MicroRNAs (miRNAs) are non-coding small RNAs that regulate eukaryotic gene activity at the post-transcriptional level by a process termed miRNA gene suppression. MicroRNA-122 (miR-122) is predominantly expressed in human liver cells and recent studies indicated that miR-122 promotes Hepatitis C Virus (HCV) replication and translation through physical interaction with two tandem binding sites located in the 5 untranslated region (5UTR) of the HCV genome (Jopling, et al., 2006; Jopling, et al., 2008). It has been reported that host genes that are also implicated in the miRNA gene suppression pathway are key regulators of HCV replication (Randall, et al., 2007). Two proteins, Dicer, a key RNaseIII enzyme, and its binding partner TRBP are essential proteins for miRNA activity. They are part of a protein complex called the RNA induced silencing complex (RISC) which also includes Argonaute proteins, and function in miRNA biogenesis loading the miRNA into RISC. As such, they are intriguing targets to study host-viral interplay during HCV replication.<p> In our study, we designed siRNAs to knock down Dicer and TRBP and then observed the effects of gene knockdown on full length J6/JFH-1-RLuc HCV (genotype 2a chimeric genome) replication and translation. The results showed that knocking down Dicer and TRBP reduced wild type (wt) J6/JFH-1-RLuc replication but had almost no effects on HCV translation in human liver cells. However, since knocking down Dicer and TRBP did not significantly alter miR-122 levels in the cell, it appears that the role of Dicer and TRBP was not solely the biogenesis of miR-122. This was confirmed by an experiment in which we observed that knocking down Dicer and TRBP also attenuated replication of a mutant virus in which replication is dependent on a exogenously supplied miRNA instead of endogenous miR-122.<p> Taken together, the results supported the hypotheses that Dicer and TRBP facilitate HCV infection mainly through HCV replication but not translation. The effects of Dicer and TRBP on HCV replication are not solely due to miR-122 biogenesis, and may be due to RISC loading functions in steps of miRNA gene suppression.<p> This study has set some essential groundwork for investigating potential roles of host factors in the RNAi machinery modulating HCV replication/translation and exploring novel antiviral targets.

MicroRNAs (miRNAs) are non-coding small RNAs that regulate eukaryotic gene activity at the post-transcriptional level by a process termed miRNA gene suppression. MicroRNA-122 (miR-122) is predominantly expressed in human liver cells and recent studies indicated that miR-122 promotes Hepatitis C Virus (HCV) replication and translation through physical interaction with two tandem binding sites located in the 5 untranslated region (5UTR) of the HCV genome (Jopling, et al., 2006; Jopling, et al., 2008). It has been reported that host genes that are also implicated in the miRNA gene suppression pathway are key regulators of HCV replication (Randall, et al., 2007). Two proteins, Dicer, a key RNaseIII enzyme, and its binding partner TRBP are essential proteins for miRNA activity. They are part of a protein complex called the RNA induced silencing complex (RISC) which also includes Argonaute proteins, and function in miRNA biogenesis loading the miRNA into RISC. As such, they are intriguing targets to study host-viral interplay during HCV replication.<p> In our study, we designed siRNAs to knock down Dicer and TRBP and then observed the effects of gene knockdown on full length J6/JFH-1-RLuc HCV (genotype 2a chimeric genome) replication and translation. The results showed that knocking down Dicer and TRBP reduced wild type (wt) J6/JFH-1-RLuc replication but had almost no effects on HCV translation in human liver cells. However, since knocking down Dicer and TRBP did not significantly alter miR-122 levels in the cell, it appears that the role of Dicer and TRBP was not solely the biogenesis of miR-122. This was confirmed by an experiment in which we observed that knocking down Dicer and TRBP also attenuated replication of a mutant virus in which replication is dependent on a exogenously supplied miRNA instead of endogenous miR-122.<p> Taken together, the results supported the hypotheses that Dicer and TRBP facilitate HCV infection mainly through HCV replication but not translation. The effects of Dicer and TRBP on HCV replication are not solely due to miR-122 biogenesis, and may be due to RISC loading functions in steps of miRNA gene suppression.<p> This study has set some essential groundwork for investigating potential roles of host factors in the RNAi machinery modulating HCV replication/translation and exploring novel antiviral targets.

