L’ostéoarthrose (OA) est une maladie articulaire dont l’incidence augmente avec le vieillissement de la population. Elle se caractérise par une détérioration progressive du cartilage articulaire accompagnée du remodelage de l’os sous-chondral et du changement des tissus mous de l’articulation. La douleur et le dysfonctionnement de l’articulation affectée sont généralement attribués à l’inflammation et l’épanchement de la synovie. Plusieurs évidences indiquent que l’inflammation de la membrane synoviale contribue grandement à la pathogenèse de l’OA. En effet, la synthèse et l’expression des enzymes protéolytiques qui dégradent la matrice cartilagineuse sont régulées par de nombreuses cytokines retrouvées au sein de ce foyer inflammatoire. Deux d’entre elles, l’interleukine-1 beta (IL-1β) et le «tumor necrosis factor » alpha (TNF-α), jouent un rôle majeur dans le déclenchement de l’inflammation associée à l’OA. Ces cytokines pro-inflammatoires agissent notamment sur les synoviocytes et les chondrocytes en activant NF-κB qui, à son tour, active les gènes de cytokines. Cette boucle de régulation positive amplifie et perpétue la réponse inflammatoire. Récemment, il a été rapporté que l’activation de NF-κB par TNF-α peut être potentialisée par EXTL3, un récepteur transmembranaire ; mais le mécanisme sous-jacent de cet effet demeure inconnu. Toutefois, les niveaux important d’EXTL3 et de son ligand Reg1B chez les patients arthrosiques, laissent croire que ces protéines jouent un rôle dans le développement de l’OA. Notre objectif était d’étudier le mécanisme par lequel EXTL3 amplifie l’activation de NF-κB par TNF-α et d’examiner si ce phénomène se produit aussi avec l’IL-1β. Nous avons utilisé les cellules C28/I2, une lignée cellulaire de chondrocytes, comme modèle d’étude. Les transfections transitoires avec un vecteur d’expression, les techniques d’immunofluorescence (IF), d’immunoprécipitation (IP) et d’immunobuvardage de type Western (IB); ont été utilisées dans le cadre de diverses approches expérimentales. Les résultats obtenus par transfection ont révélé que la protéine EXTL3 potentialisait l’activation de NF-κB aussi bien par IL-1β que par TNF-α. Ce résultat signifie que la potentialisation de l’activité NF-κB par EXTL3 n’est pas spécifique à TNF-α. D’autre part, l’IP avec TNFRI et TRAF2 a révélé la présence d’EXTL3 dans le complexe TNF-α/TNFRI/TRAF2 qui se forme au niveau de la membrane plasmique. De plus, ceci a été confirmé in vivo par microscopie confocale montrant la co-localisation de TNFRI-TRAF2-EXTL3 dans la membrane nucléaire, suggérant ainsi la formation d’un complexe identique au niveau des membranes plasmique et nucléaires. Toutefois, la présence du ligand Reg1B et/ou de la glucosamine inhibait la formation de ce complexe au niveau de la membrane plasmique, tout comme ils abolissaient la potentialisation de l’activité NF-κB par EXTL3. Ces résultats suggèrent non seulement que le recrutement d’EXTL3 libre dans le complexe TNF-α/TNFR1 est requis pour amplifier l’activation de NF-κB par TNF-α, mais aussi la capacité du ligand Reg1B et de la glucosamine à moduler cette activation à travers la baisse ou l’inhibition de l’interaction EXTL3-TNFR1. Les données de cette étude constituent une avancée majeure dans la compréhension des événements moléculaires qui contrôlent l’activation de NF-κB par les cytokines pro-inflammatoires. Ces résultats pourraient conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement de l’inflammation associée à l’OA et impliquant une activation incessante de NF-κB. / Osteoarthritis (OA) is an articular disease with a particularly high incidence in the elderly. This disease is characterized by the progressive degeneration of the cartilage followed by subchondral bone remodelling and a change in the soft tissues of the joint. Local chronic pain and joint malfunction are generally attributed to the inflammation of the synovial membrane, which in itself has been shown to significantly contribute to the pathogenesis of OA. In fact, the synthesis and expression of many proteolytic enzymes which degrade cartilage matrix are regulated by numerous cytokines originating from these inflammation sites. Two pro-inflammatory cytokines, the tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and the interleukine-1β (Il-1β), play a major role in triggering inflammation associated with OA. These cytokines act on synoviocytes and chondrocytes by activating the transcription factor NF-κB, which in turn activates the cytokines’ genes. This positive regulating loop amplifies and maintains inflammatory responses. Recently, studies have shown that the over-expression of the REG receptor/EXTL3, a transmembranous receptor, enhances the activity of cytokine TNF-α in the activation of NF-κB. Unfortunately the mechanism involved in this process is still unknown. In addition, levels of EXTL3 and its ligand REG1B observed in OA patients