Le laboratoire de Chimie Organique et Photochimie de l’ULB s’est intensivement impliqué dans la recherche portant sur le développement et l’étude de complexes polyazaaromatiques de ruthéniumII. En utilisant des ligands π-déficients tels que le 1,4,5,8-tétraazaphénanthrène (TAP) chélatés au centre métallique de RuII, des propriétés d’oxydo-réduction particulières à l’état excité du complexe peuvent être obtenues. Cette recherche s’est principalement focalisée sur l’étude de complexes de RuII photoréactifs dans un cadre biologique puisque ces complexes sont capables de photoréagir avec le matériel génétique ou les protéines par l’intermédiaire d’un transfert d’électron photo-induit (PET). Cependant, il existe un obstacle majeur à l’utilisation thérapeutique des complexes polyazaaromatiques de RuII, à savoir leur incapacité à traverser d’eux-mêmes la membrane des cellules vivantes. Ce projet vise à développer une stratégie ciblée de vectorisation de ces complexes, ce qui pourrait permet d’administrer l’agent thérapeutique uniquement aux cellules « malades ». Le ciblage de récepteurs surexprimés par les cellules endothéliales néo-formées, tels que l’intégrine αvβ3, a été envisagé dans le cadre de ce travail grâce à un ligand peptidique c(RGDfK). Ce ciblage associé à l’utilisation d’un complexe photoréactif de RuII permettrait un contrôle du type cellulaire, par la reconnaissance des intégrines αvβ3, ainsi qu’un contrôle temporel de l’activité thérapeutique du complexe, par l’illumination. De manière à combiner ces agents de ciblage et l’agent thérapeutique (complexe de RuII), des plateformes moléculaires de deux types ont été utilisées et comparées entre elles, à savoir le cyclodécapeptide RAFT et un calix[4]arène. La synthèse des conjugués RuII-RAFT-[c-(RGDfK)]4 et le RuII-calix[4]arène-[c-(RGDfK)]4 a donc été réalisée avec succès et leurs propriétés photophysiques et photochimiques ont été étudiées de manière à vérifier que la présence de la plateforme ne modifie pas les propriétés des complexes de RuII ancrés. Enfin, la pénétration des conjugués a également été évaluée et ce, sur différentes lignées cellulaires, de manière à mettre en évidence la spécificité du ciblage pour les récepteurs membranaires αvβ3. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

[French below]TLRs are the sentinels of our cells, they are located at the cell surface and alert the whole immune system of the presence of viruses or bacteria. They detect pathogens by recognizing their molecular patterns; this recognition is specific in order to avoid self-recognition, but they need some degree of promiscuity to remedy to pathogen heterogeneity or mutations. Promiscuity is generally defined as an indiscriminate association with molecules regardless their structure and is the contrary of specificity proper of the classic paradigm of key-lock receptor activation. My thesis results demonstrate that TLR4 and TLR2 are more promiscuous than what was believed and that this promiscuity leads to the recognition of cationic lipids and cardiolipins.Cationic lipids lipopolyamines are synthetic molecules nucleic acid nanocarriers proposed to be used for gene therapy, which consists in replacing a gene that is functioning improperly. This thesis demonstrates that lipopolyamines activate TLR2 by forming conserved and/or alternative H-bonds with TLR residues, simulating the recognition of bacterial lipopeptides and inducing pro-inflammatory cytokines secretion; which is deleterious when we aim to use these nanocarriers in the context of gene therapy. We propose the use of unsaturated cationic lipids to avoid TLR2 recognition. TLR activation could be useful instead to prepare one-component vaccine adjuvants, for which both antigen carrier and TLR activation are needed to turn on the immune system and produce antibodies. The second chapter of this thesis investigates the pro-inflammatory properties of other cationic lipids and describes new lipopolyamines able to activate both TLR2 and TLR4. The study of their adjuvanticity properties showed that they are as efficient as the aluminium salts in stimulating antibodies production.The promiscuity of TLR2 and TLR4 raised questions about the presence of endogenous TLR modulators, often countered by contamination concerns. In the third chapter, we investigate the pro- and anti-inflammatory properties of cardiolipin (CL). CL is a tetra-acylated diphosphatidylglycerol located in the inner mitochondrial membrane. Its fatty acid chain length and degree of unsaturation vary depending on species, tissue and pathological conditions. Here we show that unsaturated cardiolipin acts as a competitive TLR4 antagonist by occupying the binding site of LPS and that unsaturations discriminate between TLR4 antagonistic and agonistic activity. Under physiological conditions, mammalian CL chains are unsaturated, whereas there is an increase of saturated CL in patients affected by the Barth