Le traitement des infections dues aux bactéries multirésistantes aux antibiotiques est un défi médical majeur du 21ème siècle. Ce défi a incité la recherche de cibles ayant des fonctions essentielles pour le développement de nouveaux antibiotiques. Les enzymes de la voie FASII, responsables de la synthèse des acides gras (AG), sont considérées comme essentielles et de nombreux antibiotiques, appelés anti-FASII, ont été développés pour lutter contre des pathogènes du phylum des Firmicutes. Cependant, notre laboratoire a montré que plusieurs pathogènes contournent l’inhibition des anti-FASII par l’utilisation des AGs exogènes abondants chez l’hôte (sang, organes, aliments). Ce contournement compromet l’utilisation des anti-FASII en traitement. Le statut du pathogène majeur, Staphylococcus aureus, est néanmoins resté en débat. Il synthétise un AG non disponible chez l’hôte, et donc, d’après la littérature, ne pourrait pas être compensé. La question de cette thèse est de comprendre les mécanismes utilisés par S. aureus lui permettant de contourner les anti-FASII. Deux mécanismes sont mis en évidence: I- Des mutations à haute fréquence du gène fabD surviennent et permettent à la bactérie d’utiliser des AGs exogènes. Ce type de mutation favorise la disponibilité de la protéine ACP permettant l’utilisation des AGs exogènes. II- Une stratégie sans mutation décelable survient en présence de fluides hôtes tels que le sérum. Elle comprend une première étape de "dormance" d’environ 8 à 10 heures pendant laquelle des AGs sont incorporés. Durant cette adaptation les bactéries semblent bloquées dans la division cellulaire, et subissent des changements morphologiques. Cette étape est suivie par une reprise de croissance « normale » où S. aureus utilise librement des AGs exogènes et reste insensible aux anti-FASII. Dans nos conditions, une étude microscopique « time-lapse », a permis de visualiser qu’environ 3% de la population bactérienne adaptée aux anti-FASII émerge. Nos résultats pointent vers un mécanisme d’adaptation dans lequel le sérum diminuerait le stress bactérien et augmenterait ainsi la disponibilité de l’ACP et des AGs exogènes, facilitant leur utilisation pour la synthèse des phospholipides. Les AGs exogènes peuvent donc remplacer totalement les endogènes. Ce résultat va à l’encontre de l’hypothèse couramment acceptée qu’un AG endogène de S. aureus est conservé et essentiel. Nous avons poursuivi cette étude par des analyses protéomiques et par le criblage d’une banque de 2000 mutants de S. aureus en cherchant des loci impliqués dans l’adaptation aux anti-FASII. Des fonctions de la réponse au stress, la division cellulaire et le métabolisme des lipides semblent être impliqués dans cette adaptation. Pour conclure, cette étude a permis de clarifier les étapes impliquées dans la réponse adaptative de S. aureus aux anti-FASII. Même si nos résultats prouvent que S. aureus contourne les anti-FASII, une approche combinatoire pourrait être envisagée où l’anti-FASII serait couplé avec un deuxième inhibiteur qui bloquerait sa capacité à sortir de la dormance. / Treatment of infections caused by multidrug-resistant bacteria is a major medical challenge of the 21st century, which has stimulated the search for essential bacterial functions as potential antimicrobial drug targets. The fatty acid synthesis (FASII) pathway enzymes are considered essential, and numerous antibiotics called (anti-FASII), have been developed to eliminate pathogens of the Firmicutes phylum. However, our laboratory has shown that several pathogens bypass FASII inhibitors by incorporating exogenous fatty acids (FAs), which are abundant in the host (in blood, organs and foods). FASII bypass thus compromises the use of FASII-based antibiotics. The status of the major pathogen, Staphylococcus aureus, has remained in debate. S. aureus synthesizes an FA not produced by the host and according to the literature, is required and would not be available in the host. However, work in my lab showed that indeed bypasses FASII. The goal of my research project is to understand the mechanisms used by S. aureus to bypass FASII antibiotics. Two mechanisms are highlighted: I- High frequency mutations of the fabD gene allow S. aureus to use exogenous FAs; our study indicates that higher availability of ACP in these mutants facilitates FA utilization. II- A strategy without detectable mutation occurs in the presence of host fluids such as serum. It comprises a first "dormancy" step of about 8 to 10 hours, followed by outgrowth; FAs are incorporated throughout these steps. The latency phase appears to be due to a division block, during which cells undergo morphological changes. During "normal" growth recovery, S. aureus freely uses exogenous FAs and remains insensitive to anti-FASII. Using « time-lapse » microscopic study, we showed in our test conditions that about 3% of the bacterial population adapted to FASII antibiotics. Ours results point to an adaptation mechanism in which serum decreases bacterial stress, leading to increased availability of ACP and exogenous FAs. These substrates can then be used for phospholipid synthesis. These results resolve the debate by showing that S. aureus can replace endogenous FAs with exogenous FAs when FASII is blocked. Contrary to current dogma, FASII is not essential in S. aureus. To identify the loci involved in adaptation to anti-FASII, we performed proteomic analyses and also screened a S. aureus mutant library. Functions of stress response, cell division, and lipid metabolism appear to be involved in this adaptation. To conclude, this study clarified the steps leading to S. aureus adaptation to FASII antibiotics. Although our results show that S. aureus bypasses anti-FASII, a combinatorial approach could be considered in which FASII antibiotics could be coupled to a second inhibitor that would prevent exit from the dormancy.