suggest their possible involvement in the development of OA. Our goal was to study and elucidated the mechanisms used by EXTL3 to amplify NF-κB activation by TNF-α, as well as to examine whether the same phenomenon is occurring with IL-β. A human chondrocytes cell line called C28/I2 as experimental model. The techniques used for the current study were transfection assays, immunoflorescence (IF), immunoprecipitation (IP), and Western blotting (WB). Our transfection data have shown that EXTL3 was able to enhance NF-κB activity induced by TNF-α as well as by IL-1β. This result suggests that the enhanced NF-κB activity by EXTL3 is not specific to TNF-α. The IP experiments with TNFR1 and TRAF2 revealed the presence of EXTL3 in TNF-α/TNFR1 complex which is formed in the plasma membrane. Also, IF assay in combination with confocal microscopy allowed us to detect TNFR1/TRAF2/EXTL3 co-localisation on the nuclear membrane, suggesting the formation of TNF-α/TNFR1 complex on both the nuclear and plasma membranes. Somehow, REG1B, an EXTL3 ligand, and glucosamine were able to inhibit the formation of this complex at the plasma membrane. They were also able to abolish NF-κB activity enhanced by EXTL3. These results suggest that not only EXTL3 recruitment in the TNF-α/TNFR1 complex is required to amplify NF-κB activation by TNF-α, but also that REG1B ligand and glucosamine have the ability to modulate this activation by reducing or inhibiting EXTL3 and TNFR1 interactions. This study’s data represents a major advance in the understanding of molecular events controlling NF-κB activation by pro-inflammatory cytokines. These results could lead to the development of new therapeutics targets, in the treatment of disorders associated to OA and involving recurrent activation of NF-κB.

Introduction : La fibrose kystique (FK) est une maladie génétique mortelle qui touche principalement les poumons et l’appareil digestif. Elle est causée par des mutations sur le gène codant la protéine du CFTR, un canal chlore exprimé à la surface des organes à sécrétions exocrines. Les fonctions principales du CFTR sont les suivantes: 1) la régulation de l’homéostasie ionique des sécrétions; 2) le maintien de la fluidité des sécrétions et; 3) le transport du glutathion. Le dysfonctionnement de la protéine du CFTR rend les sécrétions visqueuses et épaisses, avec des phénomènes obstructifs qui sont responsables de l’apparition de fibrose au sein des divers organes. Dans le poumon, l’accumulation du mucus épais rend difficile l’élimination des bactéries inhalées, ces dernières établissent alors des cycles d’infection qui endommagent les tissus pulmonaires à travers des processus inflammatoires. Dans le tube digestif, le mucus épais entrave l’absorption d’une quantité suffisante d’éléments nutritifs incluant les principaux antioxydants. L’infection et l’inflammation des poumons favorisent l’apparition d’un stress oxydant qui détruit davantage le tissu pulmonaire. Le déficit en glutathion, probablement lié au dysfonctionnement de la proteine du CFTR, et la malabsorption des antioxydants favorisent l’augmentation du stress oxydant. Une augmentation du stress oxydant a été démontrée au cours du diabète et les produits dérivés du stress oxydant ont été mis en évidence dans la pathogenèse des complications associées au diabète. Une augmentation du stress oxydant a également été montrée durant la FK, mais sans pour autant expliquer la survenue du diabète secondaire à la FK dont la prévalence augmente sans cesse. Objectifs : Notre étude consiste à évaluer l’impact du stress oxydant dans les anomalies du métabolisme du glucose durant la FK, et à étudier son rôle dans les mécanismes de sécrétion d’insuline induite par le glucose. Pour ce faire, nous avons déterminé l’impact de la peroxydation lipidique sur la tolérance au glucose et la défense antioxydante globale, in vivo, chez des patients FK présentant une altération du métabolisme du glucose. De plus, nous avons évalué le rôle du stress oxydatif sur la synthèse et la sécrétion d’insuline, in vitro, dans les cellules pancréatiques βTC-tet. Résultats : Dans l’étude in vivo, nous avons démontré que l’intolérance au glucose et le diabète étaient associés à une augmentation de la peroxydation lipidique, traduite par la hausse des niveaux sanguins de 4-hydroxynonenal lié aux protéines (HNE-P). La défense antioxydante évaluée par la mesure du glutathion sanguin démontre que les niveaux de glutathion oxydé restent également élevés avec l’intolérance au glucose. Dans l’étude in vitro, nos résultats ont mis en évidence que l’exposition de la cellule βTC-tet au stress oxydant: 1) induit un processus de peroxydation lipidique; 2) augmente la sécrétion basale d’insuline; 3) diminue la réponse de la sécrétion d’insuline induite par le glucose; et 4) n’affecte que légèrement la synthèse de novo de l’insuline. Nous avons aussi démontré que les cellules