Les nanomatériaux posent de nouvelles questions en termes de toxicologie humaine et environnementale et représentent une nouvelle interface avec le milieu biologique aux propriétés spécifiques. De nombreuses inconnues demeurent, en particulier à l’échelle moléculaire, pour permettre d’expliquer certains mécanismes de toxicité. Lorsqu’elles entrent en contact avec le milieu biologique, les nanoparticules se couvrent d’une couche de protéines adsorbées. Celle-ci leur confère une nouvelle « identité biologique » qui contrôle la réponse cellulaire et leur devenir au sein de l’organisme. Nous avons étudié l’adsorption de protéines modèles sur la silice nanostructurée. Après avoir caractérisé la silice nanoporeuse et les nanoparticules de silice utilisées, l’adsorption de la myoglobine, de l’hémoglobine et des protéines d’un extrait cellulaire de levure a été étudiée afin de déterminer les paramètres physico-chimiques et thermodynamiques de l’adsorption des protéines sur la silice. Un enrichissement en résidus basiques, regroupés en clusters de charge, favorise l’adsorption des protéines grâce à la formation d’interactions électrostatiques avec la surface chargée de la silice, indépendamment de la charge globale de la protéine. A l’inverse, un enrichissement en résidus aromatiques est défavorable à l’adsorption car ces résidus forment des interactions π-π qui rigidifient la structure de la protéine. L’identification des protéines adsorbées et non adsorbées à partir d’un milieu complexe pourrait également être utilisée pour les études de toxicité cellulaire. A partir de l’étude de la structure, de la dynamique et de l’activité de la myoglobine et de l’hémoglobine adsorbées sur les nanoparticules de silice, nous avons cherché à définir l’état d’une protéine adsorbée. L’étude de la structure, réalisée par dichroïsme circulaire, spectroscopie UV-visible, d’absorption X, infrarouge, fluorescence et microcalorimétrie, montre une perte partielle de structure importante des protéines adsorbées associée à une grande hétérogénéité de conformations, sans modification majeure de la structure de l’hème. Deux sites potentiels d’interaction entre myoglobine et nanoparticules de silice ont été identifiés à l’aide d’une technique de cartographie de surface par irradiation. L’étude de la dynamique de la myoglobine adsorbée par diffusion élastique et inélastique de neutrons a permis de montrer que l’adsorption s’accompagnait d’une diminution importante de la flexibilité de la protéine. Malgré la perte de structure, la metmyoglobine adsorbée conserve une activité de fixation de ligands très proche de celle de la protéine libre. L’hémoglobine adsorbée présente de façon inattendue une augmentation de son affinité pour l’oxygène et une diminution de sa coopérativité, sans dissociation du tétramère. Cet effet est reproductible lors de l’adsorption de l’hémoglobine humaine, de l’hémoglobine pontée DCL et de l’hémoglobine mutée S. Deux effecteurs permettent par ailleurs de moduler l’affinité de l’hémoglobine adsorbée. Aussi importantes soient-elles, les modifications de structure et d’activité observées sont entièrement réversibles après désorption dans des conditions douces. L’adsorption des hémoprotéines sur les nanoparticules de silice représente véritablement un nouveau type de stress avec résilience pour les protéines en termes de relations entre structure, dynamique et activité. / Nanomaterials raise new questions in environmental and human toxicology and represent a novel interface with specific properties with the biological medium. Several unknown remain to explain all the mechanisms of toxicity, especially at the molecular lever. When they enter the biological medium, nanoparticles get covered by a protein corona. This corona yields to a new “biological identity” that controls the cellular response to nanoparticles and their fate in the organism. We studied the adsorption of model proteins on nanostructured silica. The first part is dedicated to the characterization of nanoporous silica and silica nanoparticles that we used. Then the adsorption of myoglobin, hemoglobin and protein mixture from yeast cells was studied to determine the thermodynamic and physical-chemical parameters of protein adsorption on silica. The enrichment of basic residues, gathered in charge clusters, favors the adsorption of proteins by the formation of electrostatic