activates its [NiFe]-containing center. Engineering cyanobacteria for hydrogen production relies on a better understanding of the role of hydrogenase in the cyanobacterium metabolism. During my PhD, I have constructed and analyzed 7 sophisticated mutants of Synechocystis, allowing the simultaneous over-expression (constitutive or regulated by the growth temperature) of the hoxEFUYH and hypABCDEF genes. We demonstrated that the simultaneous over-production of the HoxEFUYH and HypABCDEF proteins, combined to an increase in nickel availability led to an approximately 20-fold increase of the active hydrogenase level. Moreover, using a deleted hox-operon mutant we showed that hydrogenase is dispensable in standard phototrophic growth conditions. Comparing the phenotypes of different mutants constructed in this study enables us to demonstrate for the first time that the hydrogenase operates in cell protection against oxidative stress (H₂O₂) and sugar stress (glucose or glycerol). Besides, I have also participated to the characterization of a new regulator (AbrB2) of the expression of the hydrogenase. This transcription factor represses the hoxEFUYH operon and is involved in the tolerance to stress induced by diamide or nickel. For the first time in cyanobacteria, a redox control of the activity of this regulator by a post-translational gluthathionylation was identified. Collectively, our findings showed that several genetic and physiological strategies should be combined in a single strain to strongly increase hydrogen production in Synechocystis. Meanwhile the presently constructed mutants proved to be very powerful tools to achieve this goal.