Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-06-30Bitstream added on 2014-06-13T20:26:17Z : No. of bitstreams: 1 zanella_lf_dr_botfmvz.pdf: 531665 bytes, checksum: c547ec20928912c591261203344c53d9 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Os líquidos fetais possuem diversas funções que são vitais para o feto. Para a espécie eqüina até o presente momento, não está totalmente definida a composição bioquímica do líquido amniótico no decorrer da gestação. O presente trabalho teve como objetivo verificar a composição bioquímica do liquido amniótico e alantoideano das éguas em diferentes fases da gestação. Para isso analisou-se 60 amostras de fluidos fetais, empregando-se kits comerciais para se determinar a concentração bioquímica da Fosfatase Alcalina, Glicose, Proteínas Totais, Uréia, Creatinina, Cálcio, Cloreto, Sódio e Potássio durante a gestação. A concentração da alfa-fetoproteína foi avaliada empregando-se a eletroforese em gel de poliacrilamida. A concentração da Fosfatase Alcalina no liquido amniótico foi maior quando comparada ao liquido alantoideano nas três fases da gestação (p < 0,05). Para a glicose o valor médio entre os dois fluidos não apresentou variações (p < 0,05). Para a Proteína total o valor médio do liquido amniótico foi maior que o alantoideano (p < 0,05). A Uréia sofreu variações na concentração entre as fases, mas não há diferenças dos valores médios (p > 0,05) entre os fluidos. Para a Creatinina os valores presentes no liquido alantoideano são mais altos que os valores do liquido amniótico (p < 0,05). As concentrações dos íons Cloreto e Sódio apresentaram–se mais elevados (p < 0,05) no liquido amniótico. As concentrações dos íons Cálcio e Potássio foram mais elevadas nos líquidos alantoideanos (p<0,05). A eletroforese identificou duas bandas protéicas que podem ser a alfa-fetoproteína, ela parece aumentar a concentração durante o período gestacional. Porém, faltam estudos na espécie eqüina para a comparação dos resultados do presente trabalho. / Fetal fluids play a vital role in the development of the fetus. The biochemical composition of the amniotic fluid along pregnancy in horses had not been described until this present study. Sixty samples of fetal fluids were collected and the concentrations of Alkaline Phosphatase (FA), Glucose, Total Proteins (PT), Urea, Creatinin, Calcium (Ca), Chloride (Cl), Sodium (Na) and Potassium (K) along pregnancy were determined using commercially available kits. The levels of alpha-fetoprotein (AFT) were measured by polyacrylamide gel electrophoresis. During the three stages of pregnancy the concentrations of FA in the amniotic fluid were higher than those determined in the allantoic fluid (p < 0,05). The glucose levels did not differ between the fluids (p < 0,05). The mean values for the concentrations of PT were higher in the amniotic fluid than in the allantoic (p < 0,05). The urea levels differ among the pregnancy stages, but there were no differences in the mean values of urea (p > 0,05) between the two fluids. The concentrations of creatinin obtained in the allantoic fluid were higher than those obtained in the amniotic fluid (p < 0,05). The concentrations of Cl and Na were elevated (p < 0,05) in the amniotic fluid. The levels of the ions Ca e K were higher in the allantoic fluid (p<0,05). Polyacrylamide gel electrophoresis identified two protein bands that could be alpha-fetoprotein, which appears to have its concentration increased during pregnancy. There is a need for more studies in the biochemical composition of fetal fluids in horses to compare the results obtained in this study.