pancréatiques βTC-tet résistaient au stress oxydant en augmentant leur synthèse en glutathion tandis que la présence d’un antioxydant exogène pouvait restaurer la fonction sécrétoire de ces cellules. Conclusion : Le stress oxydant affecte le fonctionnement de la cellule pancréatique β de plusieurs manières : 1) il inhibe le métabolisme du glucose dont les dérivés sont nécessaires à la sécrétion d’insuline; 2) il active la voie de signalisation impliquant les gènes pro-inflammatoires et; 3) il affecte l’intégrité membranaire en induisant le processus de peroxydation lipidique. / Introduction: Cystic fibrosis (CF) is the most prevalent lethal genetic disorder affecting mostly lungs and the gastro-intestinal tract. CF is caused by mutations in the gene encoding the CFTR protein, a chloride channel expressed in organs with exocrine secretions. The main functions of the CFTR channel are the following: 1) regulation of electrolyte composition of secretions; 2) maintenance of fluid secretions and; 3) transport of glutathione. The CFTR protein dysfunction leads to thick and viscous secretions with obstructive phenomena responsible for fibrosis occurence in various organs. In the lungs, accumulation of the thick mucus reduces their capacity to eliminate inhaled bacteria responsible for repeated infections and pulmonary tissue damage through inflammatory processes. In the gastro-intestinal tract, the thicknened micus leads to nutritive elements and the major antioxidants malabsorption. Increased oxidative stress has been associated with the onset of diabetes and oxidative stress by-products have been involved in the pathogenesis of diabetic complications. Increased oxidative stress has also been shown in CF but the relationship between oxidative stress and the occurrence of CF-related diabetes (CFRD) remains unclear. Objectives: Our study aims to investigate the role of oxidative stress in the impaired glucose metabolism in CF patients and its relation with the altered glucose-stimulated insulin secretion process. We first determined the impact of lipid peroxidation on glucose tolerance and the antioxidant status in CF patients with altered glucose tolerance. Secondly, we evaluated the role of oxidative stress on insulin synthesis and secretion in the murine pancreatic β-cell line βTC-tet. Results: In CF patients, we demonstrated that conditions of glucose intolerance and diabetes are associated with increased lipid peroxidation as seen with increased blood levels of 4-hydroxynonenal bound to proteins (HNE-P). The antioxidant status evaluated with blood levels of glutathione showed a strong correlation between levels of oxidized glutathione and glucose intolerance. Acute exposure of βTC-tet to oxidative stress led to: 1) increased lipid peroxidation marker levels; 2) increased insulin release in basal conditions; 3) altered glucose-stimulated insulin secretion process and; 4) no effect on the insulin synthessis pathway. We also demonstrated that pancreatic βTC-tet cells can fight against oxidative stress by upregulating their glutathione synthesis whereas the presence of an exogenous antioxidant can restore their secretory function. Conclusion: Oxidative stress can induce β-cell dysfunction through many pathways: 1) it inhibits the glucose metabolism and its by-products which are required for insulin secretion, 2) it activates the signalling pathway involving the pro-inflammatory genes and; 3) it damages the cell structure by inducting the lipid peroxidation process.

L’Ostéoarthrose (OA) est une maladie articulaire entrainant une dégénérescence du cartilage et une ossification de l’os sous-chondral. Elle touche un Canadien sur 10 et pourtant l’origine de cette pathologie est encore inconnue. Dans le cadre de ce projet, la contribution de deux facteurs de transcription, NFAT1 et PITX1, dans la régulation transcriptionnelle du promoteur d’IHH a été examiné compte tenu de l’implication potentielle de la voie hedgehog (Hh) et de ces facteurs dans la pathogenèse de l’OA. La voie de signalisation Hh régule la croissance et la différenciation des chondrocytes. Indian hedgehog (IHH), l’un des trois membres de la famille Hh, contrôle leur prolifération et leur différenciation. / Osteoarthritis (OA) is the most common joint disorder and is characterized by cartilage degradation and endochondral ossification. One in every ten Canadians is affected, yet its aetiopathogenesis remains unknown. In this present study, two new regulators of the IHH promoter, NFAT1 and PITX1, were studied. The downregulation of IHH expression by these factors could contribute to the OA pathogenesis. The Hedgehog (Hh) signaling pathway regulates chondrocyte growth and differentiation in the growth plate. Indian hedgehog (IHH), one of its members, stimulates chondrocyte proliferation and osteoblast differentiation. IHH is essential in skeletogenesis, osteoblastogenesis and cartilage growth.