M42 aminopeptidases are dinuclear enzymes widely found in prokaryotes but completely absent from eukaryotes. They have been proposed to hydrolyze peptides downstream the proteasome or other related proteolytic complexes. Their description relies mainly on the pioneering work on four M42 aminopeptidases from Pyrococcus horikoshii. Their quaternary structure consists of twelve subunits adopting a tetrahedral-shaped structure. Such a spatial organization allows the compartmentalization of the active sites which are only accessible to unfolded peptides. The dodecamer assembly results from the self-association of dimers under the control of the metal ion cofactors. Both oligomers have been shown to co-exist in vivo and heterododecamers with broadened substrate specificity may even occur. Yet, the molecular determinants behind the dodecamer assembly remain unknown due the lack of a high-resolution structure of a stable dimer. In addition, the bacterial M42 aminopeptidases are still ill-described due to the paucity of structural studies. This work focuses mainly on the characterization of TmPep1050, an M42 aminopeptidase from Thermotoga maritima. As expected, TmPep1050 adopts the genuine tetrahedral-shaped structure with twelve subunits. It also displays a leucyl-aminopeptidase activity requiring Co2+ as a cofactor. In addition to its catalytic function, Co2+ has a role in the enzyme thermostability and oligomerization. The absence of Co2+ provokes the disassembly of active TmPep1050 dodecamers into inactive dimers. The process, however, is reversible since Co2+ triggers the self-association of dimers into dodecamers, as shown by native MS. The main achievement of this work is the determination of the first high-resolution structure of a dimer, allowing to better understand the dimer-dodecamer transition. Several structural motifs involved in oligomerization are displaced or highly flexible in the TmPep1050 dimer structure. Furthermore, a loop bringing two catalytic relevant residues is displaced outside the catalytic site. These residues are the catalytic base and a ligand involved in the Co2+ binding at the M1 site. The metal ion binding sites have been further investigated to define how they influence the oligomerization of TmPep1050. A mutational study shows that the M1 site strictly controls the dodecamer formation while the M2 site contributes only partly to it. A strictly conserved aspartate residue of the M2 site second shell also plays an important structural role in maintaining the active site integrity. Indeed, its substitution prevents the formation of dodecamer probably due to the lack of stabilization of the active site loop. The characterization of TmPep1050 supports that bacterial M42 aminopeptidases probably share the quaternary structures and dodecamer assembly with their archaeal counterparts. The dimer structure highlights several structural modifications occurring in the dimer-dodecamer transition. Yet, based on current knowledge, no general rules can be drawn for the role of the M1 and M2 sites in oligomerization. Besides, the physiological function of the M42 aminopeptidases is under-examined albeit the proposed link to the proteasome. In this work, this has been investigated using the Escherichia coli M42 aminopeptidases as a model. Yet, no phenotype has been associated to the deletion of their coding genes. Preliminary results have shown that the three enzymes (i) display a redundant substrate specificity, (ii) could be localized partly to the membrane, and (iii) form heterocomplexes. Further experiments are still required to crack the function of these M42 aminopeptidases. / Option Biologie moléculaire du Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les complexes de métaux de transition, et plus particulièrement de ruthéniumII, ont connu un essor formidable depuis le milieu des années 1950 avec la découverte du complexe [Ru(bpy)3]2+. Depuis lors, de nombreuses recherches et découvertes ont permis de mettre au point un schéma photophysique prototypique pour les complexes de ruthéniumII comportant des ligands polypyridiniques. En variant la nature des ligands complexés à ce centre métallique, il a été possible de faire varier les propriétés photophysiques, photochimiques et électrochimiques des complexes résultants. Toutes ces modifications ont permis de mettre au point des complexes de ruthéniumII qui possèdent des applications dans des domaines variés. Ils sont par exemple utilisés dans le domaine de la photo-conversion d’énergie solaire ou dans le domaine de la photo-catalyse, permettant notamment de scinder l’eau en oxygène, ou de produire du dihydrogène au départ de protons. Ces complexes de ruthéniumII sont également utilisés dans le domaine biologique où ils peuvent interagir avec l’ADN via de nombreux processus. Les recherches au laboratoire de chimie organique et photochimie de l’Université libre de Bruxelles ont été concentrées sur le développement de ligands polyazaaromatiques qui possèdent un caractère π-accepteur prononcé. L’utilisation de tels ligands permet d’accéder à des complexes de ruthéniumII dont le caractère photo-oxydant est davantage prononcé que celui de leurs analogues de type [Ru(bpy)3]2+. Ce caractère photo-oxydant permet, dans le cadre d’applications biologique, d’induire la formation d’un photo-adduit résultant d’un transfert d’électron entre la guanine, base la plus réductrice de l’ADN, et le complexe de ruthéniumII. <p>Les ligands π-accepteurs permettent également de diriger et de localiser le transfert d’électron à l’état excité. Lorsque le complexe absorbe un rayonnement lumineux de bonne énergie, un électron peut être transféré du centre de ruthéniumII vers un des ligands ancillaires. Ce transfert d’électron aura lieu vers le ligand qui est le plus avide en électrons. Ce phénomène trouve des applications directes en photo-conversion d’énergie solaire. En effet, afin de convertir de l’énergie solaire, il est important d’absorber le rayonnement lumineux, mais également de pouvoir transférer cette énergie en un lieu donné. L’utilisation de ligands avides en électrons permet donc de diriger cette énergie en un lieu précis. <p>Dans le cadre de cette thèse de doctorat, nous nous sommes focalisés sur la synthèse de nouveaux ligands polyazaaromatiques qui devraient conférer des propriétés inédites aux complexes résultants. La première partie de cette thèse de doctorat a donc consisté à synthétiser des ligands polyazaaromatiques possédant un plan aromatique étendu. Nous avons mis au point une voie de synthèse pour obtenir des ligands tels que la 1,4,5,8-tétraazaphénanthrène-9,10-dione, précurseur du ligand 1,4,5,8-tétraazaphénanthrèno[9,10-b]1,4,5,8,9,12-hexaazatriphénylène (TAPHAT). Au cours de la synthèse de la 1,4,5,8-tétraazaphénanthrène-9,10-dione, nous avons également pu mettre au point une nouvelle méthode d’oxydation de noyaux de type quinoxaline à l’aide de dérivé d’iode hypervalent. Une fois la synthèse du ligand TAPHAT et des différents précurseurs effectuée, nous avons pu procéder à la synthèse des complexes de ruthéniumII. Le ligand TAPHAT, étant fortement insoluble et possédant quatre sites de chélation, nous avons décidé de procéder à la synthèse de complexes précurseurs pour préparer des complexes porteurs de ce ligand. Nous avons dès lors tenté d’obtenir les complexes précurseurs [Ru(TAP)2(diNH2TAP)]2+ et [Ru(TAP)2(tapdione)]2+. La synthèse de ces précurseurs a présenté de nombreux problèmes de chélation, donnant