Récemment, plusieurs études ont permis de mettre en évidence un lien possible entre la maturation des snoARN et celle des microARN, deux familles d’ARNnc impliquées respectivement dans la maturation d’autres ARN, tels les ARNr, et dans la régulation de l’expression des gènes. En effet, ces études ont montré que certains microARN pouvaient être issus de la maturation d’un snoARN précurseur, formant alors une nouvelle classe d’ARNnc, les sdARN (ARN dérivés de snoARN). Le manque d’informations disponibles sur les mécanismes de maturation possibles des sdARN nous a conduit à réaliser un crible double-hybride chez la levure S. cerevisiae entre différentes protéines impliquées dans la biogenèse des snoARN et des microARN. Ce crible a permis d’identifier une nouvelle interaction entre les protéines TRBP, impliquée dans la maturation du pré-microARN en microARN, et RPAP3, un protéine du complexe d’assemblage hR2TP. L’observation de cette interaction soulève plusieurs questions, telles que son implication possible dans la maturation de microARN à partir de snoARN précurseurs, ou encore sur l’implication possible de TRBP et RPAP3 dans la biogenèse des snoRNP ou des microARN, respectivement. Nous avons alors entrepris de caractériser l’interaction entre TRBP et RPAP3. Par des approches de biologie moléculaire, de biochimie et de biologie structurale, nous avons d’une part confirmé l’existence du complexe in vitro et in vivo et identifié les domaines respectifs de TRBP et de RPAP3 impliqués dans l’interaction, ainsi qu’identifié plusieurs mutations intéressantes au niveau de l’interface d’interaction. L’utilisation de ces mutants devrait nous permettre d’étudier l’effet de la perte d’interaction entre TRBP et RPAP3 sur la maturation de différents ARNnc. Enfin, nos travaux ont également permis d’observer que l’interaction entre TRBP et RPAP3 n’était pas compatible avec la formation du complexe entre TRBP et la RNase Dicer. Or, il avait été montré que l’absence de TRBP au niveau de Dicer entraînait dans certains cas la génération de microARN avec des extrémités, et donc des spécificités, altérées (iso-miRs). La formation d’un complexe entre les protéines TRBP et RPAP3 pourrait donc constituer un moyen possible de réguler la disponibilité de TRBP et, indirectement, l’activité de Dicer / Recently, several studies have described a possible link between snoRNA and microRNA maturation, two ncRNA families involved in the maturation of other RNAs, such as rRNA, and in the regulation of gene expression, respectively. Indeed, these studies have shown that some microRNAs could be maturated from a snoRNA precursor, forming a new class of ncRNAs, the sdRNAs (snoRNA-derived RNAs). The mechanism of sdRNA maturation are still poorly understood. Therefore, we have performed a two-hybrid screen in the yeast S. cerevisiae between different proteins involved in microRNAs and snoRNAs biogenesis. Interestingly, we observed a novel interaction between TRBP, involved in the maturation of microRNAs, and RPAP3, a member of the hR2TP complex. The observation of this interaction raises several questions, such as its possible involvement in the maturation of microRNAs from snoARN precursors, or on the possible involvement of TRBP or RPAP3 in snoRNP or microRNA biogenesis, respectively. Using various molecular biology and biochemical approaches, we undertook the functional and structural characterization of the TRBP/RPAP3 interaction. First, we confirmed the interaction both in vitro and in vivo and we identified the TRBP and RPAP3 domains involved in the interaction, as well as several interesting mutations in the binding interface. Using these mutants should allow us to study the effects of this mutations on the maturation of differents ncRNAs. Additionally, we showed that the interaction between TRBP and RPAP3 and between TRBP and the RNase Dicer were mutually exclusive. Interestingly, it was shown that in the absence of TRBP, Dicer processig resulted, in some cases, in the generation of microRNAs with different ends, and thus, with altered specificity(iso-miRs). The interaction between TRBP and RPAP3 could therefore also constitute a possible way to regulate the availability of TRBP, and eventually the activity of Dicer