interactions with the charged surface of silica, independently of the global charge of the protein. On the contrary, the enrichment in aromatic residues is unfavorable to protein adsorption because they form π-π interactions that rigidify the protein structure. The identification of adsorbed and non-adsorbed proteins from a complex medium could also be used for cellular toxicity studies. From the study of the structure, the dynamics and the activity of myoglobin and hemoglobin adsorbed on silica nanoparticles, we tried to define the state of an adsorbed protein. The structural study, based on circular dichroism, fluorescence, infrared, X-ray and UV-visible spectroscopy and microcalorimetry, shows a substantial partial structure loss of adsorbed proteins together with a high conformational heterogeneity, without major modifications of the heme structure. Two potential interaction sites of myoglobin with silica nanoparticles have been identified by a footprinting technique. The study of adsorbed myoglobin dynamics by elastic and inelastic neutron scattering highlighted the important decrease of protein dynamics that occurs upon adsorption. However, despite the structure loss, adsorbed metmyoglobin retains almost all of its activity of ligand binding. Unexpectedly, adsorbed hemoglobin shows an increase of its oxygen affinity and a decrease of its cooperativity, without any dissociation of the tetramer. This effect can be reproduced on human hemoglobin, cross-linked DCL hemoglobin and variant S hemoglobin. Besides, two effectors allow modulating the affinity of adsorbed hemoglobin. Despite the extent of structural and activity changes, all these modifications are entirely reversible upon desorption in soft conditions. The adsorption of hemoproteins on silica nanoparticles depicts a new sort of stress with resilience for proteins in terms of structure, dynamics and activity relationship.

Le travail présenté dans ce manuscrit est l'aboutissement de trois différents projets sur le couplage entre la mécanique et la croissance. Le premier chapitre est une revue concernant la mécanique et l'élongation des cellules à parois, où l'accent est placé sur les travaux numériques. Le deuxième chapitre présente quelques modèles de la mécanique du développement avec plus de détails techniques. Le troisième chapitre est une étude de l'établissement et de la stabilisation de la polarité chez les spores de la levure à fission, un phénomène qui repose sur un couplage entre mécanique, polarité, et croissance. Le quatrième chapitre est une étude numérique d'un modèle chimio-mécanique de phyllotaxie chez les plantes. Les motifs d'hormone de croissance sont créés par l'intermédiaire d'une rétro-action entre la mécanique des cellules et le transport polaire de cette hormone. Nous nous sommes demandé si le champ à l'origine de la rétro-action est la déformation ou la contrainte, une question ignorée dans la plupart des travaux sur le couplage entre mécanique et biochimie. Le cinquième chapitre concerne aussi un couplage entre polarité et mécanique. Nous étudions la manière dont la contrainte générée par la croissance ou la courbure des tissus peut se substituer aux indications géométriques qui orientent les divisions cellulaires à l'apex de la tige. / The work presented here is the result of three different projects about the coupling of mechanics and growth. The first chapter is a review about mechanics and elongation of walled cells, focused on the computational studies. The second chapter presents some models of the mechanics of development with more technical details. The third chapter is a study of the establishment and stabilization of polarity in fission yeast spores, a phenomenon that relies on a coupling between mechanics, polarity, and growth. The fourth chapter is the computational study of a chemomechanical model of plant phyllotaxis. Patterns of growth hormone are achieved thanks to a feedback with cell mechanics and polar transport. We focused our attention on the question of stress- or strain-sensing, ignored in most other studies of the interaction between biochemistry and mechanics. The fifth chapter is also about a coupling between polarity and mechanics. We investigate how the mechanical stress generated by growth or curvature of the tissues can override the geometrical cues to orient the cell divisions in the shoot apical meristem.