Selenoproteins are proteins containing selenium in the form of the 21st amino acid, selenocysteine. Selenocysteine (Sec) is directly synthesized onto its cognate tRNA (tRNA[Ser]Sec or tRNASec) and inserted into selenoproteins co-translationally with the help of various cis- and trans-acting factors. Among those factors, SecP43 has been reported to possibly play an essential role in the methylation at the 2’-hydroxylribosyl moiety in the wobble position (Um34) of Sec-tRNA[Ser]Sec and consequently reduce the expression of glutathione peroxidase 1. SecP43 also called tRNASec-associated protein has also been reported to interact in with SepSecS and tRNASec in vivo and the targeted removal of one of these proteins affected the binding of the other to the Sec-tRNASec. The initial aim of the project was to solve the structure of SecP43 by means of x-ray crystallography. Secondly, we were interested in characterizing the interaction of the latter with some of the components of the selenocysteine insertion machinery. These factors are SepSecS and tRNASec. We were able to optimize the expression and the purification of soluble form of the human homologue of SecP43 and of SepSecS by using an adapted auto-induction protocol. This was a major challenge considering that full length SecP43 has not been expressed and purify to date. We did not succeed in crystallizing SecP43. Our failure to crystallize SecP43 is probably due to the fact that it is a partially folded protein as we were able to demonstrate by SAXS (Small Angle X-ray Scattering). The SecP43 envelope calculated by SAXS displayed a rod-shape like structure. In order to enhance the stability of SecP43 required for crystallization, binding affinity studies were conducted to characterize the interaction between SecP43, tRNASec and SepSecS. We did not detect an interaction between SecP43 and tRNASec by using EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) and gel filtration. We also could not detect an interaction between SecP43 and SepSecS using a cross-linking assay. In contrast, the tRNASec/SepSecS interaction was demonstrated by EMSA and the addition of SecP43 seemed to reduce the binding affinity. Therefore, SecP43 might induce a conformational change in SepSecS in the presence of tRNASec. / Les sélénoprotéines sont des protéines contenant du sélénium sous la forme du 21ème acide aminé, la sélénocystéine. Sélénocystéine (Sec) est synthétisé sur son ARNt (ARNt[Ser]Sec ou ARNtSec) et inséré dans les sélénoprotéines de manière co-traductionnelle, avec l'aide de divers facteurs agissant en cis et en trans. Parmi ces facteurs, SecP43 joue possiblement un rôle dans la méthylation du groupement 2'- hydroxylribosyl dans la position d'oscillation (Um34) du Sec-ARNt[Ser]Sec et par conséquent, l’inhibition de SecP43 réduit l'expression de la glutathion peroxydase 1. L’interaction SecP43/ARNtSec/SepSecS a été démontrée in vivo et le retrait ciblé d’une de ces protéines affecte la liaison de l’autre à Sec-ARNtSec. L'objectif initial du projet était de résoudre la structure de SecP43 par cristallographie. En second lieu, nous avons voulu caractériser l’interaction de ce dernier avec certaines composantes de la machinerie d'insertion de la sélénocystéine. Ces facteurs sont notamment SepSecS et ARNtSec. Nous avons optimisé la surexpression et la purification des homologues humains de SecP43 et SepSecS en utilisant un protocole d'auto-induction. Ce fut un défi majeur étant donné que SecP43 n'avait pas encore été surexprimée et purifiée à ce jour. Nous n'avons pas réussi à cristalliser SecP43. Cet échec s’explique probablement par le fait que SecP43 est une protéine dynamique et partiellement replié comme nous avons pu le démontrer par SAXS (Small Angle X-ray Scattering). L'enveloppe de SecP43 calculée par SAXS présente une structure filiforme et non globulaire. Afin d'améliorer la stabilité de SecP43 requise pour la cristallisation, des études d'affinité de liaison ont été conduites pour caractériser les interactions entre SecP43, ARNtSec et SepSecS. Aucune interaction substantielle n’a pu être démontrée entre SecP43 et ARNtSec par retard sur gel ou par chromatographie d’exclusion stérique. Le même constat fut fait pour l’interaction SecP43/SepSecS. En revanche, l’interaction ARNtSec/SepSecS a été démontrée par EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) et l'addition de SecP43 semble réduire l'affinité de liaison de ladite interaction. Par conséquent, SecP43 induirait un changement conformationel de SepSecS en présence du ARNtSec.