lieu cependant à des complexes très intéressants. Face à ces problèmes, nous nous sommes donc uniquement focalisés sur la synthèse du [Ru(TAP)2(diNH2TAP)]2+. Ce complexe précurseur a ensuite permis d’accéder à des complexes tels que le [Ru(TAP)2(HATPHE)]2+. Les complexes à base du ligand 9,10-diamino-1,4,5,8-tétraazaphénanthrène, à savoir le [Ru(TAP)2(diNH2TAP)]2+ et le [Ru(phen)2(diNH2TAP)]2+ ont ensuite été utilisés pour accéder aux complexes mono- et binucléaires symétriques du TAPHAT. Nous avons ensuite étudié les complexes à base du ligand PHEHAT ainsi que ceux à base du ligand TAPHAT et comparé leurs propriétés photophysiques, photochimiques et électrochimiques. <p>En plus de ces complexes à base de ligands PHEHAT et TAPHAT, nous avons également eu l’occasion de synthétiser des ligands analogues au ligand DPPZ. Nous avons synthétisé deux ligands plus étendus que le DPPZ, à savoir le DPQQX, dont la synthèse avait déjà été rapportée dans la littérature, et le PDPPZ. Bien que les complexes à base du ligand PDPPZ n’aient pas pu être purifiés au cours de cette thèse, nous avons tout de même pu obtenir les complexes [Ru(TAP)2(DPQQX)]2+ et [Ru(phen)2(DPQQX)]2+. Les études photophysiques, photochimique et électrochimiques ont permis de mettre en évidence de nombreuses propriétés intéressantes. De plus, des études poussées en résonance magnétique nucléaire 1H ainsi qu’en dichroïsme circulaire ont permis de montrer un processus d’auto-assemblage en solution. <p>Finalement, en plus de la synthèse de ligands polyazaaromatiques et de leurs complexes de ruthéniumII, nous avons également exploité la technique d’absorption transitoire dans le cadre d’une collaboration avec le laboratoire de résonance magnétique nucléaire. Cet axe de recherche s’est articulé autour de l’utilisation de deux complexes de ruthéniumII à savoir le [Ru(TAP)3]2+ et le [Ru(TAP)2(HAT)]2+. Ces complexes sont capables, sous illumination, de réaliser un transfert d’électron avec un réducteur. Ces processus de transfert d’électron photo-induit entre des réducteurs tels que la GMP, la N-acétyl-tyrosine, l’hydroquinone et les deux complexes de ruthéniumII ont été étudiés par les membres du laboratoire de résonance magnétique nucléaire à l’aide d’une technique dite Photo-Chemically Induced Dynamic Nuclear Polarization (Photo-CIDNP). Notre contribution a été d’investiguer les paramètres de quenching entre ces complexes et les différents réducteurs à l’aide de techniques classiques telles que la détermination de constantes de quenching via des analyses de type Stern-Volmer ainsi qu’à l’aide de techniques plus pointues telles que la photolyse éclair laser. <p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Notre recherche se divise en deux parties distinctes. La première est issue d’une collaboration avec le Laboratoire de Chimie Organique et Photochimie de l’ULB des Pr. A. Kirsch-De Mesmaeker et C. Moucheron. Les travaux de ce groupe consistent à utiliser des complexes de Ru(II) polyazaaromatiques comme drogues photoactivables ou comme agents de diagnostic dans des systèmes biologiques. Cependant à cause de leur grande hydrophilie, ces complexes de Ru(II) ne peuvent pas pénétrer les membranes cellulaires, ce qui complique leur utilisation comme drogues photoactivables. <p>Afin d’améliorer cette pénétration cellulaire, deux stratégies ont été développées dans le cadre de cette collaboration. La première consistait en la synthèse et l’étude de deux nouveaux complexes de Ru(II) possédant des N,N-ligands facilement fonctionnalisables :[Ru(TAP)2btz]2+ et [Ru(TAP)2pytz]²+. Les études électrochimiques et photophysiques ont montré que l’état ³MLCT de ces complexes était un excellent agent oxydant. Ces complexes pourraient donc photo-réagir avec une guanine pour former un photo-adduit. Néanmoins, une étude photophysique plus détaillée a montré que l’état excité du complexe [Ru(TAP)2pytz]²+ possédait une durée de vie plus longue que celui du [Ru(TAP)2btz]2+. Par ailleurs, le [Ru(TAP)2pytz]²+ est plus photostable dans l’eau que le [Ru(TAP)2btz]2+. Seul, le complexe de Ru(II) constitué de deux ligands TAP et d’un ligand pytz facilement fonctionnalisable pourrait donc être utilisé pour photo-réagir avec des biomolécules dans l’eau.<p>La deuxième stratégie concernait la synthèse et l’étude de complexes de Ru(II) à partir de ligands dérivés de calix[4 ou 6]arènes. Des stratégies de synthèses originales ont été mises au point pour greffer une unité phen ou pytz sur des calix[4 ou 6]arènes mono-fonctionnalisés. Par la suite, des antennes de reconnaissance cellulaire (sucres) ont été introduites sur les positions phénoliques restantes des calixarènes dans le but d’effectuer une vectorisation ciblée. Pour cela, l’alkylation des positions phénoliques par des groupes azido a été mise au point. Ces groupes azido ont alors été mis en réaction avec des sucres possédant une fonction alcyne afin d’obtenir des ligands multivalents. Après, une réaction de complexation avec les précurseurs métalliques de Ru(II), ces différents ligands ont conduit aux nouveaux complexes calix[4 ou 6]arène-Ru(II) désirés.<p>Les propriétés électrochimiques et photophysiques des différents complexes de Ru(II) ont ensuite été étudiées. L’état ³MLCT des différents complexes est un excellent agent oxydant. Cependant, l’étude des propriétés photophysiques a montré que seul le complexe [(TAP)2Rupytz’(diN3C6)2+ était un candidat potentiel pour photo-réagir avec des biomolécules. En effet, un quenching des durées de vie a été observé pour les complexes de Ru(II) possédant des groupes phénol. Il est probablement provoqué par un transfert d’électron intramoléculaire du phénol vers l’état excité du complexe. Un quenching de luminescence a également été observé avec le complexe [(TAP)2Ruphen’(trisN3C4)2+ qui est probablement dû à un TE intramoléculaire du complexe excité vers le groupe azido. Le complexe multivalent n’a pas pu être étudié dans le cadre de ce travail mais il devrait être intéressant pour photo-réagir avec une biomolécule. <p>La seconde partie de ce travail est le fruit d’une collaboration avec le Laboratoire de Matière Condensée et de Systèmes Electroactifs (équipe des Dr. P. Hapiot et C. Lagrost, UMR 6510, Université de RENNES 1) et avec le Pr. O. Reinaud (Laboratoire de Chimie et Biochimie pharmacologiques et toxicologiques, UMR 8610, Université Paris Descartes). <p>Our research is divided into two distinct parts. The first part was developed in collaboration with the Laboratory of Organic Chemistry and Photochemistry of the Professors Andrée De Mesmaeker and Cécile Moucheron (ULB). The research topic of this group consists in using polyazaaromatic Ru(II) complexes as potential drugs in anti-cancer therapy or as diagnostic agents in biological systems. However, because of their high hydrophilicity, these Ru(II) complexes can not penetrate cell membranes which prevents their use as photoreactive drugs.<p>In order to enhance the cellular uptake, two strategies have been developed in the frame of this collaboration. The first one has consisted in the synthesis and study of two new Ru(II) complexes from N,N-ligands that can be readily functionalized: [Ru(TAP)2btz]2+ and [Ru(TAP)2pytz]²+. The photophysical and electrochemical studies have shown that both complexes behave as excellent oxidizing agents in their ³MLCT state. Thus, these complexes could photo-react with a guanine to form a photo-adduct. However, a more detailed examination of the photophysical parameters has shown that the excited state lifetimes of the complex [Ru(TAP)2pytz]²+ is longer than that of [Ru(TAP)2btz]2+. Moreover, the [Ru(TAP)2pytz]²+ is more photostable in water than the [Ru(TAP)2btz]2+. So, the Ru(II) complex obtained by the combination of two TAP ligands and one functionalized pytz ligand is an attractive photoreagent for biomolecules.