Les microARNs sont une classe de petits ARNs non codants qui régulent l'expression des gènes via un mecanisme d'interference par ARN. Les microARNs humains sont produits par une série de réactions enzymatiques. En particulier, dans le cytoplasme le precurseur de miRNA (pre-miRNA) est reconnu et clivé par un complexe contenant l'enzyme RNAse III Dicer et plusieurs cofacteurs protéiques. La proteine TRBP (HIV TAR RNA binding protein) est l'un de ces cofacteurs et augmente la stabilité du complexe, influe sur la cinétique, la position du clivage et a role potentiel dans la reconnaissance du substrat et dans le transfet du produit vers le complexe RISC (RNA-induced silencing complex) effecteur de l'interference par ARN. TRBP est composé de 3 domaines de liaison aux ARN doubles brin (dsRBDs). La région d'interaction de TRBP avec les ARNs est composé des deux premiers dsRBDs liés par une région interdomaine non charactérizée. La présente étude rapporte la caractérisation biophysique in vitro de la région d'interaction avec les ARNs de TRBP dans l'état apo de TRBP ou dans l'état lié avec les deux precurseurs cytoplasmique successifs du microARN oncogène miR-155 comprenant la tige boucle pre-miR-155 et le duplex miR-155/miR-155* résultat du clivage de pre-miR-155 par Dicer. L'étude montre que la région d'intéraction de TRBP avec les ARNs est monomerique, est composée de deux dsRBDs independants en solution et que la région interdomaine de 60 résidus est flexible. Le premier dsRBD, non caractérisé précédement en solution est le siège d'un equilibre plié/déplié integral dans une grande gamme de conditions physico-chimiques. Les deux premiers dsRBDs de TRBP peuvent interagir avec un même precurseur de microARN et deux régions d'interaction de TRBP avec les ARNs peuvent interagir avec un même precuseur. La région d'interaction de TRBP avec les ARNs interagit avec pre-miR-155 et le duplex miR-155/miR-155* avec des affinités très similaires. Dans le complexe avec une région d'interaction de TRBP avec les ARN liée à pre-miR-155 ou au duplexe miR-155/miR-155*, aucune indice de contact entre les deux dsRBDs n'a été detecté et la protéine interagit avec les deux precurseurs par la même surface d'interaction. Les informations récoltées suggèrent que TRBP peut jouer un rôle avant et après le clivage des pre-miARN par Dicer, notamment dans le complexe de chargement de RISC. / MicroRNAs (miRNA) are a class of small non-coding RNAs that regulate gene expression through RNA interference (RNAi). Human miRNAs are generated via a series of enzymatic processing steps. In particular, in the cytoplasm, the precursor miRNA (pre-miRNA) is recognized and cleaved by a complex containing the RNase III enzyme Dicer and several non-catalytic accessory proteins. HIV TAR element-binding protein (TRBP) is a constituent of the Dicer complex, which augments complex stability, has effect on the cleavage kinetics and on the cleavage site and potentially functions in substrate recognition and product transfer to the RNA-induced silencing complex (RISC). TRBP is composed of three double stranded RNA binding domains (dsRBDs). The RNA binding region of TRBP is composed of the first two dsRBDs and an uncharacterized interdomain region. The present study reports the in vitro biophysical characterization of the RNA binding region of TRBP in the apo state and in the RNA bound state with the two successive cytoplasmic precursors of the oncogenic human microRNA miR-155, the hairpin pre-miR-155 and the related Dicer product miR-155/miR-155* duplex. The study shows that the RNA binding region of TRBP is monomeric and comprises two independent double-stranded RNA-binding domains connected by a 60 residues flexible linker. The first dsRBD, uncharacterized previously in solution, undergoes a full folding/unfolding equilibrium in a wide range of physico-chemical conditions. The two first dsRBDs of TRBP can interact with one microRNA precursor and two RNA binding regions can interact with one precursor molecule. The RNA-binding region of TRBP interacts with both pre-miR-155 and miR-155/miR-155* duplex with similar affinities. In the complex with one RNA binding region of TRBP bound to either pre-miR-155 or miR-155/miR-155* duplex, no evidence of contact between the two dsRBDs were observed and the protein interacts with both precursors via the same protein binding surface. The data presented here suggest that the RNA binding region of TRBP can play a role before and after processing of pre-miRNAs by Dicer, including in the RISC loading complex.