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La possibilité d'utiliser une nouvelle méthodologie pour l'échange de liaisons peptidiques dans des conditions aérobiques et biocompatibles a été étudiée. Nous décrivons l'optimisation de la ligation chimique native combinatoire dynamique (dynNCL) au niveau d'un résidu N-méthylcystéine en utilisant des peptides modèles. Nous employons en outre cette méthode optimisée pour le criblage de bibliothèques de peptides combinatoires dynamiques en présence et en l'absence d'un gabarit de type anticorps. L'effet que l'incorporation d'une jonction dynamique au sein de ligands non-anticorps a sur l'affinité a également été étudié. Nous proposons que dynNCL peut être utilisé pour la conception d'une nouvelle classe de séquences pouvant potentiellement conduire au premier exemple d'épissage de protéines artificielles. / The possibility to use a new methodology for peptide bond exchange in aerobic biocompatible conditions has been investigated. We describe the assay optimization of dynamic combinatorial native chemical ligation (dynNCL) at the N-methyl-cysteine residue using model peptides. We further employ this optimized method for the screening of dynamic combinatorial peptide libraries in the presence and the absence of an antibody template. The effect that dynamic junction incorporation into non-antibody ligands has upon affinity was also studied. We propose that dynNCL can be used for the creation of a new class of designer sequences which can potentially provide the first example of artificial protein splicing.

Ce travail est constitue de deux parties indépendantes. Par mutagenese dirigée et expression dans des fibroblastes en culture, il a ete possible d'étudier 30 mutants du produit de classe ii du mhc murin, a#k. Ces mutants ont ete testes par reconnaissance par des anticorps monoclonaux, par présentation d'antigènes peptidiques et par présentation du superantigenes. L'allure générale du site de fixation de l'antigène correspond a celle observée dans la structure cristalline d'une molécule de classe i. Les résultats ont aussi permis de déterminer les résidus ayant une influence critique sur la fixation de l'antigène. Enfin, l'étude de la présentation des superantigenes montre que ceux-ci ne sont pas fixes de manières analogues aux antigènes peptidiques. Le faible nombre de molécules de certaines espèces moléculaires impliquées dans les mécanismes réglant l'expression génétique pose le probleme du modèlé cinétique pertinent dans ce type de conditions. Il faut renoncer a la notion de concentration et munir le modèle d'un espace d'états discret. Le déterminisme des réactions doit aussi être abandonne au profit d'une évolution stochastique. La deuxième partie du travail s'attache a la définition mathématique des processus de saut représentant un système de réactions chimiques entre espèces présentes en très faibles quantités. Une équivalence avec les systèmes différentiels de la cinétique déterministe est établie. Un modèle de transport avec saut est aussi défini. Il permet de traduire les situations dans lesquelles des évolutions aléatoires et déterministes de déroulent conjointement. Enfin, ces constructions ont nécessité un travail préalable de nature algébrique. Une analyse stoechiometrique détaillée de l'operon lactose, des étapes précoces du développement du phase ainsi que de la réplication des plasmides de la famille cole1 est conduite. Sa généralisation est envisagée

Chez les métazoaires, la coquille des mollusques constitue un objet d'étude de référence pour comprendre les phénomènes de formation des biominéralisations carbonatées. La coquille, sécrétée par l'épithélium minéralisant du manteau, est constituée à plus de 95% de carbonate de calcium - calcite et/ou aragonite, et de moins de 5% d'une matrice organique composée de protéines, de glycoprotéines et de polysaccharides. Cette matrice calcifiante est directement impliquée dans les processus de formation du biominéral. Ce travail de thèse consiste en l'étude de la matrice organique associée à la couche nacrée. Chez les mollusques, la nacre est présente dans les coquilles de certains représentants actuels des bivalves, des gastéropodes, des céphalopodes, mais aussi des monoplacophores. La très grande majorité des données publiées sur les constituants macromoléculaires des matrices associées à la nacre concerne exclusivement les genres Pinctada et Pinna, pour les bivalves, et le genre Haliotis, pour les gastéropodes. Ce travail met en œuvre une approche comparative de ces composés à travers la caractérisation biochimique des matrices de deux nouveaux modèles. Nous considérons que cette approche comparative nous permettra de proposer de nouvelles hypothèses quant aux mécanismes de formation de la nacre, mais également quant à l'évolution de ces constituants organiques au sein des mollusques nacriers. Le premier modèle étudié est le mollusque d'eau douce Unio pictorum, un bivalve à coquille nacro- prismatique très commun des cours d'eau bourguignons. La matrice organique acido-soluble extraite de la couche nacrée présente une activité enzymatique de type anhydrase carbonique, une enzyme essentielle aux processus de calcification, déjà observée par ailleurs chez Pinctada