<p>The second strategy has involved the synthesis and study of Ru(II) complexes from ligands based on calix[4 or 6]arenes. Original strategies have been developed to graft one phen or pytz unit on mono-functionalized calix[4 or 6]arenes. Subsequently, cellular recognition subunits (sugars) were introduced on the phenolic positions of calixarenes in order to perform a targeted vectorization. For this, the alkylation of phenolic positions by azido groups has been developed. These azido groups were then reacted with alkyne-glycoside to obtain multivalent ligands. After a complexation reaction with Ru(II) precursors, these ligands have led to new calix [4 or 6] arene-Ru(II) complexes. <p>Then, the photophysical and electrochemical properties of the different Ru(II) complexes were studied. The various complexes are sufficiently oxydizing in their ³MLCT. However, the study of their photophysical properties has shown that only the complex [(TAP)2Rupytz'(diN3C6)2+ could be a potential candidate to photo-react with biomolecules. Indeed, a quenching of lifetimes has been observed for the Ru(II) complexes with phenolic groups. It is probably due to an intramolecular electron transfer from the phenolic groups to the excited state of the complex. A luminescence quenching was also observed with the complex [(TAP)2Ruphen'(trisN3C4)]2+ probably because of an intramolecular electron transfer from the excited complex to the azido group. The multivalent complex has not been studied but it should be a valuable candidate to photo-react with a biomolecule. <p>The second part of this work is the result of a collaboration with the Laboratory of Condensed Matter and Electroactive Systems (Doctors Philippe Hapiot and Corinne Lagrost team, UMR 6510, Université de Rennes 1) and With the Professor Olivia Reinaud (Laboratory of Chimie et Biochimie pharmacologiques et toxicologiques, UMR 8610, Université Paris Descartes). / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La création de nouvelles fonctions basées sur la reconnaissance protéique et sur l'assemblage de domaines est un enjeu majeur en biotechnologie et est un moyen de comprendre les relations structures/fonctions des protéines engagées dans des processus d'interactions. Aujourd’hui, des bibliothèques de protéines artificielles obtenues par ingénierie peuvent être sources de protéines aux propriétés de reconnaissance analogues à celles des dérivés d’anticorps.L’équipe Modélisation et Ingénierie des Protéines a ainsi construit une banque de protéines à motifs structuraux répétés appelées « alphaReps ». Les alphaReps présentent des propriétés remarquables en termes de production et de stabilité. Contrairement à la plupart des anticorps et dérivés d’anticorps, elles peuvent même s’exprimer sous forme fonctionnelle dans le cytoplasme de cellules eucaryotes. De tels objets peuvent donc maintenant être utilisés comme des briques élémentaires en vue d’une ingénierie modulaire. Ainsi la construction de nouvelles fonctions de reconnaissance optimisées tant au niveau de la spécificité que de l’affinité sera possible en réarrangeant et/ou dupliquant ces briques élémentaires.Un premier volet de ce projet de thèse a consisté à construire puis étudier les propriétés biophysiques de protéines bidomaines basées sur les alphaReps afin de mieux comprendre les comportements adoptés par de telles constructions. Outre l’aspect fondamental de cette question, cette étude donnera « les règles » pour moduler de façon contrôlée les interactions entre ces protéines. Les résultats montrent qu'il est possible de créer de nouvelles fonctions par simple ajout d'un linker entre deux alphaReps : avidité, coopérativité, changement de conformation.Dans un second temps, l’objectif a été de développer, à partir des protéines bidomaines précédemment étudiées, de nouveaux biosenseurs basés sur le FRET (Förster Resonance Energy Transfer) pouvant être utilisés in vivo et in vitro. Cette deuxième partie présente deux biosenseurs avec des limites de détection de l'ordre du nanomolaire. Les alphaReps utilisées dans ces constructions pouvant être changées en fonction de la cible souhaitée, il s'agit ici d'une preuve de concept pouvant être généralisée à n'importe quelle cible.Enfin la dernière partie de cette thèse s'est portée sur la conception et l'étude de nouveaux biosenseurs génétiquement codables. Ces biosenseurs présentent notamment l’avantage d’être utilisables immédiatement après production et ne nécessitent donc plus d’étape de couplage chimique. Les résultats obtenus montrent que la création de tels biosenseurs est possible mais qu’une optimisation reste encore nécessaire pour améliorer leur spécificité, leur stabilité et leur capacité de détection. / The creation of new protein functions based on recognition and molecular assembly is not only a major goal in biotechnology but is also a means to understand the relation structure/function of proteins involved in interaction processes. Today, libraries of artificial proteins obtained by engineering can be a source of proteins with recognition properties similar to the properties of antibodies.The team Protein Engineering and Modeling has thus created a library of proteins with structural repeats called the “alphaReps”. The alphaReps present remarkable properties in terms of production and stability. Unlike most of the antibodies and their derivatives, they can even be expressed and functional in the cytoplasm of eukaryotic cells. Such objects can therefore be used as building bricks in modular engineering. The construction of new optimized recognition functions both in specificity and in affinity can then be possible by rearranging or duplicating these elementary bricks.The first part of this thesis project consisted in the construction and study of the biophysical properties of bidomain proteins based on alphaRep in order to have a better understanding of the behaviour of such constructions. Beside the fundamental aspect of this question, this study will give the “rules” to modulate the interactions between these proteins in a controlled way. The results show that it is possible to create new functions such as avidity, cooperativity, conformational change, simply by adding a linker between two alphaReps.In a second step, the goal was to develop, with the bidomain proteins previously studied, new biosensors based on the FRET (Förster Resonance Energy Transfer) which can be used in vivo and in vitro. This second part presents two biosensors with limits of detection in the nanomolar range. Since the alphaReps used in these constructions can be changed depending on the chosen target, it is a proof of concept which can be adapted to any desired target.Finally, the third part of this thesis focused on the development of genetically codable biosensors. These biosensors have the particular advantage of being usable directly after production and therefore no longer require a chemical coupling step. The results show that the development of such biosensors is worth considering but an optimization is still required in order to improve their specificity, their stability and their detection capacity.