TRBP (TAR RNA Binding Protein), est un facteur activateur de la réplication du Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1). Cette protéine cellulaire qui interagit avec les ARN double brins est connue pour son rôle crucial dans la voie des miRNA. Isolée pour sa capacité à interagir avec la séquence leader TAR présente à l'extrémité 5' de tous les ARN du VIH-1, TRBP favorise la réplication du VIH-1 au niveau post-transcriptionnel, en partie via l'inhibition de la PKR (Protéine Kinase ARN dépendante).Dans le but de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels TRBP facilite la réplication du VIH-1, le complexe protéique associé à TRBP a été purifié par immunoprécipitation par double affinité et identifié par spectrométrie de masse. En plus des facteurs déjà connus, un nouveau partenaire à activité ARN 2'-O-méthyltransférase (2'-OMTase) potentielle a été copurifié : la protéine FTSJ3. Chez les eucaryotes supérieurs, deux 2'-OMTases permettent la méthylation des ARNm cellulaires au niveau de la position ribose 2'-O- du premier (coiffe 1) et du deuxième nucléotide (coiffe 2). Cette coiffe 1/2 est une signature moléculaire permettant de discriminer les ARNm endogènes et exogènes. Dans la cellule, MDA5, un senseur cytoplasmique, reconnait les ARN exogènes non coiffés et déclenche la production d'interférons (IFNs) de type I pour établir un état antiviral. Pour échapper à la réponse immune innée, certains virus ont développé des mécanismes leur permettant de mimer une coiffe 1/2.Le VIH ne code pas pour une activité 2'-OMTase. Cependant FTSJ3, de par son interaction avec TRBP, se retrouve à proximité de l'extrémité 5' de l'ARN viral. Cette 2'-OMTase méthyle l'ARN TAR in vitro, qui, transfecté dans les cellules monocytaires humaines U937 n'induit plus la production d'IFNs de type I. A l'inverse, le virus VIH-1 produit en l'absence de FTSJ3 déclenche une induction de l'expression des IFNs de type I dépendante de MDA5 dans les cellules U937. L'expression de ce virus est atténuée suite à un défaut d'import nucléaire. Ainsi, ces travaux montrent que la protéine FTSJ3, recrutée au niveau de l'extrémité 5' de l'ARN du VIH-1 par TRBP, facilite la réplication du VIH-1 en assurant la synthèse d'une coiffe 1/2 qui permet au VIH-1 d'échapper à la reconnaissance par le senseur MDA5 et à l'induction des IFNs de type I. Cette étude met en évidence un nouveau mécanisme permettant au VIH-1 d'échapper à la détection par le système d'immunité innée cellulaire. / TRBP (TAR RNA Binding Protein) is a cellular RNA binding protein that facilitates the replication of Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1). Isolated for its ability to bind HIV-1 TAR sequence present at the 5' end of all HIV-1 RNA, TRBP promotes HIV-1 replication at a post-transcriptional level by counteracting the antiviral activity of the protein kinase R (PKR).To gain more insight on how TRBP enhances HIV-1 replication, TRBP associated factors were purified using tandem immunoaffinity purification and identified by mass spectrometry. In addition to already known associated factors, a new protein with a putative RNA 2'-O-methyltransferase activity (2'OMTases) was copurified: FTSJ3. In higher eukaryotes, cellular mRNA are methylated on 2'-O ribose position on the first (Cap 1) and second nucleotide (Cap 2). This capping provides a molecular signature for the discrimination of endogenous versus exogenous mRNA. In the cell, MDA5, a cytoplasmic sensor, recognizes exogenous uncapped RNA and activate type I interferons (IFNs) production to establish an antiviral state. To evade innate immune response, some viruses have evolved mechanisms to mimics cap 1/2.HIV-1 does not encode a 2'O-MTase activity. However, owing to its interaction with TRBP, FTSJ3 is recruited at the 5' end of the viral genome and methylates TAR RNA in vitro. When capped by FTSJ3, TAR does not induce type I IFNs anymore when transfected in monocytic cell line U937. Conversely, HIV-1 viruses produced in FTSJ3 knock-down cells triggers type I IFNs expression through MDA5 sensing. This virus is attenuated, expressed in low amounts because of a block at the level of HIV-1 nuclear import. This study shows that FTSJ3 is recruited to HIV-1 5' end TAR sequence by TRBP and facilitates HIV-1 replication. HIV-1 RNA capping allows HIV-1 escape from MDA5 sensing and type I IFN induction. This study highlights a new way of HIV-1 escape from innate immune system.

No description available.

Seasonal and pandemic Influenza virus infections cause about three to five million cases of severe illness and about 250,000 to 500,000 deaths world-wide annually according to the WHO. Although investigated intensively, Influenza virus pathogenesis is still not very well understood and hard to predict. Influenza A viruses contain a segmented, single-(-) stranded RNA genome encoding at least 10 different proteins and are highly diverse due to hypermutation and reassortment. In previous work, 56 viral genes from six different influenza A virus isolates had been cloned and genome-wide screened for virus-host protein interactions using yeast-two hybrid technology and several human and chicken cDNA libraries, leading to the identification of 127 high-confidence cellular interactors of which 40 have also been identified by RNA interference in other studies. In this thesis, two of the cellular interactors identified which both bound to the viral multifunctional protein NS1, TRBP and PACT, were further investigated with regard to their role in virus life cycle. These two proteins are known to be involved in miRNA silencing and PKR regulation. Both interactions between NS1 and TRBP and NS1 and PACT were confirmed by co-immunoprecipitation, and both TRBP and PACT co-localized with NS1 in a cytosolic compartment. NS1 was also found to be present in the RISC complex in pull-down assays with the RISC core component Ago2. In functional assays, NS1 dose-dependently inhibited RNA silencing. Although no differences in TRBP-binding between NS1 proteins of various different influenza strains could be detected in direct mating Y2H assays, they varied with regard to their inhibitory activity on RNA silencing. TRBP and PACT alone were unable to restore NS1-induced inhibition of RNA silencing activity, however both together restored RNA silencing. Moreover, the siRNA knockdown of PACT abolished the association of NS1 with Ago2, and NS1 competitively inhibited the binding of TRBP and PACT to Ago2. The depletion of either TRBP or PACT led to an inhibition of influenza virus replication. The depletion of TRBP also lifted cellular IFNβ level without infection. However, the knockdown of TRBP but not PACT blocked IFNβ production and increased cell viability post infection. These results indicate that NS1 inhibits the binding of PACT and TRBP to the RISC complex and thereby inhibits miRNA-induced gene silencing. The hypothesis that TRBP supports influenza replication potentially by regulating PKR regulation and IFNβ induction requires further investigation. In conclusion, this study provides evidence for the complexity of virus-host interactions and the dual role of viral proteins in activating both positive and negative regulatory cellular mechanisms.