Parmi les bactéries pathogènes, les entérobactéries occupent une place particulière du fait de leur facilité d’étude génétique et de leur grande diversité d’hôtes. Dickeya dadantii est une bactérie pathogène des plantes, responsable de pourriture sur de nombreux végétaux en culture ou lors de leur stockage. Sa virulence est principalement due à la sécrétion d’enzymes dégradant la paroi végétale. Ce travail de thèse a porté sur la caractérisation génétique et biochimique de glycosidases de D. dadantii afin de comprendre leur importance dans la dégradation des tissus végétaux. Dans ce travail, nous avons montré que D. dadantii est capable d'utiliser le saccharose, le raffinose, ou le mélibiose comme seule source de carbone pour sa croissance grâce aux deux clusters de gènes scrKYABR et rafRBA, incluant les glycosidases RafA (α-galactosidase, famille GH36) et ScrB (sucrose hydrolase, famille GH32). Le cluster raf permet le catabolisme du mélibiose. Le catabolisme du raffinose nécessite deux étapes supplémentaires fournies par les gènes scrY et scrB. En outre, nous avons caractérisé et analysé deux autres gènes. D’une part, le gène bgxA code une β-D-glucosidase/β-xylosidase (famille GH3). Ce gène est induit en présence de sucres et acides phénoliques. D’autre part, le gène xydA code une enzyme à activité α-L-arabinopyranosidase (famille GH43). Ce gène est induit en présence de xylose. Les résultats obtenus suggèrent que BgxA et XydA sont impliquées dans la dégradation de composés végétaux. La mise en évidence de nouvelles enzymes impliqués dans la pathogénie des bactéries envers leurs hôtes ouvrirait la voie à la recherche de stratégies de lutte contre les phytopathogènes. / Enterobacteriaceae are of particular interest among pathogenic bacteria, because of their suitability for genetic studies and their wide range of hosts. Dickeya dadantii is a plant pathogenic bacterium , causing soft rot diseases in a wide range of plant species in culture or during storage. Its virulence is mainly due to the secretion of plant cell wall degrading enzymes. This thesis has focused on genetic and biochemical characterization of D. dadantii glycosidases to understand their importance in the degradation of plant tissues. In this work, we showed that D. dadantii is able to utilize sucrose, raffinose, or melibiose as sole carbon sources for growth. This ability is due of the presence of two gene clusters, scrKYABR and rafRBA, including the glycosidases RafA (α-galactosidase, GH36) and ScrB (sucrose hydrolase, family GH32). The cluster raf allows catabolism of melibiose. Raffinose catabolism requires two additional steps provided by the genes scrY and scrB. In addition, two other genes were analyzed and characterized. On one hand, bgxA encodes a β-D glucosidase/β-xylosidase of the family GH3. This gene is induced in the presence of phenolic sugars and acids On the other hand, XydA encodes an α-L-arabinopyranosidase of the family GH43. This gene is induced in the presence of xylose. The results suggest that BgxA and XydA are involved in the degradation of plant compounds. Identification of new enzymes involved in the pathogenesis of bacteria towards their hosts could open the way for research strategies to fight plant pathogens.

La pourriture grise causée par Botrytis cinerea est l'une des principales maladies de la vigne. La principale solution pour faire face à cette maladie est l'utilisation de produits chimiques, mais la lutte chimique cause des dommages environnementaux et conduit au développement de souches de B. cinerea résistantes. Une stratégie alternative consiste à stimuler les mécanismes de défense naturelle de la vigne. Cependant, B. cinerea est connu pour contourner les défenses de la plante (El Oirdi et Bouarab, 2011) et à ce jour aucun éliciteur n'a montré d'effet protecteur probant contre B. cinerea. De plus, les résultats prometteurs observés au laboratoire se révèlent souvent décevants au vignoble et à ce jour aucun produit stimulateur de défense ne confère à la vigne une protection acceptable contre la pourriture grise. Pour développer des éliciteurs efficaces contre la pourriture grise, il s'avère donc essentiel de caractériser des marqueurs de protection qui permettraient de distinguer stimulation des défenses et protection efficace de la vigne contre B. cinerea. Pour ce faire des analyses comparatives ont été réalisées par 2D-PAGE afin de comparer au niveau protéique l'effet d'éliciteurs induisant une protection et l'effet d'éliciteur n'induisant pas une protection. Les recherches se sont concentrées sur l'apoplaste, qui est un réseau continu dans les plantes créant une interface avec l'environnement. Après la cuticule, l'apoplaste est ainsi la première barrière contre les attaques d'agents pathogènes (Agrawal et al., 2010). Afin d'obtenir un aperçu du protéome constitutif de l'apoplaste (secrétome), une méthode d'infiltration-centrifugation a été optimisée afin de recueillir le fluide apoplastique à partir de feuilles de vigne. Les profils protéiques apoplastiques ont ensuite été comparés aux profils protéiques de feuilles entières par 2D-PAGE et les protéines identifiées par spectrométrie de masse. Cette approche nous a permis d'établir une carte protéique des feuilles entières et du secrétome de la vigne. A notre connaissance, cette étude fournit la première carte protéique du secrétome de la vigne. Cette