Syndrome. Hence we suggest that unsaturated CL could negatively regulate the inflammation during cell damage or death, via TLR4 inhibition. By contrast, saturated CLs may be involved in the inflammatory state associated with the disease. Finally, our study provides new understandings of the mechanism of TLR4 regulation and extends the library of TLR4 agonists and antagonists to molecules of easier synthesis, lower price and higher biocompatibility compared to LPS-based structures. / Resumé en français Les récepteurs Toll-like (TLRs) sont des protéines transmembranaires qui constituent la première barrière de notre système immunitaire inné. Ils détectent la présence de bactéries et virus et alertent l’organisme via la sécrétion de molécules pro-inflammatoires appelés cytokines. Parmi les TLRs, TLR2 and TLR4 reconnaissent respectivement des lipides spécifiques aux bactéries, les lipopeptides et les lipopolysaccharides bactériens LPS. La reconnaissance de motifs moléculaires spécifiques aux pathogènes et absents dans notre organisme est essentiel afin d’éviter une réponse immunitaire venant du soi. Le but de notre thèse était de démontrer que les récepteurs Toll-like possèdent une certaine plasticité et peuvent reconnaître des ligands non identifiés jusqu’ici tels les lipides cationiques et la cardiolipine. Les lipides cationiques sont des molécules synthétiques utilisées comme agents de transfection. Notre travail démontre que les lipides cationiques dont la tête polaire est constituée par des polyamines peuvent mimer les propriétés des ligands naturels et induire la sécrétion de cytokines pro-inflammatoire via l’activation des TLRs. Cette interaction implique des interactions entre la chaine principale de la protéine et les lipides sans intervention des chaines latérales. Cette réaction inflammatoire est contre-indiquée en thérapie génique et nous proposons donc de remplacer les chaines acylées saturées par des chaines insaturées pour la synthèse des nouveaux agents de transfection non-immunogénique. D’autre part, l’activation des TLRs par des agents de transfections active le système immunitaire inné, ce qui permet l’activation du système adaptatif et la production d’anticorps. Nous avons étudié une large gamme des lipides cationiques et identifié des nouveaux activateurs á la fois de TLR2 et de TLR4. L’étude de leurs propriétés adjuvantes a démontré que les lipides cationiques sont des adjuvants comparables aux sels d’aluminium en terme de production d’anticorps. La cardiolipine est un lipide localisé dans la membrane des mitochondries et des bactéries. Le domaine hydrophobe est constitué de quatre chaines acylées qui chez les mammifères sont insaturées. Il a été démontré que la cardiolipine extracellulaire inhibe la sécrétion de cytokines induite par LPS. Notre travail de thèse démontre que cet effet inhibiteur est du à la capacité de la cardiolipine à bloquer le site de liaison du LPS. Le travail démontre aussi que lorsque les chaines acylées sont saturées, c’est le cas dans le Syndrome de Barth, la cardiolipine devient un activateur de TLR4 en interagissant avec TLR4 de façon similaire à LPS. Ce dernier résultat pourrait expliquer l’aspect inflammatoire du Syndrome de Barth et élargie la librairie de ligands de TLR4 á des molécules de structure plus simple et plus aisées à synthétiser que les dérivés de LPS et qui pourraient être utilisés comme adjuvants ou anti-inflammatoires. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

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La régulation des protéines par les modifications post-traductionnelles (PTMs) est un événement clé dans le maintien des fonctions biologiques de la cellule. Parmi elles, on retrouve les modifications causées par une famille de molécules appelées Ubiquitin Like Modifiers (UBls), incluant l’ubiquitination, la neddylation ou encore la SUMOylation. Au contraire des modifications classiques faisant intervenir des petits groupements chimiques, telles que la phosphorylation ou l’acétylation, les UBls sont eux-mêmes des protéines se greffant sur le groupement amine en position e des lysines des protéines ciblées, générant des protéines ramifiées. Alors que la principale fonction de l’ubiquitination est la dégradation des protéines par le protéasome, les autres UBls sont encore mal caractérisées. Dans ce contexte, le but de cette thèse était de développer de nouvelles approches protéomiques afin de définir le rôle de la SUMOylation dans des cellules humaines. En effet, l’identification des sites de SUMOylation par spectrométrie de masse (MS) est un défi. Ceci s’explique par la très faible abondance des protéines SUMOylées dans la cellule ainsi que par la longue chaine de 19 à 34 acides aminés laissés sur la protéine ciblée après digestion à la trypsine. Afin de pallier à ces deux problèmes, un mutant de la protéine SUMO a été généré au sein du laboratoire. La première altération sur ce mutant est