sp.. Des électrophorèses réalisées en conditions dénaturantes sur cette matrice acido-soluble montrent la présence de cinq protéines majoritaires de masses moléculaires apparentes 95, 50, 29, 16 et 12 kDa. L'étude de la glycosylation de ces protéines nous a montré que les protéines de masses moléculaires 95, 50 et 29 kDa, étaient des glycoprotéines fortement glycosylées et que leurs ramifications saccharidiques étaient directement impliquées dans les processus de minéralisation. Notamment, la glycoprotéine de 95 kDa, spécifique de la couche nacrée, porte une quantité remarquable de sucres sulfatés qui sont impliqués dans sa capacité à lier les ions Ca2+ ou à interagir avec la précipitation du CaCO3 in vitro. Des séquences partielles internes ont pu être obtenues pour les différentes protéines de la matrice acido-soluble de la nacre grâce à des analyses par spectrométrie de masse. Le second modèle est le céphalopode Nautilus macromphalus dont la coquille nacro-prismatique est entièrement composée d'aragonite. Des électrophorèses de la matrice acido-soluble ont montré qu'elle est composée de polysaccharides de haut poids moléculaire, de glycoproteines migrant aux alentours de 60-50 kDa et de 3-4 protéines de masses moléculaires apparentes comprises entre 20 et 10 kDa, capables de lier le calcium in vitro. Sur gel d'électrophorèse à deux dimensions, les différents constituants organiques de la matrice acido-soluble migrent soit à des valeurs de pI très acides (inférieur ou égal à 3 unités), soit à des pI très basiques (supérieur à 9), alors que chez les autres mollusques non céphalopodes, les protéines de nacre sont faiblement acides ou neutres. Des séquences partielles de ces protéines ont été obtenues par séquençage de novo à partir de protéines purifiées par électrophorèses 2-D et de matrice complète analysées par spectrométrie de masse après digestion trypsique. Les nouvelles séquences observées présentent des similitudes avec des protéines de nacre décrites chez les bivalves Pteriomorphia, mais aucune homologie n'a pu être détectée avec les protéines décrites chez les gastéropodes. Nous avons également décrit, dans une étude préliminaire, les matrices acido-solubles extraites des coquilles de brachiopodes Rhynchonelliformea. Ce travail montre que, chez ce groupe externe aux mollusques, les mécanismes moléculaires de calcification impliquent également la production d'une matrice calcifiante composée de macromolécules aux propriétés biochimiques diverses.

La résistance bactérienne aux antibiotiques est l'un des problèmes préoccupants auquel la médecine moderne doit faire face de nos jours. Il est certain que la découverte de nouvelles familles d'antibiotiques pourrait venir à bout des souches de bactéries multirésistantes, mais pour combien de temps? Une nouvelle approche thérapeutique prometteuse apporte une solution simple et efficace à cette question en mettant de l'avant des médicaments qui empêchent l'adhésion cellulaire. D'autant plus, il se trouve que la protéine FimH des pili d'adhésion (une adhésine), chez la grande majorité des souches d'E. coli uropathogènes, possède une affinité sélective pour les dérivés mannopyrannosides. En observant les structures tridimensionnelles de complexes FimH-mannopyrannoside, on remarque trois positions potentiellement modifiables : C-l qui pointe vers l'extérieur du site d'interaction, C-2 où l'on retrouve un petit espace de forme allongée et C-6 où il y a un petit volume très court et quand même large. L'objectif est donc de synthétiser de nouveaux mannopyrannosides dans le but d'en augmenter l'affinité avec le FimH, en ajoutant ou supprimant des groupes fonctionnels aux positions C-2 et C-6. La modification de groupes en C-l a déjà été largement explorée au sein du laboratoire Roy, en grande partie par le docteur Mohamed Touaibia. Ainsi, la synthèse au laboratoire a mené d'abord à une série d'α-D-mannopyrannosides de méthyle O-alkylés en C-2. Par la suite, deux séries ont été synthétisées: les α-D-mannopyrannosides de méthyle, puis des α-D-mannopyrannosides d'allyle, toutes deux ayant des groupements sulfates ou phosphates en C-6. Une dernière série, les α-D-rhamnopyrannosides d'allyle qui portent soit un atome d'hydrogène ou de fluor à la place de l'alcool en C-6. En cours de route, a été également synthétisé un α-D-mannopyrannoside d'allyle fluoré en C-2. D'un autre côté, la modélisation moléculaire comme outil de visualisation et de prédiction des interactions protéine-ligand a permis d'établir un modèle de relation quantitative entre la structure et l'activité (QSAR) de différents mannopyrannosides. Les tests biologiques d'inhibition permettent d'évaluer l'efficacité réelle des ligands en donnant la valeur de constante de dissociation (Kd). Finalement, l'étude in silico des interactions protéine-ligand aide l'orientation de la synthèse de nouveaux mannopyrannosides qui possèdent un potentiel inhibiteur de l'adhésine FimH chez E. coli, et ce, tout en écartant la possibilité de développement de résistance aux antibiotiques. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : algorithme génétique, D-mannose, Escherichia coli, FimH, infections urinaires, interactions protéine-sucre, QSAR, résistance bactérienne aux antibiotiques.