étude nous donne ainsi un aperçu des protéines les plus abondantes de l'apoplaste de feuilles de vigne. Une prédiction de la fonction des protéines nous a permis de conclure que l'apoplaste de vigne contient principalement (i) des protéines liées aux stress, (ii) des protéines impliquées dans le métabolisme de la paroi cellulaire et (iii) des protéases. Pour confirmer la qualité des extractions, l'analyse prédictionnelle de la sécrétion des protéines a révélé une forte proportion de protéines secrétées de manière classique et non classique (Leaderless Secreted Proteins, LSP). Cette approche offre un grand nombre de protéines candidates impliquées dans les diverses fonctions physiologiques de l'apoplaste. (…)Parallèlement cette étude présente les travaux préliminaires entrepris, également par 2D-PAGE, pour (i) mettre en évidence des marqueurs de potentialisation chez la vigne, (ii) mettre en évidence les bouleversements, au niveau protéique, causés par une infection de B. cinerea sur la vigne et (iii) comprendre comment un traitement avec un éliciteur protecteur pourrait limiter ces effets néfastes. La validation de ces marqueurs par différentes approches permettra d'améliorer la compréhension des mécanismes de défense des plantes et le développement d'outils pour le criblage de nouveaux éliciteurs candidats pour leurs effets protecteurs contre la pourriture grise et pour le suivi des défenses de la vigne directement au vignoble. / Grey mould caused by Botrytis cinerea infection is one of the main diseases affecting grapevine. The main solution to cope with this disease is the use of chemicals, but chemical control cause environmental damages and lead to the development of B. cinerea resistant strains. An alternative strategy to prevent diseases consists in stimulating plant defense mechanisms. Nevertheless B. cinerea is known to manipulate plant defenses (El Oirdi and Bouarab, 2011) and to date no elicitors have shown expected protective effect against B. cinerea even if they stimulate defense markers. Moreover despite that numerous studies showed an excellent efficacy of elicitors in laboratory conditions, in vineyard the obtained results are often disappointing.Thus it is necessary to distinguished elicitors inducing protection (protective elicitor) from elicitors inducing defense but no protection (non protective elicitors). For that it appears crucial to characterize markers which would enable to discriminate grapevine defense stimulation from effective protection against B. cinerea. To reach this goal, comparative analyses were performed by 2D-PAGE in order to compare the effect of protective elicitors from non protective elicitors against B. cinerea on grapevine apoplastic fluids. Those biomarkers could be defined as protection biomarkers.Researches were focused on the apoplast, which is a continuous network in plants and creates an interface with the environment. After the cuticle, apoplast is the first barrier against pathogen attacks (Agrawal et al., 2010). In order to obtain an overview of the constitutive apoplastic proteome (secretome), a vacuum-infiltration-centrifugation method was optimized to collect the apoplastic fluid from grapevine leaves. Apoplastic protein profiles were compared to whole-leaf protein profiles by 2D-PAGE and protein identifications were performed by tandem mass spectrometry. This approach allowed us to establish a well-defined proteomic map of whole-leaf and apoplastic leaf. To our knowledge, it is the first time that the apoplastic fluid is recovered from grapevine to characterize its protein content. This study provides a comprehensive overview of the most abundant proteins present in grapevine apoplast. Protein function prediction allowed us to conclude that the grapevine apoplast mainly contains a high proportion of (i) stress-related proteins, (ii) proteins involved in cell wall metabolism, (iii) proteases. To confirm quality of extractions, proteins secretion prediction tools revealed a high proportion of classical and non-classical secreted proteins namely Leaderless Secreted Proteins (LSP). This approach provides thus a large number of candidate proteins involved in physiological functions of the apoplast under various stresses.Differential analyses let us to highlight 7 putative markers, namely an aspartyl protease, a β-1,3 glucanase, an isoflavone reductase for induced markers and an another aspartyl protease, an another β-1,3 glucanase, a germin-like protein and a serine pyruvate amino transferase for repressed markers. This proteins could act in a concert manner to (i) regulate reactive oxygen species homeostasy and dercease programmed cell death, (ii) counteract B. cinerea virulence factors, (iii) increase plant cell wall stiffening, (iv) cause fungal membrane leakage and (v) participate in the induction of systemic defence responses.In addition, this study provides preliminary research performed to highlight (i) priming biomarkers in grapevine, (ii) damages caused by B. cinerea infection on grapevine proteome and (iii) how a protective elicitor treatment could limit those damages.Further functional analyses of these proteins will improve the understanding of plant defense mechanisms and tools development for large scale screening of new elicitors regarding their protective effects against grey mould disease and for following grapevine defenses in vineyard.