l’insertion d’une séquence 6xHis à l’extrémité N-terminale de la protéine afin de faciliter l’enrichissement des protéines SUMOylés. La seconde altération de la protéine SUMO est la mutation d’une glutamine en arginine en position 6 à partir du C-terminal. Cette mutation a pour effet de libérer des peptides trypsiques ramifiés contenant seulement 5 acides aminés provenant de SUMO sur le peptide ciblé. Le premier but de cette thèse était de développer une méthode permettant de cibler spécifiquement les peptides SUMOylés lors d’une analyse par LC-MS. Cette méthode repose sur le patron de fragmentation propre de la chaine de 5 acides aminés commune à tous les peptides SUMOylés et utilise la technologie Sequential Window Acquisition of all THeoretical Mass Spectra (SWATH). Lors d’une telle analyse, l’échantillon est injecté une première fois en fragmentant de larges fenêtres de masses. Ceci permet d’obtenir des spectres MS/MS pour tous les peptides présents dans l’échantillon. Un algorithme est ensuite utilisé afin de détecter les fenêtres de masses contenant des peptides SUMOylés et de recalculer le rapport masse sur charge des peptides candidats. Les injections subséquentes permettent ensuite de fragmenter uniquement les peptides candidats. Cette méthode s’est avérée être complémentaire aux méthodes conventionnelles et a permis l’identification d’un total de 54 peptides SUMOylés à partir d’extraits protéiques enrichis sur billes NiNTA. La seconde approche envisagée était d’ajouter une étape d’enrichissement supplémentaire au niveau peptidique. Pour cela, un anticorps reconnaissant la chaine de 5 acides aminés laissée après digestion tryptique a été produit. Cette étape d’immuno-purification supplémentaire a permis l’identification d’un total de 954 sites de SUMOylation dans des cellules humaines lors d’une analyse à grande échelle. Afin de valider les nouvelles cibles identifiées, une étude fonctionnelle de la SUMOylation de la protéine CDC73 a été réalisée. Cette étude a montré que la SUMOylation de CDC73 était requise pour sa rétention nucléaire, confirmant ainsi un rôle important pour la SUMOylation de cette protéine. Cependant, le principal défaut de la précédente approche était la nécessité de cultiver 500 millions de cellules par condition étudiée. Cette approche a donc été optimisée afin de pouvoir réduire le nombre de cellules utilisées dans une analyse. L’optimisation de chacun des paramètres analytiques nous a permis de réduire ce nombre de 50 fois, permettant ainsi d’identifier plus de 1000 sites de SUMOylation à partir de seulement 10 millions de cellules. De plus, nous avons montré que cette approche permet l’identification concomitante des sites de SUMOylation et d’ubiquitination dans un seul échantillon biologique. Ceci a permis d’identifier un nouveau mécanisme de régulation des deubiquitinases par les UBls, ainsi que d’élucider les mécanismes de translocation du protéasome dans la cellule. Dans l’ensemble, nous avons développé des méthodes permettant de mieux caractériser la SUMOylation des protéines et avons prouvé que ces méthodes sont applicables à l’étude de plusieurs UBls en parallèle. Nous sommes certains que l’approche par immuno-purification permettra à l’avenir d’identifier la SUMOylation à un niveau endogène. / Protein regulation by post-translational modification (PTMs) is a key event in regulating cellular function. These modifications include a group termed Ubiquitin-Like modifiers (UBLs) that contain, but is not limited to, ubiquitylation, neddylation and SUMOylation. While conventional modifications, such as phosphorylation or acetylation, involve a small chemical group, UBLs are proteins attached from their C-terminus to the epsilon amine group of a lysine contained in the targeted protein, thus generating branched proteins. While the main function of ubiquitylation is protein degradation by the proteasome, other UBLs remain mostly unexplored. In this context, the aim of this thesis was to develop new proteomics strategies to characterize SUMOylation in human cells. Indeed, identification of SUMOylation sites by mass spectrometry (MS) is a challenge. This is due to the low abundance of SUMOylated proteins in the cells as well as the long 19 to 34 amino acid SUMO remnant left of the target after trypsin digestion. In this context, our research group has developed a mutant of SUMO containing two mutations. The first mutation consists of a 6xHis tag at the N-terminus of SUMO in order to facilitate SUMOylated substrates enrichment at the protein level. A second mutation was also introduced at the 6th position from the C-terminus and consists in a glutamine to arginine substitution in order to release shorter SUMOylated peptides after trypsin digestion. The first goal of this thesis was to develop a targeted approach to specifically fragment SUMOylated peptides during an LC-MS run. This was enabled by the common fragmentation pattern of all SUMOylated