Orientador: Nereu Carlos Prestes / Banca: Fernada da Cruz Landim-Alvarenga / Banca: Regina Kiomi Takahira / Banca: Wilter Ricardo Russiano Vicente / Banca: Mara Regina S. Balarin / Resumo: Os líquidos fetais possuem diversas funções que são vitais para o feto. Para a espécie eqüina até o presente momento, não está totalmente definida a composição bioquímica do líquido amniótico no decorrer da gestação. O presente trabalho teve como objetivo verificar a composição bioquímica do liquido amniótico e alantoideano das éguas em diferentes fases da gestação. Para isso analisou-se 60 amostras de fluidos fetais, empregando-se kits comerciais para se determinar a concentração bioquímica da Fosfatase Alcalina, Glicose, Proteínas Totais, Uréia, Creatinina, Cálcio, Cloreto, Sódio e Potássio durante a gestação. A concentração da alfa-fetoproteína foi avaliada empregando-se a eletroforese em gel de poliacrilamida. A concentração da Fosfatase Alcalina no liquido amniótico foi maior quando comparada ao liquido alantoideano nas três fases da gestação (p < 0,05). Para a glicose o valor médio entre os dois fluidos não apresentou variações (p < 0,05). Para a Proteína total o valor médio do liquido amniótico foi maior que o alantoideano (p < 0,05). A Uréia sofreu variações na concentração entre as fases, mas não há diferenças dos valores médios (p > 0,05) entre os fluidos. Para a Creatinina os valores presentes no liquido alantoideano são mais altos que os valores do liquido amniótico (p < 0,05). As concentrações dos íons Cloreto e Sódio apresentaram-se mais elevados (p < 0,05) no liquido amniótico. As concentrações dos íons Cálcio e Potássio foram mais elevadas nos líquidos alantoideanos (p<0,05). A eletroforese identificou duas bandas protéicas que podem ser a alfa-fetoproteína, ela parece aumentar a concentração durante o período gestacional. Porém, faltam estudos na espécie eqüina para a comparação dos resultados do presente trabalho. / Abstract: Fetal fluids play a vital role in the development of the fetus. The biochemical composition of the amniotic fluid along pregnancy in horses had not been described until this present study. Sixty samples of fetal fluids were collected and the concentrations of Alkaline Phosphatase (FA), Glucose, Total Proteins (PT), Urea, Creatinin, Calcium (Ca), Chloride (Cl), Sodium (Na) and Potassium (K) along pregnancy were determined using commercially available kits. The levels of alpha-fetoprotein (AFT) were measured by polyacrylamide gel electrophoresis. During the three stages of pregnancy the concentrations of FA in the amniotic fluid were higher than those determined in the allantoic fluid (p < 0,05). The glucose levels did not differ between the fluids (p < 0,05). The mean values for the concentrations of PT were higher in the amniotic fluid than in the allantoic (p < 0,05). The urea levels differ among the pregnancy stages, but there were no differences in the mean values of urea (p > 0,05) between the two fluids. The concentrations of creatinin obtained in the allantoic fluid were higher than those obtained in the amniotic fluid (p < 0,05). The concentrations of Cl and Na were elevated (p < 0,05) in the amniotic fluid. The levels of the ions Ca e K were higher in the allantoic fluid (p<0,05). Polyacrylamide gel electrophoresis identified two protein bands that could be alpha-fetoprotein, which appears to have its concentration increased during pregnancy. There is a need for more studies in the biochemical composition of fetal fluids in horses to compare the results obtained in this study. / Doutor

Câncer é a denominação de um conjunto de mais de cem doenças causadas pelo crescimento e multiplicação desordenados de células anormais capazes de invadir e se disseminar por diversos tecidos e órgãos. É considerado um problema de saúde mundial, sendo uma das maiores causas de morte. Dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) indicam que 15% das mortes no mundo serão causadas por câncer em 2015. No Brasil, o Instituto Nacional do Câncer (INCA) estima 580 mil novos casos da doença para 2014. Apesar da vasta quimioterapia disponível, os tratamentos possuem alta toxicidade e estão sujeitos à resistência. Nesse contexto, a presente dissertação de mestrado tem como foco principal a identificação e caracterização de novos compostos com propriedades anticâncer. Os estudos foram realizados com base em dois alvos principais. O primeiro foi a proteína tubulina, um alvo anticâncer validado que é modulado por moléculas importantes como o taxol, a vimblastina e a colchicina. O segundo alvo foi a migração celular, característica relacionada ao processo de metástase, que é responsável por 90% das mortes por câncer. Uma série de acridinonas sintéticas foi avaliada in silico frente à proteína tubulina empregando métodos de modelagem