Le transport subcellulaire et la traduction localisée des molécules d'ARNm semble être un processus très répandu et important pour contrôler la distribution asymétrique des protéines dans les cellules. L’ARNm, Bsg25D, connu pour se localiser aux centrosomes et aux microtubules astraux dans les embryons de drosophile au cours des premiers événements d'embryogenèse, a été sélectionné pour déterminer le rôle et l'importance du ciblage de l'ARNm à l'appareil mitotique lors de la division cellulaire. La localisation de Bsg25D aux centrosomes dans les embryons de drosophile est conservée entre espèces telles que D. melanogaster, D. simulans et D. yakuba. Bsg25D encode une protéine qui est étroitement liée à la Ninein (Nin) et à la Ninein-like protein (Nlp), deux protéines associées aux centrosomes présentes dans les cellules mammifères. L’analyse structure-fonction démontre que la région codante et la région 3’UTR de Bsg25D sont nécessaires pour son ciblage. Ceci suggère qu’un élément de régulation en cis, qui favorise sa localisation se situe dans la région codante + 3’UTR. / The subcellular transport and localized translation of mRNA molecules is emerging as a highly prevalent and important process for controlling asymmetric protein distribution in cells. A candidate mRNA, Bsg25D, known to localize to centrosomes and astral microtubules in Drosophila embryos during early events of embryogenesis, was selected to determine the role and importance of mRNA targeting to the mitotic apparatus during cell division. The localization of Bsg25D to centrosomes in Drosophila embryos is conserved between species such as D. melanogaster, D. simulans and D. yakuba. Bsg25D encodes a protein closely related to centrosome-associated proteins Ninein (Nin) and Ninein-like protein (Nlp) in mammalian cells. Structure function analysis revealed that the coding and 3’UTR of Bsg25D are necessary for its targeting pattern, suggesting that a cis-regulatory motif that drives its localization, is in the coding + 3’ UTR region.

Neutrophils are critical for acute inflammatory responses initiated by infection or tissue injury. Multiple inflammatory genes and signaling pathways are activated rapidly to regulate neutrophil functions. Ikaros is a critical transcription factor involved in the regulation of myeloid cells differentiation. Transcription analysis of the hematopoietic cells in the absence of Ikaros indicates differences in expression of genes encoding signaling factors. However, the impact of Ikaros on signaling mechanisms in myeloid cells during inflammation remains to be defined. The aim of this study was to define whether the lack of Ikaros expression could perturb signaling and thereby, neutrophil function/response during inflammation. We studied purified neutrophils from the bone marrow of WT and Ikaros+/- mice. We found that the expression level of Ikaros is important and governs neutrophil apoptosis, NETosis, myeloperoxidase activity and ROS production in response to bacterial DNA. We also performed in vivo experiments using a mouse model of severe pneumonia. We show that partial deletion of Ikaros (Ikaros+/- mice) is associated with impaired elimination of bacteria. To define how the crippled expression of Ikaros could affect signaling in neutrophils, we performed a high-throughput microarray to identify variations in protein kinase activity. The microarray data suggest that multiple signaling pathways, including the P38 MAPK pathway, could be affected by Ikaros. Accordingly, we employed selective kinase inhibitors to further define the importance of these kinases in neutrophil function. Finally, our results indicate the critical role of Ikaros in the regulation of Toll Like Receptor 4 and 9 as well as the cytosolic DNA sensor IFI204 in neutrophils. This study provides novel information on the role of Ikaros in the regulation of neutrophil functions and a rational basis for the development of novel therapeutic approaches targeting Ikaros for the treatment of patients with infections, and sepsis in particular. / Les neutrophiles sont essentiels pour les réponses inflammatoires aiguës initiées par une infection ou une lésion tissulaire. De multiples gènes inflammatoires et des signaux sont activés rapidement pour réguler les fonctions des neutrophiles. Ikaros est un facteur de transcription critique impliqué dans la régulation de la différenciation des cellules myéloïdes. L'analyse de transcription des cellules hématopoïétiques en l'absence d'Ikaros indique des différences dans l'expression des gènes des facteurs de signalisation. Cependant, l'impact d'Ikaros sur les mécanismes de signalisation dans les cellules myéloïdes pendant l'inflammation reste à définir. Le but de cette étude était de définir si le manque d'expression d'Ikaros pouvait perturber la signalisation et ainsi la fonction / réponse des neutrophiles pendant l'inflammation. Nous avons utilisé les neutrophiles purifiés de la moelle osseuse des souris WT et Ikaros +/-. Nous avons trouvé que le niveau d'expression d'Ikaros est un facteur important pour contrôler l'apoptose des neutrophiles, la NETosis, l'activité de la myéloperoxydase et la production d’espèces d'oxygène réactives en réponse à l'ADN bactérien. Nous avons également fait des expériences in vivo en utilisant un modèle murin de pneumonie. Nous avons trouvé que la suppression partielle d'Ikaros (souris Ikaros +/-) est associée à l'élimination réduite des bactéries. Pour expliquer comment l'expression plus faible d'Ikaros pourrait affecter la signalisation dans les neutrophiles, nous avons fait une analyse ‘’ high-throughput microarray ‘’ pour identifier les variations de l'activité de la protéine kinase. Les données de microarray suggèrent que plusieurs signaux, comme le P38 MAPK, sont affectées par Ikaros. En conséquence, nous avons utilisé des inhibiteurs sélectifs des kinases pour mieux définir l'importance de ces kinases dans la fonction des neutrophiles. De plus les résultats présentés indiquent l’importance du facteur Ikaros pour la régulation de l’expression des ‘Toll Like Receptor’ 4 et 9, ainsi que du senseur d’ADN cytoplasmique IFI204 dans les neutrophiles. Cette étude présente de nouvelles informations sur le rôle d'Ikaros dans la régulation des fonctions des neutrophiles et une base rationnelle pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant Ikaros pour le traitement des patients avec d'infections et de septicémie en particulier.