peptides arising from the five amino acid SUMO remnant. Digested peptides were first analyzed using SequentialWindow Acquisition of all THeoretical Mass Spectra (SWATH). In this experiment, large mass windows are fragmented. A custom algorithm is then used that detects mass windows in which candidates are located and determine their intact mass. In subsequent injections these peptides were then specifically targeted. This method was complementary to data dependent acquisition and enabled the identification of 54 SUMOylated peptides. In a second approach, we wanted to enrich for SUMOylated substrates at the peptide level. An antibody was raised against the five amino acid SUMO remnant and used for immunopurification of SUMOylated peptides. In total, we identified 954 SUMOylation sites in human cells. Moreover, functional analysis of the newly identified substrate CDC73 revealed that SUMOylation on K136 is required for its nuclear retention, thus showing a new role for the SUMOylation of this protein. Although this approach gave new insights into the characterization of SUMOylated substrates, high amounts of material were still required to obtain such results. The last goal of this thesis was to optimize the previously developed immunopurification. Systematic optimization of every analytical parameter was done and enabled the reduction of the number of cells required by a factor of 50, without affecting the number of SUMOylation sites identified. Moreover, we used this approach to profile for SUMOylation and ubiquitylation dynamics in human cells upon proteasomal inhibition with MG132. This revealed an unexpected regulation mechanism of deubiquitinating enzymes by UBLs and unraveled translocation mechanisms of the proteasome in the cell. Our SUMO proteomic approach demonstrates capability for the concomitant analysis of SUMOylation and ubiquitylation. In the future, we hope to extend this approach to endogenous SUMOylation.

La première partie de mon travail a consisté (i) en une étude génomique des souches de TOSV avec séquençage de 10 nouvelles souches afin i) d’enrichir les données disponibles dans Genbank (au début de ce travail, 6 séquences complètes); (ii) d’utiliser les 16 séquences complètes pour définir et évaluer le premier système de typage par technique de RT-q PCR en temps réel afin de discriminer les souches de LA et de LB. Dans la deuxième partie de ce projet, on s’est intéressée à des études structurales et fonctionnelles de la nucléoproteine (N) de TOSV afin d’élucider le mécanisme d’encapsidation d’ARN virale. La N est une protéine de 28 KD, sont rôle majeur est l’encapsidation de l’ARN génomique et sert en tant que co-facteur de la transciption/replication de TOSV. Les études crystallographique de la protéine N , du complexe protéique (N-ARN) ont été déterminé par Olal D et al 2014 au moment que nous avons obtenu la diffraction de crystal de la N sans ARN à 3,7 Å (code PDB: 5FVA). Ces études montrent la protéine N ainsi le complexe (N-ARN) en forme d’un anneau hexamèrique fermé alors encapside l'ARN dans une organisation filamenteux. Nous avons donc décidé de combiner ces résultats avec des études structurales complémentaires en solution , telles que la microscopie électronique (EM) et des études de « Diffusion des rayons X aux petits angles »(SAXS) pour de proposer un modèle décrivant correctement le mécanisme d'encapsidation en solution . Le protéine N se comporte principalement en pentamère déformé et ouvert, qui met en lumière la façon dont nucléoprotéine peut être organisée en filaments. / The first part of my work consisted (i) of genomic sequencing of 10 TOSV strains to increase the total number of complete sequences (at the outset, 6 complete sequences were accessible in Genbank). (ii) to use the 16 sequences to design and evaluated the first lineage-specific real-time RT-PCR assay (Lisp-TOSV) to discriminate between strains of lineages A and B Complete sequencing of the 10 strains was achieved. The second part of this project was dedicated for structural and functional studies of the TOSV N protein in order to decipher viral RNA encapsidation. TOSV Nucleoprotein (N) is a protein of 28 KD, is encapsidating the viral RNA genome and serves as a co-factor the RNA trancription/replication. The crystal structures of TOSV N protein , and the complex N-RNA were already determined (Olal D and al; 2014) while we just obtained diffracting crystal of the N free RNA at 3,7 Å (PDB code : 5FVA ). Crystallographic structures show an hexameric rings whereas N encapsidates the RNA in a filamentous organization. We therefore decided to combine these results with complementary studies, such as electron microscopy (EM) and samll angle X-ray scattering to build a low resolution structure model in solution describing properly the encapsidation mechanism. The N behaves mainly as an opened, deformed pentamer that shed light on how the N can be organized in filaments.