L'objectif général de cette thèse était d'étudier les mécanismes microbiens intervenant dans l'évolution de la structure et des propriétés du caoutchouc naturel produit à partir du latex d'Hevea brasiliensis lors de la maturation du latex et des coagula de tasse. Pour cela, trois niveaux d'analyses ont été réalisés sur des expériences de maturation en conditions contrôlées : analyse de la structure et des propriétés du caoutchouc sec, analyse des flores microbiennes et analyses biochimiques. Après une phase de mises au point méthodologiques permettant notamment d'optimiser les conditions de maturation en chambre contrôlée et de définir une méthode d'extraction d'ADN adaptée au latex et au sérum de coagulum, des échantillons de caoutchouc sec et de sérum ont été produits à différents temps de maturation et selon différents traitements faisant varier trois paramètres : la présence de microorganismes, la présence d'oxygène, et le mode de coagulation du latex. Les analyses sur caoutchouc sec se sont portées sur la macrostructure (P0, P30 et PRI) et sur la mésostructure (Mw, Mn et gel total). L'analyse des flores microbiennes s'est appuyée sur plusieurs méthodologies complémentaires : comptages sur boîtes, dosage de l'ADN total, clonage/séquençage et pyroséquençage 454. L'objectif était d'évaluer la diversité des flores sur plantation et dans le latex ainsi que de suivre la dynamique de leur évolution au cours de la maturation en milieu contrôlé. Diverses analyses biochimiques ont réalisées sur latex, sérum et caoutchouc sec (taux d'azote, protéines, lipides, sucres, québrachitol, acides organiques). Les résultats obtenus ont ensuite été analysés en vue d'établir des corrélations et de proposer des mécanismes reliant l'évolution des propriétés du caoutchouc sec à celle de la biochimie du latex et des coagula et de leur évolution sous l'action des microorganismes et des enzymes, et de proposer quelques pistes en vue de l'amélioration des itinéraires techniques dans la filière. / The overall objective of this thesis was to study the microbial mechanisms involved in the evolution of the structure and the properties of the natural rubber from Hevea brasiliensis during the maturation of latex and cup-coagula. For this, three levels of analyses were performed on maturation experiments under controlled conditions: dry rubber structure and properties, biochemistry and microbial flora. After a methodology development phase aiming at (i) optimizing maturation conditions in a controlled chamber and (ii) defining suitable DNA extraction methods, samples of serum and dry rubber coagulum were produced at different times and under different maturation treatments varying three parameters: the presence of microorganisms, the presence of oxygen, and the latex coagulation method. Dry rubber analyses concerned macrostructure (P0, P30 and PRI) and mesostructure (Mw, Mn and total gel). The microbial flora was analyzed using several complementary methods: plate-counts, total DNA determination, cloning / sequencing and 454 pyrosequencing. The objective was to assess microbial diversity on field and in latex, and to follow the dynamics of their evolution during maturation in a controlled environment. Various biochemical investigations were performed on latex, serum and dry rubber (nitrogen content, proteins, lipids, sugars, quebrachitol, organic acids). The results were then analyzed for correlations to propose mechanisms linking changes in dry rubber properties, latex and coagula biochemistry, and their evolution under the action of microorganisms and enzymes. Some ideas for improving technical routes in the process are also proposed.