La protéine suppresseur de tumeurs p53 induit l'apoptose et l'arrêt du cycle cellulaire dans les cellules qui sont stimulées par divers stress cellulaires, dont le stress génotoxique. p53 maintient l'intégrité génomique, et ses fonctions sont les plus importantes pour la résistance à la tumorigenèse cellulaire. Des mutations de TP53, qui est le gène codant pour p53, sont fréquemment observées dans les tumeurs malignes. Comme l'apoptose n'est pas induite dans les cellules cancéreuses avec des mutations ou une délétion de TP53 en réponse à la radiothérapie ou au traitement par des agents anticancéreux, le pronostic de ces patients est très mauvais. En réponse au stress cellulaire, la p53 est stabilisée, tétramérisée et activée pour exercer des fonctions telles que l'activation de la transcription. Cette fonction est précisément régulée par des modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, l'acétylation, l'ubiquitination et la méthylation de plus de 50 résidus. L'homotétramérisation de la protéine p53 par le domaine de tétramerisation (DT) à la région C-terminale est indispensable à sa fonction, et son activité transcriptionnelle est régulée par la stabilité de la structure tétramérique. Le domaine de tétramérization de la protéine p53 humaine est constitué d'un brin, d'un tour et d'une hélice et est en équilibre entre le monomère et le tétramère. La régulation par des modifications post-traductionnelles dans le domaine de la tétramérization n'est pas encore claire ; il est donc nécessaire d'élucider en détail le mécanisme de régulation par des modifications post-traductionnelles. La p53 est présente dans un large éventail d'organismes, de la lamproie, qui est un vertébré précoce, aux mammifères. Bien que le rôle de p53 soit important dans l'évolution des vertébrés, la fonction de p53 et le processus d'évolution de la structure tétramérique ne sont pas clairs. En plus de l'analyse phylogénétique de la séquence, une analyse complète de la structure et de la fonction est nécessaire. Le but de cette étude était de comprendre comment la stabilité de la structure tétramérique est modifiée par des modifications post-traductionnelles et comment la DT régule l'activité et la fonction de p53. À cette fin, j'ai exploré le mécanisme de régulation de la méthylation de l'Arg et l'évolution du domaine de tétramerisation de la p53 chez les vertébrés. Cette thèse comprend cinq chapitres. Le contexte et les objectifs de l'étude sont décrits dans une introduction générale au chapitre 1. J'ai décrit la fonction suppresseur de tumeur de p53, sa structure tétramérique et son évolution chez les vertébrés. Au chapitre 2, j'ai décrit le contrôle de la fonction par méthylation de la DT p53. La fonction de la p53 est régulée par des modifications post-traductionnelles, y compris la méthylation de trois résidus Arg dans la DT. Il a été rapporté que cette méthylation par la protéine Arg méthyltransférase 5 (PRMT5) favorise l'arrêt du cycle cellulaire, mais réprime l'apoptose. Pour clarifier le mécanisme de régulation par la méthylation, j'ai effectué une analyse de la stabilité de la structure du fragment p53 méthylé et un essai de méthylation in vitro avec la PRMT5. La méthylation des résidus Arg a déstabilisé la structure oligomérique, en particulier, Arg337 a largement contribué à la déstabilisation. J'ai identifié les sites de méthylation de PRMT5 en utilisant la CLN-SM/SM et j'ai révélé une cascade de méthylation qui a commencé par la monométhylation à l'Arg335. Ces résultats suggèrent un nouveau mécanisme de régulation via la modulation de la stabilité structurelle de la DT p53. L'affinité entre l'élément de réponse du gène cible et la protéine p53 semble être élevée avec les gènes d'arrêt du cycle cellulaire et faible avec les gènes pro-apoptotiques. Lorsque p53 se lie à un élément de réponse et contrôle la transcription, l'ADN se plie. On pense que même la protéine p53 méthylée et déstabilisée peut supporter la flexion des gènes d'arrêt du cycle cellulaire parce que l'affinité est élevée, mais ne peut supporter la flexion des gènes pro-apoptotiques. Au chapitre 3, j'ai décrit l'évolution de la stabilité structurelle de la DT p53 chez les mammifères. La séquence de la DT p53 des mammifères varie de 3 à 10 résidus au sein des espèces. J'ai synthétisé le fragment de 35 résidus de la DT p53 de l'humaine, de la musaraigne arboricole, du cobaye, du hamster chinois, du mouton et de l'opossum et j'ai analysé la thermostabilité de la structure oligomérique par spectrométrie DC. La musaraigne arboricole ressemble à un écureuil mais a été classée dans un ordre indépendant ; il y a eu des substitutions de seulement quatre résidus par rapport à la variante humaine, et sa structure oligomérique s'est avérée plus stable que celle de l'humain. En analysant les mutants, il a été déterminé que la substitution à l'origine de la stabilisation était du Met354 (Gln dans la version humaine). La modélisation de l'homologie de la structure tétramérique suggère que la chaîne latérale Met située dans l'hélice C-terminale a stabilisé la structure de l'hélice de l'extrémité par la chaîne latérale Met d'une autre chaîne protéique via de nouvelles interactions hydrophobes. Récemment, la musaraigne arboricole a attiré beaucoup d'attention, car les musaraignes arboricoles sauvages boivent régulièrement et sont sensibles à l'infection par l'hépatite B, dont on pensait qu'elle n'infectait que les chimpanzés et les humains. Elle est donc maintenant utilisée comme un modèle de primate. L'aldéhyde cause des dommages à l'ADN, et il a été suggéré que la musaraigne arboricole peut maintenir l'intégrité génomique grâce à son p53 stable. Au chapitre 4, j'ai décrit une analyse plus approfondie de l'évolution de la structure, de la stabilité et de la fonction de la DT p53 chez les vertébrés. En plus de l'analyse phylogénique de l'arbre, cette étude a analysé la structure, la stabilité et la fonction. L'analyse phylogénique a montré que la DT p53 des vertébrés avait une distance d'évolution plus longue que les DT de p63 et p73, qui sont des membres de la famille p53 qui forment un tétramère de la même manière. De plus, il a été révélé que le DT p53 est plus diversifié que le domaine de liaison à l'ADN (DBD). J'ai choisi 19 espèces dont des poissons sans mâchoires, des poissons cartilagineux, des poissons à nageoires de rayons, des poissons à nageoires de lobes, des Amphibia, des Reptilia, des oiseaux et des Mammifères. Bien qu'il y ait eu des substitutions de nombreux résidus, y compris chez la lamproie, le fragment DT a formé un tétramère chez toutes les espèces. J'ai effectué une analyse de la stabilité de la structure et une analyse de l'activité transcriptionnelle de la chimère p53. La lamproie avait une stabilité structurelle et une activité faibles, et les poissons comme le poisson-zèbre avaient une activité élevée en raison d'un effet de stabilisation de la deuxième hélice dans la région C-terminale. Cependant, l'espèce de Coelacanthe atteignant l'Homme dans le but d'avancer vers la terre a gagné une stabilité qui n'était élevée que dans la première hélice. Comme une mutation du DBD affecte directement la liaison avec l'ADN et que l'évolution du DT régule indirectement l'activité de p53, on pense que la stabilité de la structure tétramérique a évolué davantage que le DBD. Au chapitre 5, j'ai décrit la conclusion globale de cette étude. Pour comprendre le mécanisme de régulation in vivo, il est très important de clarifier le mécanisme de modulation de la stabilité de la structure tétramérique de p53. Dans cette étude, il a été déterminé que la stabilité structurelle est régulée par la méthylation de la DT p53. De plus, je propose que le modèle de contrôle du choix du gène cible utilise les différences d'affinité avec l'élément de réponse et l'ajustement de la stabilité de la structure tétramérique. En