Ce travail de thèse vise à étudier l'endommagement de l'ADN, de la formation de lésions à leur réparation par des méthodes de modélisation moléculaire. Plusieurs projets ont pris forme dans ce contexte, lesquels peuvent être classés en trois grandes catégories. D'un côté, nous nous sommes intéressés la formation de lésions induites par des agents mutagènes. Nous avons étudié les mécanismes de formation de la 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8oxoG), mais aussi le caractère de photosensibilisateur endogène de la pyrimidine 6-4 pyrimidone (6-4PP), et la photosensibilisation de l'ADN par deux anti-inflammatoires : le kétoprofène et l'ibuprofène. D'un autre côté, les propriétés mécaniques de l'ADN endommagé ont été simulées. La structure de lésions complexes est d'une importance capitale pour comprendre la manière dont elles sont réparées. Malheureusement, seulement peu de structures RMN et cristallographiques sont disponibles à ce jour. Pour pallier à ce manque et obtenir des informations sur leur dynamique, nous avons étudié un panel de lésions complexes : les clusters de sites abasiques, les pontages inter-brins, et la photolésion 6-4PP. De même, nous nous sommes penchés sur les modes d'interaction de certaines polyamines avec l'ADN, ces molécules étant connues pour interagir avec la double hélice. Enfin, latroisième partie de cette thèse concerne les interactions ADN-enzyme de réparation. En perspective avec l'étude de clusters d'abasiques, nous avons étudié le comportement dynamique du même système, cette fois-ci en interaction avec l'endonucléase APE1. Nous nous sommes également penchés sur les interactions entre la glycosylase Fpg avec un oligonucléotide contenant un tandem de lésions 8-oxoG d'un côté, etun cluster de lésions 8-oxoG - site abasique de l'autre. Ces multiples projets ont permis l'accumulation de nouvelles connaissances à propos des lésions complexes de l'ADN, et ont également apporté un appuicomputationnel aux expérimentations, qui peuvent se révéler très délicates dans ce domaine. Nos résultats ouvrent de larges perspectives dans le domaine de la pharmacologie, la cosmétique et plus généralementla compréhension du vivant / This thesis work is focused on the theoretical modelling of DNA damages, from formation to repair. Several projects have been led in this framework, which can be sorted into three different parts. One on hand, we studied complex DNA reactivity. It included a study about 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8oxoG) mechanisms of formation, a project concerning the UV-induced pyrimidine 6-4 pyrimidone (6-4PP) endogenous photosensitizer features, and an other one about DNA photosensitizationby nonsteroidal anti-inflammatory drugs (ie ketoprofen and ibuprofen). On the other hand, we investigated mechanical properties of damaged DNA. The structural signature of a DNA lesion is of major importance for their repair, unfortunately only few NMR and X-ray structures of such systems are available. In order to gain insights into their dynamical structure, we investigated a series of complex damages : clustered abasic sites, interstrand cross-links, and the 6-4PP photolesion. Likewise, we studied the interaction modes DNA with several polyamines, which are well known to interact with the double helix, but also with the perspective to model DNA-protein cross-linking. The third part concerned the study of DNA interactions with repair enzymes. In line with the structural study about clustered abasic sites, we investigated the dynamics of the same system, but this time interacting with the APE1 endonuclease. We also studied interactions between the Fpg glycosylase with an oligonucleotides containing tandem 8-oxoG on one hand and 8-oxoG - abasic site as multiply damaged sites. Thus, we shed new lights on damaged DNA reactivity, structure and repair, which provides perspectives for biomedicine and life's mechanisms understanding as we begin to describe nucleosomal DNA

Le récepteur au goût sucré est un hétérodimère composé des sous-unités T1R2 et T1R3, alors que les sous-unités T1R1 et T1R3 s’assemblent pour composer le récepteur au goût umami. Chacune de ces sous-unités appartient à la classe C des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Les membres de cette famille partagent une architecture commune, constituée d’un domaine N-terminal (DNT) qui est relié à un domaine transmembranaire par une région riche en cystéines. Le DNT est constitué de deux lobes qui forment le site orthostérique, qui est le site de liaison des principaux agonistes. Il a été montré que les DNT de T1R1 (DNT-T1R1) est capable de lier le L-glutamate alors que le DNT de T1R2 (DNT-T1R2) est capable de lier les sucres naturels et certains édulcorants (Zhang et al., 2008 ; Nie et al., 