Les microARNs sont une classe de petits ARNs non codants qui régulent l'expression des gènes via un mecanisme d'interference par ARN. Les microARNs humains sont produits par une série de réactions enzymatiques. En particulier, dans le cytoplasme le precurseur de miRNA (pre-miRNA) est reconnu et clivé par un complexe contenant l'enzyme RNAse III Dicer et plusieurs cofacteurs protéiques. La proteine TRBP (HIV TAR RNA binding protein) est l'un de ces cofacteurs et augmente la stabilité du complexe, influe sur la cinétique, la position du clivage et a role potentiel dans la reconnaissance du substrat et dans le transfet du produit vers le complexe RISC (RNA-induced silencing complex) effecteur de l'interference par ARN. TRBP est composé de 3 domaines de liaison aux ARN doubles brin (dsRBDs). La région d'interaction de TRBP avec les ARNs est composé des deux premiers dsRBDs liés par une région interdomaine non charactérizée. La présente étude rapporte la caractérisation biophysique in vitro de la région d'interaction avec les ARNs de TRBP dans l'état apo de TRBP ou dans l'état lié avec les deux precurseurs cytoplasmique successifs du microARN oncogène miR-155 comprenant la tige boucle pre-miR-155 et le duplex miR-155/miR-155* résultat du clivage de pre-miR-155 par Dicer. L'étude montre que la région d'intéraction de TRBP avec les ARNs est monomerique, est composée de deux dsRBDs independants en solution et que la région interdomaine de 60 résidus est flexible. Le premier dsRBD, non caractérisé précédement en solution est le siège d'un equilibre plié/déplié integral dans une grande gamme de conditions physico-chimiques. Les deux premiers dsRBDs de TRBP peuvent interagir avec un même precurseur de microARN et deux régions d'interaction de TRBP avec les ARNs peuvent interagir avec un même precuseur. La région d'interaction de TRBP avec les ARNs interagit avec pre-miR-155 et le duplex miR-155/miR-155* avec des affinités très similaires. Dans le complexe avec une région d'interaction de TRBP avec les ARN liée à pre-miR-155 ou au duplexe miR-155/miR-155*, aucune indice de contact entre les deux dsRBDs n'a été detecté et la protéine interagit avec les deux precurseurs par la même surface d'interaction. Les informations récoltées suggèrent que TRBP peut jouer un rôle avant et après le clivage des pre-miARN par Dicer, notamment dans le complexe de chargement de RISC.

No description available.

Myotonic Dystrophy Type I (DM1) is a multi-systemic genetic neuromuscular degenerative disease, has a prevalence in most populations of about 1:8000 and is caused by the nuclear retention of pathogenically expanded DMPK mRNA. A previous DM1 RNAi-kinome screen in our lab has identified kinases that reduced both count and area of DMPK mRNA foci in vitro. One such discovered kinase is PACT, which has showed to decrease foci count and area in DM1 fibroblasts by 30-50%. This study explored PACT as well as binding partner DICER involved in cellular RNA processing machinery, to highlight potential therapeutic targets in DM1. DM1 fibroblasts treated with PACT siRNA showed a non-significant trend of upregulation in MBNL1 mRNA and protein expression. PACT knockdown also showed trend of missplicing normalization in SERCA-1, more prominently seen in DM1-2000 human fibroblasts, whereas IR (insulin receptor) splicing remained unaffected. On the other hand, DICER knockdown did not have profound affect on foci integrity as well as MBNL1 RNA and protein xpressions in DM1 fibroblasts. SERCA-1 splicing in DICER siRNA treated samples also remained unchanged. We report here our findings in pursuit of potential therapeutic targets for the treatment of DM1.