outre, outre l'analyse phylogénétique de la protéine, qui est exprimée chez le vertébré entier, j'ai effectué pour la première fois une analyse de la stabilité structurelle et fonctionnelle. Les résultats suggèrent que les vertébrés se sont adaptés à l'environnement grâce à la stabilité de la DT p53, et que la p53 a joué un rôle extrêmement important dans le processus d'évolution. / Tumor suppressor protein p53 induces apoptosis and cell cycle arrest in cells that are stimulated by a variety of cellular stresses including genotoxic stress. p53 maintains genomic integrity, and its functions are the most important for resistance to cellular tumorigenesis. Mutations of TP53, which is the p53-encoding gene, are frequently found in malignant tumors. Because apoptosis is not induced in cancer cells with mutations or deletion in TP53 in response to radiation therapy or treatment with anticancer agents, the prognosis of these patients is very poor. In response to cellular stress p53 is stabilized, tetramerized, and activated to exert functions such as transcription activation. This function is precisely regulated by posttranslational modifications such as phosphorylation, acetylation, ubiquitination, and methylation of more than 50 residues. Homotetramerization of the p53 protein through the tetramerization domain (TD) at the C-terminal region is indispensable for its function, and its transcriptional activity is regulated by the stability of the tetrameric structure. The TD of human p53 consists of a β-strand, turn, and α-helix and is in equilibrium between the monomer and tetramer. The regulation by posttranslational modifications in the tetramerization domain is still unclear; thus, detailed elucidation of the regulatory mechanism through posttranslational modifications is required. p53 is found in a wide range of organisms from Lamprey, which is an early vertebrate, to mammals. Though the role of p53 is important in the evolution of vertebrates, the function of p53 and the evolution process of the tetrameric structure are unclear. As well as phylogenetic analysis of the sequence, a comprehensive analysis of the structure and the function is required. The aim of this study was to understand how the stability of the tetrameric structure is changed by posttranslational modifications and how the TD regulates p53’s activity and function. To this end, I explored the Arg methylation regulatory mechanism and the evolution of the p53 tetramerization domain in vertebrates. This thesis consists of five chapters. The background of the study and the study goals are described as a general introduction in Chapter 1. I outlined the tumor suppressor function of p53, its tetrameric structure, and its evolution in vertebrates. In Chapter 2, I described the function control by methylation of the p53 TD. p53’s function is regulated by posttranslational modifications, including the methylation of three Arg residues in the TD. It has been reported that this methylation by protein Arg methyltransferase 5 (PRMT5) promotes cell cycle arrest, but represses apoptosis. To clarify the regulatory mechanism through methylation, I carried out structure stability analysis of the methylated p53 fragment and an in vitro methylation assay with PRMT5. The methylation of the Arg residues destabilized the oligomeric structure, in particular, Arg337 had a large contribution to the destabilization. I identified PRMT5 methylation sites using nLC-MS/MS and revealed a methylation cascade that started with mono-methylation at Arg335. These findings suggest a novel regulatory mechanism via structural stability modulation of the p53 TD. The affinity between the response element of the target gene and the p53 protein appeared to be high with pro-cell cycle arrest genes and low with pro-apoptotic genes. When p53 binds to a response element and controls transcription, the DNA bends. It is thought that even methylated and destabilized p53 can endure bending of pro-cell cycle arrest genes because the affinity is high, but cannot bear bending of the pro-apoptotic genes. In Chapter 3, I described the evolution of the structural stability of the p53 TD in mammals. The sequence of the mammalian p53 TD varies in 3–10 residues within species. I synthesized the 35-residue fragment of the p53 TD of human, tree shrew, guinea pig, Chinese hamster, sheep, and opossum and analyzed the thermostability of the oligomeric structure using CD spectrometry. The tree shrew resembles a squirrel but classified independent order; there were substitutions of only four residues in comparison with the human variant, and its oligomeric structure has been shown to be more stable than the human one. By analyzing the mutants, it was determined that the substitution causing the stabilization was of Met354 (Gln in the human version). The homology modeling of the tetrameric structure suggests that the Met side chain located in the C-terminal α-helix stabilized the helix structure of the end through the Met side chain of other protein chain via new hydrophobic interactions. Recently, the tree shrew has attracted a lot of attention, as wild tree shrews drink routinely and are susceptible to hepatitis B infection, which has been thought to infect only chimpanzees and humans. Thus, it is now used as a primate-like model. Aldehyde causes DNA damage, and it has been suggested that the tree shrew can maintain genomic integrity because of its stable p53. In Chapter 4, I described more extensive analysis of the evolution of the structure, stability, and function of the p53 TD in vertebrates. As well as phylogenic tree analysis, this study analyzed structure, stability, and function. The phylogenic analysis showed that the p53 TD of vertebrates had a longer evolution distance than the TDs of p63 and p73, which are p53 family members that formed a tetramer in the same way. In addition, it was revealed that the p53 TD is more diversified than the DNA-binding domain (DBD). I chose 19 species including jawless fish, cartilaginous fish, ray-finned fish, lobe-finned fish, Amphibia, Reptilia, birds, and Mammalia. Though there were substitutions of many residues including in Lamprey, the TD fragment formed a tetramer in all species. I carried out structure stability analysis and transcriptional activity analysis of chimeric p53. Lamprey had low structural stability and activity, and fish such as Zebrafish had high activity due to a stabilization effect of the second helix in the C-terminal region. However, the Coelacanth species reaching Human aiming at an advance to the land gained stability that was high only in the first helix. Because a mutation in the DBD directly affects binding with DNA and the evolution of the TD regulates the activity of p53 indirectly, it is thought that the stability of the tetrameric structure evolved more than the DBD. In Chapter 5, I described the all-inclusive conclusion of this study. To understand the regulatory mechanism in vivo, it is very important to clarify the stability modulation mechanism of the p53 tetrameric structure. In this study, it was determined that structural stability is regulated by the methylation of the p53 TD. Furthermore, I propose that the target gene choice control model uses the differences in the affinity with the response element and adjustment of the tetrameric structure stability. Furthermore, as well as phylogenetic analysis of the protein, which is expressed in the whole vertebrate, I performed structural stability and functional analysis for the first time. The results suggest that vertebrates adapted to the environment via the stability of the p53 TD, and p53 played an extremely important role in the evolution process.