2005). Cependant les mécanismes moléculaires de détections des molécules sapides au niveau de ces domaines restent encore largement méconnus. Lors de cette étude, nous avons exprimé les DNT-T1R1, DNT-T1R2 humains et le DNT-T1R1 de souris à l’aide de la bactérie Escherichia coli, sous forme de protéines insolubles, appelés corps d’inclusion (CI). Les CI ont été purifiés puis solubilisés en utilisant un agent chaotrope. Ensuite, les protéines ont été repliées in vitro puis caractérisées par différentes approches parmi lesquelles l’électrophorèse, la filtration sur gel, la fluorescence et le dichroïsme circulaire. Leur fonctionnalité a ensuite été vérifiée par microcalorimétrie de titration isotherme. Nous avons montré que les protéines sont fonctionnelles et présentent des affinités en accord avec les données sensorielles. Les grandes quantités de protéines produites permettront de futures études structurales par cristallographie. Parallèlement à ce travail, nous avons étudié un polypeptide végétal, inhibiteur des goûts sucré et umami chez les rongeurs, appelé gurmarine. Afin de pouvoir étudier son interaction avec les DNT des récepteurs gustatifs de souris, nous avons mis au point l’expression et la purification de gurmarine recombinante produite en levure Pichia pastoris. Ce système d’expression a permis la production de quantités importantes de gurmarine dont les caractéristiques structurales ont été vérifiées par dichroïsme circulaire et résonnance magnétique nucléaire. Nous avons aussi, par mutagénèse dirigée, modifié différents acides aminés décrits comme étant potentiellement impliqués dans l’interaction avec les récepteurs aux goûts sucré et umami. En collaboration, l’activité de la gurmarine a été confirmée à l’aide d’un test cellulaire basé sur l’expression fonctionnelle du récepteur de rat T1R2/T1R3. A l’aide de différentes combinaisons des sous-unités humaines et de rongeurs, nous avons montré que l’inhibition par la gurmarine nécessitait la présence de la sous-unité T1R3 de rat. / The sweet taste receptor is a heterodimer composed of two subunits called T1R2 and T1R3 whereas the T1R1 and the T1R3 subunits form a heterodimeric receptor for umami taste (the savory taste of monosodium glutamate). Each subunit belongs to the class C of G protein-coupled receptors (GPCRs) and is constituted by a large extracellular N-terminal domain (NTD) linked to the transmembrane domain by a cysteine-rich region. The NTD is composed of two lobes separated by a cleft in which ligands bind. T1R1- and T1R2-NTDs are able to bind sweeteners and umami compounds respectively and undergo ligand-dependent conformational changes (Zhang et al., 2008; Nie et al., 2005). However, the relative contribution of the two subunits to the heterodimeric receptor function remains largely unknown. To study the binding specificity of each subunit, a large amount of purified NTDs is suitable for biochemical and structural studies. To accomplish this goal, we expressed T1R1- and T1R2-NTD in high level in Escherichia coli as insoluble aggregated proteins (inclusion bodies). The proteins were solubilized and in vitro refolded using suitable buffer and additives. The soluble proteins were then purified and characterized using electrophoresis, gel filtration, fluorescence spectroscopy and circular dichroism. The functionality of T1R1- and T1R2-NTD was measured the using isothermal microcalorimetry. Our data showed that the proteins are properly refolded and able to bind sweet or umami compounds with physiological relevant affinities. In summary, our expression system will allow large-scale production of active T1R1- and T1R2-NTD suitable for structural and functional studies. In addition to this work, we have studied a 35 residue polypeptide named gurmarin, well known to selectively inhibit responses to sweet substances without affecting responses to other basic taste stimuli, such as NaCl, HCl, and quinine in rodents. To further understand the structural basis of gurmarin recognition by T1R2-T1R3 receptor, we developed for the first time the heterologous expression of gurmarin using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. This system allowed the expression of large quantities of recombinant gurmarin. The structural properties of gurmarin were checked by circular dichroism and nuclear magnetic resonance. We generated six mutants with single amino acids substitutions in the putative site of interaction between gurmarin and the rodent sweet taste receptor, using site-directed mutagenesis. In collaboration, the biological activity of was confirmed using a cell-based assay based on expression of rat T1R2-T1R3. Thanks to various combinations of human and rat T1R2-T1R3 chimeras, we showed that NTD of rat T1R3 is the major determinant of gurmarin’s inhibition.