molecular. Para tanto, fez-se uso de estruturas cristalográficas da proteína disponíveis no PDB (Protein Data Bank). Os resultados das análises de docagem molecular indicaram que as moléculas poderiam interagir com o sítio da colchicina e, dessa forma, atuariam como inibidoras da polimerização dos microtúbulos. Ensaios wound healing e em câmara de Boyden permitiram a identificação de quatro compostos com potente efeito de inibição da migração celular (valores de IC50 variando entre 0,294 e 1,7 &mu;M) em uma linhagem metastática (MDA-MB-231). Estes compostos foram submetidos a ensaios de citotoxicidade frente à mesma linhagem tumoral e também apresentaram boa potência, com valores de IC50 variando entre 0,110 e 3 &mu;M. Além disso, ensaios de citotoxicidade em células saudáveis mostraram que estes compostos inviabilizaram seletivamente células tumorais. Para a validação dos estudos in silico, ensaios de polimerização da tubulina foram conduzidos. Os resultados mostraram que as quatro moléculas ativas nos ensaios celulares atuam como inibidores de polimerização dos microtúbulos, com valores de IC50 variando entre 0,9 e 13 &mu;M. Estudos das relações entre a estrutura e atividade (SAR) revelaram alguns aspectos interessantes nesta série de acridinonas, como, por exemplo, a perda de atividade, que se deu tanto nos ensaios celulares quanto nos ensaios bioquímicos, causada pela substituição de um grupo nitro da posição meta- por para- em duas moléculas da série. A progressão do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo e os resultados mostraram que os compostos estudados são capazes de interromper o ciclo celular entre as fases G2 e M. A citometria fluxo também permitiu verificar a indução da apoptose celular devida à ação das moléculas. Em resumo, este trabalho possibilitou a identificação e caracterização de quatro compostos com propriedades antitumorais promissoras que serão utilizados como compostos líderes para posterior desenvolvimento como agentes anticâncer. / Cancer is a set of diseases with high diversity and aggressiveness. It is one of the major causes of death according to the World Health Organization (WHO), being responsible for 15% of worldwide deaths in 2015. In Brazil, the National Institute of Cancer (INCA) estimates 580,000 new cases of cancer for the year of 2014. Despite the vast availability of cancer chemotherapy, the treatments cause high toxic effects and are liable to resistance. In this context, the main goal of the present master\'s dissertation is the identification and the characterization of new compounds having anticancer properties. These studies were conducted based on two main targets. The first one was the protein tubulin, a validated anticancer target that is modulated by important molecules such as taxol, vinblastine and colchicine. The second target was the cellular migration, a feature related to the metastasis process, which causes 90% of the cancer deaths. A series of synthetic acridinones was studied in silico employing molecular modeling methods. For this, crystallographic structures of tubulin were collected from PDB (Protein Data Bank). The docking results indicated that the molecules could interact with the colchicine site and, thereby, could act as tubulin polymerization inhibitors. The series was assessed by the wound healing and Boyden chamber\'s assays using the metastatic cell line MDA-MB-231. In these assays, four compounds were identified as good inhibitors of cellular migration (IC50 values varying between 0.294 and 1.7 &mu;M). These compounds were evaluated in cytotoxicity assays using the same cell line and presented good potency, with IC50 values varying between 0.110 and 3 &mu;M. Furthermore, cytotoxicity assays using a healthy cell line showed that these compounds act selectively in tumor cells. For the validation of the in silico studies, tubulin polymerization assays were conducted. The results showed that the four active molecules in the cellular assays act as tubulin polymerization inhibitors, with IC50 values varying between 0.9 and 13 &mu;M. Structure-activity relationship (SAR) studies revealed interesting structural aspects in this series of acridinones, for instance, the exchange of the nitro group substituent from the meta- to the para- position in two molecules of the series led to a lack of activity in both cellular and biochemical assays. The cell cycle progression was evaluated by flow cytometry, and the results showed that the four compounds are capable of arrest cells in the G2/M phase. Moreover, the apoptosis induction was verified using flow cytometry. In summary, this work provided the identification and characterization of four new compounds with promising antitumor properties. These molecules will be used as lead compounds for further development as anticancer agents.