Les protéines GRA sont sécrétées par le parasite intracellulaire Toxoplasma gondii dans la vacuole parasitophore, où elles interagissent pour la plupart avec deux systèmes de membranes tubulaires : les tubules séquestrant des organites de l'hôte (HOSTs) et le réseau de nanotubes membranaires (RNM). Bien que la plupart des protéines GRA contiennent des domaines transmembranaires potentiels, elles sont sécrétées sous des formes solubles et ne s'associent à des membranes qu'une fois qu'elles ont atteint leurs membranes-cibles dans la vacuole. Cette propriété inhabituelle nous a amenés à les considérer comme des modèles intéressants pour l'étude d'interactions protéinemembrane. J'ai développé deux approches expérimentales pour étudier les interactions des protéines GRA, extraites du parasite ou de la vacuole, avec des membranes-modèles. Premièrement, des approches biochimiques m'ont amenée à caractériser les formes de solubilisation des protéines GRA et leur association avec les membranes des petites vésicules unilamellaires (SUVs). Deuxièmement, j'ai développé une approche par spectroscopie de fluorescence, de protéines GRA associées aux membranes de vésicules unilamellaires géantes (GUVs). Les résultats fournissent des éléments de réponse qui (1) aident à décrypter le trafic des protéines dans le parasite et dans la vacuole et (2) ouvrent la voie pour la mise en place d'un système in vitro pour l'étude de la maturation de la vacuole parasitophore et de ses membranes tubulaires internes.

Chez le tabac, les trichomes glandulaires sécréteurs (TGSs) sont des structures pluricellulaires où s'effectuent la synthèse et la sécrétion de nombreux composés volatiles. Cette production spécifique dans les TGSs est la conséquence de la spécificité de l'expression transcriptionnelle des gènes des Terpènes synthases. Les promoteurs de ces gènes sont intéressants parce qu'ils peuvent être utilisés en bioingénieurie pour produire des biomolécules à forte valeur ajoutées (taxol, l'artémisinine) dans TGSs. L'un d'eux, le promoteur de la Cembratriène-diol-synthase (P1.1NsTPSO2a), actif dans les cellules de têtes des TGSs, a été isolé et transfecté dans N.sylvestris. L'analyse par délétions de P1.1NsTPSO2a a montré que deux fragments, 4c (100pb) et 400c (360 pb) sont importants pour l'expression spécifique dans les têtes de trichomes. La région 4c a été placée en amont du promoteur 35S minimum (-46) et du gène rapporteur GUS. Nous avons démontré que 4c est nécessaire et suffisant pour une expression dans les têtes de TGSs. Le fragment 400c pourrait jouer un rôle dans la répression du P1.1NsTPSO2a dans les cellules épidermiques et dans certaines parties des racines. Enfin, nous avons isolé par crible simple-hybride dans la levure un facteur de transcription putatif du trichome (NsZnF) pouvant reconnaître le fragment 400c. NsZnf appartient à la famille des facteurs de transcription GATA-ZincFinger III. Cette protéine possède un doigt de zinc, un domaine CCT et un domaine TIFY. L'expression transitoire dans N.benthamiana montre une localisation nucléaire de NsZnf compatible avec son rôle de facteur de transcription.