Le paludisme est causé par l'infection et la destruction des érythrocytes par les parasites protozoaires appartenant au genre Plasmodium. Au cours de son développement dans l'érythrocyte,Plasmodium falciparum requiert la biosynthèse massive de membranes dont les principaux constituants lipidiques sont des phospholipides. La phosphatidylcholine (PC) et la phosphatidyléthanolamine (PE) représentent à elles deux environ 80 % des lipides membranaires et l'inhibition de leur biosynthèse est létale pour le parasite. La PC et la PE sont synthétisées par le parasite, principalement via les voies de novo dépendantes de la CDP-choline et de la CDP-éthanolamine (ou voies de Kennedy) en utilisant respectivement la choline et l'éthanolamine comme précurseurs. Ces travaux de thèse se focalisent sur les deux enzymes CTP:phosphocholine etCTP:phosphoéthanolamine cytidylyltransférase (PfCCT et PfECT, respectivement), catalysant les étapes limitantes des voies de Kennedy. Chez Plasmodium, les CCT et ECT possèdent deux domaines cytidylyltransférases (CT) portant l'activité catalytique, séparés par une longue région de liaison. Pour la CCT, cette duplication est retrouvée seulement chez trois organismes, tous faisant partie du phylumdes Apicomplexes : Babesia, Theileria et Plasmodium, alors que la présence de deux domaines CT estune caractéristique retrouvée chez toutes les ECT étudiées à ce jour. La première partie de ce travail de thèse concerne la caractérisation biochimique et l'inhibition la PfCCT Nous avons montré que les deux domaines CT de la PfCCT sont actifs à l'inverse de la PfECT pour laquelle seul le domaine CTN-terminal est catalytiquement actif. A la suite d'un criblage virtuel basé sur la structure de l'enzyme,nous avons identifié un composé princeps capable d'inhiber l'activité de la PfCCT in vitro, la synthèse de PC et la croissance parasitaire. Ce premier composé actif (haut µM) représente une base pour l'optimisation future de nouveaux composés plus efficaces. Dans la deuxième partie de cette thèse,nous avons déterminé le mécanisme catalytique, la spécificité de liaison des ligands et l'organisation structurale de la PfECT grâce à la combinaison d'approches biochimiques et biophysiques. L'ensemble des résultats présentés dans ce manuscrit apportent un éclairage important concernant le fonctionnement de ces deux cibles potentielles et constituent des étapes essentielles à l'élaboration d'une approche thérapeutique. / Malaria is caused by the infection and destruction of red blood cells by protozoan parasitesbelonging to the genus Plasmodium. During its intra-erythrocytic development, Plasmodiumfalciparum requires massive biosynthesis of membranes which are mainly composed of phospholipids.Phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE) together represent about 80% of thetotal membrane lipids and inhibition of their biosynthesis leads to parasite death. PC and PE aresynthesized by the parasite's machinery mainly through the de novo CDP-choline and CDPethanolamine(Kennedy) pathways using respectively choline and ethanolamine as precursors. Thisstudy focuses on the rate limiting steps of these pathways catalyzed by CTP:phosphocholine andCTP:phosphoethanolamine cytidylytransferases (PfCCT and PfECT, respectively). In Plasmodiumspecies, both CCT and ECT contain two catalytic cores (CT domains) separated by a long linker.Interestingly, for CCT this feature is found only in three organisms, all from the phylum ofApicomplexa: Babesia, Theileria and Plasmodium, whereas the presence of two CT domains is ageneral feature in all ECTs known so far. The first part of this work consists in the biochemicalcharacterization of PfCCT and the investigation of its druggability. We showed that both PfCCT CTdomains are active and display similar kinetic parameters while only the N-terminal CT domain wasactive in PfECT. Subsequent to an in silico structure-based screening of compounds libraries, weidentified a PfCCT inhibitor able to inhibit PC synthesis as well as P. falciparum growth in vitro in thehigh µM range. This compound represents a first step toward the optimization of future more potentcompounds. In the second part of this study, we investigated the catalytic mechanism of PfECT anddeciphered its interactions with its ligands using biochemical, biophysical and structural approaches.Collectively, these results bring new insights into the biochemical and structural properties of thesetwo keys enzymes of the phospholipid metabolism in P. falciparum and pave the way for their futuredevelopment as potential drug target.