Câncer é a denominação de um conjunto de mais de cem doenças causadas pelo crescimento e multiplicação desordenados de células anormais capazes de invadir e se disseminar por diversos tecidos e órgãos. É considerado um problema de saúde mundial, sendo uma das maiores causas de morte. Dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) indicam que 15% das mortes no mundo serão causadas por câncer em 2015. No Brasil, o Instituto Nacional do Câncer (INCA) estima 580 mil novos casos da doença para 2014. Apesar da vasta quimioterapia disponível, os tratamentos possuem alta toxicidade e estão sujeitos à resistência. Nesse contexto, a presente dissertação de mestrado tem como foco principal a identificação e caracterização de novos compostos com propriedades anticâncer. Os estudos foram realizados com base em dois alvos principais. O primeiro foi a proteína tubulina, um alvo anticâncer validado que é modulado por moléculas importantes como o taxol, a vimblastina e a colchicina. O segundo alvo foi a migração celular, característica relacionada ao processo de metástase, que é responsável por 90% das mortes por câncer. Uma série de acridinonas sintéticas foi avaliada in silico frente à proteína tubulina empregando métodos de modelagem molecular. Para tanto, fez-se uso de estruturas cristalográficas da proteína disponíveis no PDB (Protein Data Bank). Os resultados das análises de docagem molecular indicaram que as moléculas poderiam interagir com o sítio da colchicina e, dessa forma, atuariam como inibidoras da polimerização dos microtúbulos. Ensaios wound healing e em câmara de Boyden permitiram a identificação de quatro compostos com potente efeito de inibição da migração celular (valores de IC50 variando entre 0,294 e 1,7 &mu;M) em uma linhagem metastática (MDA-MB-231). Estes compostos foram submetidos a ensaios de citotoxicidade frente à mesma linhagem tumoral e também apresentaram boa potência, com valores de IC50 variando entre 0,110 e 3 &mu;M. Além disso, ensaios de citotoxicidade em células saudáveis mostraram que estes compostos inviabilizaram seletivamente células tumorais. Para a validação dos estudos in silico, ensaios de polimerização da tubulina foram conduzidos. Os resultados mostraram que as quatro moléculas ativas nos ensaios celulares atuam como inibidores de polimerização dos microtúbulos, com valores de IC50 variando entre 0,9 e 13 &mu;M. Estudos das relações entre a estrutura e atividade (SAR) revelaram alguns aspectos interessantes nesta série de acridinonas, como, por exemplo, a perda de atividade, que se deu tanto nos ensaios celulares quanto nos ensaios bioquímicos, causada pela substituição de um grupo nitro da posição meta- por para- em duas moléculas da série. A progressão do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo e os resultados mostraram que os compostos estudados são capazes de interromper o ciclo celular entre as fases G2 e M. A citometria fluxo também permitiu verificar a indução da apoptose celular devida à ação das moléculas. Em resumo, este trabalho possibilitou a identificação e caracterização de quatro compostos com propriedades antitumorais promissoras que serão utilizados como compostos líderes para posterior desenvolvimento como agentes anticâncer. / Cancer is a set of diseases with high diversity and aggressiveness. It is one of the major causes of death according to the World Health Organization (WHO), being responsible for 15% of worldwide deaths in 2015. In Brazil, the National Institute of Cancer (INCA) estimates 580,000 new cases of cancer for the year of 2014. Despite the vast availability of cancer chemotherapy, the treatments cause high toxic effects and are liable to resistance. In this context, the main goal of the present master\'s dissertation is the identification and the characterization of new compounds having anticancer properties. These studies were conducted based on two main targets. The first one was the protein tubulin, a validated anticancer target that is modulated by important molecules such as taxol, vinblastine and colchicine. The second target was the cellular migration, a feature related to the metastasis process, which causes 90% of the cancer deaths. A series of synthetic acridinones was studied in silico employing molecular modeling methods. For this, crystallographic structures of tubulin were collected from PDB (Protein Data Bank). The docking results indicated that the molecules could interact with the colchicine site and, thereby, could act as tubulin polymerization inhibitors. The series was assessed by the wound healing and Boyden chamber\'s assays using the metastatic cell line MDA-MB-231. In these assays, four compounds were identified as good inhibitors of cellular migration (IC50 values varying between 0.294 and 1.7 &mu;M). These compounds were evaluated in cytotoxicity assays using the same cell line and presented good potency, with IC50 values varying between 0.110 and 3 &mu;M. Furthermore, cytotoxicity assays using a healthy cell line showed that these compounds act selectively in tumor cells. For the validation of the in silico studies, tubulin polymerization assays were conducted. The results showed that the four active molecules in the cellular assays act as tubulin polymerization inhibitors, with IC50 values varying between 0.9 and 13 &mu;M. Structure-activity relationship (SAR) studies revealed interesting structural aspects in this series of acridinones, for instance, the exchange of the nitro group substituent from the meta- to the para- position in two molecules of the series led to a lack of activity in both cellular and biochemical assays. The cell cycle progression was evaluated by flow cytometry, and the results showed that the four compounds are capable of arrest cells in the G2/M phase. Moreover, the apoptosis induction was verified using flow cytometry. In summary, this work provided the identification and characterization of four new compounds with promising antitumor properties. These molecules will be used as lead compounds for further development as anticancer agents.