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Les récepteurs nucléaires régulent l’expression des gènes importants pour le développement et l’homéostasie des cellules eucaryotes. Si certains d’entre eux sont activés par la liaison d’un ligand naturel, d’autres, comme le récepteur ERR, sont orphelins et ne possèdent pas de ligand naturel connu à ce jour. ERR se lie via son domaine DBD sur un élément de réponse ERRE au niveau des régions promotrices des gènes et son activité peut être modulée par la liaison de ligands synthétiques antagonistes. Par une approche de biologie structurale intégrative combinant biochimie, biophysique et cristallographie aux rayons-X, mon travail de thèse consistait en l’étude de l’organisation structurale d’ERR pour comprendre les mécanismes d’antagonisme induits par le ligand agoniste inverse XCT-790, et la topologie qu’il adopte en interagissant avec l’ADN. Mon projet était axé sur l’étude des domaines modulaires DBD et LBD en complexe avec ADN et ligand transposée à l’étude fonctionnelle du récepteur entier. Par un important travail biochimique, j’ai mis en place les protocoles de purification de ces protéines et caractérisé biophysiquement la stabilité et la stœchiométrie des complexes avec ADN et ligand. J’ai mis en évidence que le ligand XCT-790 se lie sur chacun des monomères de LBD avec une forte affinité et que le DBD interagit avec un ERRE sous la forme d’un monomère. De multiples essais de cristallisation ont abouti à l’obtention de cristaux pour les complexes avec le LBD et le DBD ayant diffracté respectivement jusqu’à 3,5 Å et 7 Å de résolution sans néanmoins pouvoir en déterminer les structures. L’ensemble de ces résultats permettent de conclure que le DBD est monomérique sur les ERRE et IR3 et semble être dimérique sur l’élément de réponse combiné ERRE/ERE. La topologie qu’adopte ERR sur l’ADN est dictée par la liaison de ligand et serait la conséquence d’une communication allostérique entre les domaines modulaires. Ces connaissances acquises faciliteront la détermination structurale d’ERR entier par cristallographie aux rayons-X ou par cryo-microscopie électronique. / Nuclear receptors regulate expression of important genes involved in development and homeostasis in eukaryotic cells. While some of them are regulated by the binding of a natural ligand, others, like ERR, are orphan and don’t have any natural ligand identified up to now. ERR binds to ERRE response elements through its DBD on promoter regions of genes and its activity can be modulated by the binding of synthetic antagonist ligands. By an integrative structural biology approach, my thesis work consisted in the study of the structural organization of ERR to understand the antagonism mechanisms induced by the inverse agonist XCT-790, and the adopted topology upon binding to DNA. My project focused on the study of the modular domains DBD and LBD complexes with DNA and ligand and extended to the functional study of the whole receptor. Thanks to significant biochemical work, I set up the purification protocols for these proteins and characterized by biophysics the stability and stoichiometry of the DNA and ligand complexes. This work revealed that XCT-790 binds on each LBD monomer with high affinity and that the DBD interacts to an ERRE as a monomer. Many crystallization trials led to crystals for the LBD and DBD complexes that diffracted respectively up to 3.5 Å and 7 Å of resolution but no structure could be determined. These results allow to conclude that the DBD is monomeric on the ERRE and IR3 and appears to be dimeric on the combined response element ERRE/ERE. The topology adopted by ERR on DNA is guided by the ligand binding and might be the consequence for an allosteric communication between the modular domains. These results provide the basis for a future structure determination of the full ERR by X-ray crystallography and cryo electron microscopy.

Lors de mon cursus universitaire à Orsay, j'ai eu l‘opportunité de suivre des enseignements variés, tous (ou presque ...) dispensés avec passion. Ces professeurs m'ont conforté dans mon amour de la Science, avec un intérêt tout particulier pour l'étude des systèmes complexes : la compréhension du fonctionnement de la cellule, de l'organe et de l'individu m'apparaissait alors riche de mille promesses !<br />J'ai lu avec intérêt les deux volumes du “Heller”, captivé par l'ingéniosité de nos aînés pour élucider le fonctionnement des plantes. Toutefois, déjà à l'époque, je ressentais une certaine frustration car l'analyse s'arrêtait à un niveau “descriptif”. Je rêvais de pouvoir descendre à un niveau “explicatif” (par la suite, j'ai appris qu'on disait “moléculaire”). Imaginer un instant qu'on puisse un jour visualiser la cascade d'interactions moléculaires qui va de l'application de l'acide abscissique à la chute des feuilles me comblait d'aise.<br />Comprendre cet enchaînement nécessite d'appréhender le fonctionnement de chacune des protéines impliquées, or ces fonctions sont portées par les structures tridimensionnelles des protéines. C'est là que tout devient plus compliqué ! En effet, il suffit de consulter les bases de données et d'y comparer l'abondance relative des structures primaires de protéines à celle des structures tertiaires pour mesurer la difficulté d'aborder la troisième dimension ! Même avec les progrès réalisés au tournant du millénaire, déterminer toutes les structures 3D de toutes les protéines étudiées semble hors de portée. On réalise alors le grand intérêt de construire une “Pierre de Rosette” qui fera correspondre structures primaires, structures tertiaires et fonctions. De même qu'on sait déjà traduire une séquence de nucléotides en une séquence d'acides aminés, il est primordial de percer les lois qui nous permettront de replier une séquence d'acides aminés en une structure tridimensionnelle. Nous pourrons ainsi, à moindre effort, obtenir les structures 3D in silico, en analyser le fonctionnement et les interactions. Cela est d'autant plus important en cette ère de post-génomique qui voit s'accumuler des milliers de séquences inconnues, issues des programmes de séquençage systématique.