While ammonium is an excellent nitrogen source for microorganisms and plants, it is known as acytotoxic metabolite and for its critical role in acid/base homeostasis in animals. Ammonium transportinside the cells is ensured by proteins of the Mep-Amt-Rh superfamily, which are conserved frombacteria to humans.The main objective of the thesis is to refine the understanding of the regulation of the three ammoniumtransport proteins Mep1, Mep2 and Mep3 from Saccharomyces cerevisiae. The three Mep proteins areregulated by the Npr1 kinase and the conserved TORC1 signaling pathway. While the activity of Mep2is regulated by phosphorylation of the C-terminal 457 serine, the activity of Mep1 and Mep3 is inhibitedby the factor Amu1 / Par32. In the presence of a poor nitrogen source, Npr1 induces phosphorylation ofAmu1 which appears mainly cytosolic and, Mep1 and Mep3 are active. On the other hand, in thepresence of a good nitrogen source, the activity of TORC1 induces the inhibition of Npr1 and thereforethe dephosphorylation of Amu1 which accumulates at the cell surface and inactivates Mep1 and Mep3.In order to further study the regulation of Mep1 / 3, a genetic screen was performed to isolate suppressorsrecovering Mep1-dependent ammonium transport in the absence of Npr1. Several mutations, insertionsand deletions have been identified in the MEP1 and AMU1 genes allowing Mep1 to be activeindependently of Npr1. This work shows that all the point mutations in Mep1 delimit an area at theinterface between the hydrophobic body of Mep1 and the cytosol, and that part of the C-terminus (CTR)is required for optimal activity of Mep1 but appears dispensable for regulation by Amu1 and Npr1. Thegenetic screen also shows that the last 15 amino acids of Amu1 are required to inactivate Mep1. Finally,the isolation of suppressors showing no mutation in MEP1 and AMU1 could reveal new factors involvedin the control of Mep1.The results indicate that Mep1 is inactivated in the presence of glutamine, a good source of nitrogen,and that this inactivation requires Amu1. The glutamine-dependent inactivation of Mep2 was alsostudied in this manuscript. Mass spectrometry analysis revealed putative phosphorylation sites in CTRspecific to the presence or absence of glutamine.This work also addressed the role of Amu1 in the reactivation function of TORC1 after treatment withrapamycin, in particular by confirming that it requires the function of Mep1/3. The study leads to thehypothesis that the transport mechanism specific to Mep1 and Mep3 and different from Mep2 isinvolved in this function.Finally, in order to better understand the mechanisms of regulation and transport of Mep-Amt-Rhproteins, the experimental determination of the three-dimensional structure of different variants ofMep2, in open or closed conformation, and of Mep1 was undertaken. Throughout this work, thecharacterized Mep1 or Mep2 variants were analyzed in silico by using the available three-dimensionalstructures. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La phospholipase D (PLD) hydrolyse la phosphatidylcholine des membranes cellulaires, libérant le messager acide phosphatidique. La capacité de la PLD à influer sur la voie de signalisation de mTOR, acteur central dans le contrôle du tissu musculaire, nous a incités à étudier son rôle dans ce tissu. Mes travaux de thèse ont pour but d'étudier les mécanismes par lesquels la PLD intervient dans la différenciation myogénique et dans la régulation de la masse musculaire. Dans un premier temps, nous avons montré que le contrôle de la différenciation des myoblastes L6 par la PLD met en jeu l'activation des deux complexes de mTOR (mTORC1 et mTORC2). mTORC2 active la différenciation, probablement via son effecteur PKCalpha, alors que mTORC1 la réprime via son effecteur S6K1, en induisant la phosphorylation de rictor, un composant de mTORC2, et l'inhibition de ce complexe. Nous avons par ailleurs montré que l'extinction de PLD par interférence de I'ARN induit l'atrophie de myotubes L6 en culture, ainsi qu'une baisse de la phosphorylation de S6K1 et 4E-BP1, effecteurs de mTORC1. Inversement, la surexpression de PLD à l'aide de vecteurs adénoviraux induit une hypertrophie des myotubes, associée à une activation de la voie mTORC1, et de Akt, effecteur de mTORC2. De plus, la surexpression de PLD atténue l'atrophie induite par la dexaméthasone. Ces résultats mettent en évidence un rôle hypertrophique et anti-atrophique de la PLD, qui pourrait s'exercer par stimulation de la voie mTOR. Nos résultats suggèrent que la PLD est susceptible de jouer un rôle clé dans le muscle squelettique, en agissant tant au niveau de la régénération du tissu qu'au niveau de la régulation de sa masse. / Phospholipase D (PLD) hydrolyzes phosphatidylcholine of cell membranes, releasing the lipid messenger phosphatidic acid. The ability of PLD to affect mTOR signaling pathway, a central actor in the control of muscle tissue, prompted us to study its role in this tissue. My thesis aims at investigating how PLD is involved in myogenic differentiation, and how it regulates muscle mass. We first showed that the mechanism by which PLD controls differentiation of L6 myoblasts involves the activation of the two mTOR complexes (mTORC1 and mTORC2). mTORC2 activates differentiation, probably via its effector PKCalpha, whereas mTORC1 represses differentiation via its effector S6K1, by inducing the phosphorylation of Rictor, a component of mTORC2, and the inhibition of this complex. Besides, we showed that extinction of PLD by RNA interference induces the atrophy of L6 myotubes, and decreases the phosphorylation of the mTORC1 effectors S6K1 and 4E-BP1. Conversely, overexpression of PLD using adenoviral vectors induces the hypertrophy of myotubes and the activation of both mTORC1 pathway and the mTORC2 effector Akt. Furthermore, PLD overexpression attenuates atrophy induced by dexamethasone. These results highlight a hypertrophic and anti-atrophic role of PLD, which could be achieved through stimulation of the mTOR pathway. Our results suggest that PLD is likely to play a key role in skeletal muscle homeostasis, by acting at both the tissue regeneration and mass regulation levels.