Reversible Phosphorylierung ist die bekannteste posttranslationale Modifikation (PTM) und die O-Phosphomonoester von Serin, Threonin und Tyrosin galten lange als die einzigen relevanten Vertreter. Vor kurzem wurden erste Erkenntnisse über die biologische Relevanz von labilen Phosphorylierungen veröffentlicht, z.B. die Phosphorylierung von Histidin, Arginin und Cystein sowie die Pyrophosphorylierung von Serin und Threonin. Auch die Aufklärung von Phospho-Lysin (pLys) wurde mit der Etablierung einer chemoselektiven Synthese zur Darstellung ortsselektiv phosphorylierter Lysinpeptide und der Entwicklung massenspektrometrischer Protokolle zur eindeutigen pLys-Identifizierung in Angriff genommen. Dennoch wurde bisher kein endogenes pLys beschrieben oder eingehende Untersuchungen mit interagierenden Enzymen durchgeführt. In dieser Arbeit werden mehrere Ansätze zur Erweiterung des Wissens über pLys vorgestellt. Dazu gehören das Design einer alternativen Syntheseroute zu pLys-Peptiden und die Entwicklung sowie Evaluierung von zwei stabilen Analoga als Bausteine für die Peptidsynthese. Weiterhin wurde die Protonierung des Phosphoramidatstickstoffs untersucht. In systematischen Enzymaktivitätsassays wurden die Wechselwirkungen zwischen Phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase (LHPP) und verschiedenen Phospho-Substraten untersucht. Dabei zeigte sich eine ausgeprägte Selektivität für pLys, eine hohe Sequenzabhängigkeit der LHPP-Aktivität und ein klares Bindungsmotiv. Darüber hinaus wurden proteomische Methoden hinsichtlich ihrer Eignung für pLys-Peptide evaluiert. Im Laufe dieser Untersuchung wurden mehrere pLys-Immunogene für die Generierung von monoklonalen anti-pLys-Antikörpern und ein Workflow für die Histontrennung und -analyse entwickelt. Des Weiteren wurde die chelationsverstärkte Fluoreszenz von markierten Phospho-Peptiden als Werkzeug zur Bestimmung des Phosphorylierungsgrades in Enzymaktivitäts- oder Stabilitätsassays untersucht. / Reversible phosphorylation is the most prominent post-translational modification (PTM) and the O-phosphomonoesters of serine, threonine and tyrosine have been considered as the only notable forms for long time. Recent developments have paved the way to insights into the biological relevance of labile phosphorylations, e.g. phosphorylation of histidine, arginine and cysteine as well as pyrophosphorylation of serine and threonine. Also, the elucidation of phospho-lysine (pLys) was tackled with the establishment of a chemoselective synthesis to obtain site-selectively phosphorylated lysine peptides and the development of mass spectrometric protocols to unambiguously identify modification sites. Nonetheless, no endogenous pLys site has been described or in-depth investigations of interacting enzymes have been conducted. In this thesis, several approaches to enhance the knowledge about pLys are introduced. These include the design of an alternative synthesis route to pLys peptides and the development as well as evaluation of two stable analogues as building blocks for peptide synthesis. Furthermore, the protonation of the phosphoramidate-nitrogen was investigated. In systematic phosphoramidate hydrolase and phosphatase activity assays, the interactions between phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase (LHPP) and various phospho-substrates were examined. Thereby, distinct selectivity for pLys, high sequence dependence of LHPP activity and a distinct binding motif were revealed. In addition to that, proteomic methods were evaluated regarding their suitability for pLys peptides. Over the course of this investigation, several pLys immunogens for the generation of monoclonal anti-pLys antibodies and a workflow for histone separation and analysis were developed. Furthermore, chelation-enhanced fluorescence of labeled phospho-peptides was studied as a tool for determining the degree of phosphorylation in enzyme activity or stability assays.