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2020-2021 / En biologie cellulaire, la microscopie optique est couramment utilisée pour visualiser et caractériser la présence et la morphologie des structures biologiques. Suite à l’acquisition, un expert devra effectuer l’annotation des structures pour quantification. Cette tâche est ardue, requiert de nombreuses heures de travail, parfois répétitif, qui peut résulter en erreurs d’annotations causées par la fatigue d’étiquetage. L’apprentissage machine promet l’automatisation de tâches complexes à partir d’un grand lot de données exemples annotés. Mon projet de maîtrise propose d’utiliser des techniques faiblement supervisées, où les annotations requises pour l’entraînement sont réduites et/ou moins précises, pour la segmentation de structures neuronales. J’ai d’abord testé l’utilisation de polygones délimitant la structure d’intérêt pour la tâche complexe de segmentation de la protéine neuronale F-actine dans des images de microscopie à super-résolution. La complexité de la tâche est supportée par la morphologie hétérogène des neurones, le nombre élevé d’instances à segmenter dans une image et la présence de nombreux distracteurs. Malgré ces difficultés, l’utilisation d’annotations faibles a permis de quantifier un changement novateur de la conformation de la protéine F-actine en fonction de l’activité neuronale. J’ai simplifié davantage la tâche d’annotation en requérant seulement des étiquettes binaires renseignant sur la présence des structures dans l’image réduisant d’un facteur 30 le temps d’annotation. De cette façon, l’algorithme est entraîné à prédire le contenu d’une image et extrait ensuite les caractéristiques sémantiques importantes pour la reconnaissance de la structure d’intérêt à l’aide de mécanismes d’attention. La précision de segmentation obtenue sur les images de F-actine est supérieure à celle des annotations polygonales et équivalente à celle des annotations précises d’un expert. Cette nouvelle approche devrait faciliter la quantification des changements dynamiques qui se produisent sous le microscope dans des cellules vivantes et réduire les erreurs causées par l’inattention ou le biais de sélection des régions d’intérêt dans les images de microscopie. / In cell biology, optical microscopy is commonly used to visualize and characterize the presenceand morphology of biological structures. Following the acquisition, an expert will have toannotate the structures for quantification. This is a difficult task, requiring many hours ofwork, sometimes repetitive, which can result in annotation errors caused by labelling fatigue.Machine learning promises to automate complex tasks from a large set of annotated sampledata. My master’s project consists of using weakly supervised techniques, where the anno-tations required for training are reduced and/or less precise, for the segmentation of neuralstructures.I first tested the use of polygons delimiting the structure of interest for the complex taskof segmentation of the neuronal protein F-actin in super-resolution microscopy images. Thecomplexity of the task is supported by the heterogeneous morphology of neurons, the highnumber of instances to segment in an image and the presence of many distractors. Despitethese difficulties, the use of weak annotations has made it possible to quantify an innovativechange in the conformation of the F-actin protein as a function of neuronal activity. I furthersimplified the annotation task by requiring only binary labels that indicate the presence ofstructures in the image, reducing annotation time by a factor of 30. In this way, the algorithmis trained to predict the content of an image and then extract the semantic characteristicsimportant for recognizing the structure of interest using attention mechanisms. The segmen-tation accuracy obtained on F-actin images is higher than that of polygonal annotations andequivalent to that of an expert’s precise annotations. This new approach should facilitate thequantification of dynamic changes that occur under the microscope in living cells and reduceerrors caused by inattention or bias in the selection of regions of interest in microscopy images.

Titre de l'écran-titre (visionné le 30 octobre 2023) / L'épilepsie est une condition neurologique caractérisée par la survenue spontanée de crises résultant d'une activité neuronale synchrone et excessive. Récemment, des mutations dans les gènes du complexe GATOR1 (DEPDC5, NPRL2 et NPRL3) ont été impliquées dans les épilepsies focales familiales (EFF). Bien que les mécanismes moléculaires sous-jacents de la maladie ne soient pas encore compris, une hyperactivité de la voie de signalisation mTORC1 constitue une caractéristique bien établie des EFF reliées à GATOR1. Dans la cellule, GATOR1 est un complexe protéique essentiel dans la détection des acides aminés et il agit comme répresseur de la voie de signalisation mTORC1 lorsque les niveaux d'acides aminés intracellulaires sont bas. mTORC1 joue un rôle central dans la régulation de la croissance cellulaire et contrôle plusieurs processus cellulaires incluant la synthèse protéique et l'autophagie. Une dérégulation de la voie mTORC1 est impliquée dans plusieurs maladies, dont l'épilepsie. Malgré l'importance biologique et clinique de GATOR1, les mécanismes régulant son activité demeurent peu connus. Par l'utilisation de lignées de cellules mutantes, ce projet vise donc à identifier de nouveaux mécanismes biochimiques de régulation de GATOR1 afin de contrôler l'activité de mTORC1 et de mieux comprendre les conséquences moléculaires des mutations de GATOR1 contribuant à l'EFF. En déterminant l'impact fonctionnel de variants de NPRL2 reliés à l'EFF, j'ai montré qu'une portion de ces variants ont perdu leur capacité à réprimer mTORC1 dans des conditions nutritionnelles sous-optimales, ce qui supporte l'hyperactivité de mTORC1 comme mécanisme pathogénique sous-jacents de la maladie. Ce projet a également montré que le variant pathogénique L105P de NPRL2 est incapable de s'associer avec NPRL3 and DEPDC5, ce qui semble souligner le rôle crucial du résidu leucine 105 (Leu105) de NPRL2 dans la formation du complexe GATOR1. Par ailleurs, ce projet a montré que l'acétylation se produit sur certains résidus lysine de NPRL2 retrouvés à proximité du site Leu105. L'acétylation sur ces résidus s'est révélée plus abondante sur le mutant L105P que sur la protéine sauvage. Ces résultats proposent donc NPRL2 comme une cible potentielle sujette à la régulation par l'acétylation, laquelle pourrait avoir pour effet d'abolir les interactions protéiques entre les membres de GATOR1. / Epilepsy is a complex neurological disorder characterized by spontaneous seizures due to excessive neuronal activity. Mutations in the GATOR1 genes (DEPDC5, NPRL2 and NPRL3) have recently been linked to familial focal epilepsy (FFE). The molecular mechanisms underlying the disease are currently unknown, yet hyperactive mTORC1 signaling is an established feature of GATOR1-related epilepsies. The GATOR1 complex is an essential amino acids sensor that acts to repress the mTORC1 signaling pathway when intracellular amino acids levels are low. mTORC1 is a master regulator of cell growth that controls multiple cellular processes such as protein synthesis and autophagy. Dysregulation of mTORC1 contributes to many diseases including epilepsy. Despite the clinical and biological importance of GATOR1, little is known about its regulation. Through the use of mutant cell lines, this project aims to investigate novel biochemical regulatory mechanisms of GATOR1 that control mTORC1 activity, and to understand the molecular mechanisms underlying GATOR1-dependent epilepsies. Functional assessments of FFE-related NPRL2 variants in NPRL2-null cells revealed that some variants completely prevent the ability of GATOR1 to repress mTORC1 under starvation conditions. This further supports the dysregulation of mTORC1 as the main pathogenic mechanism underlying the disease. Additionally, I demonstrated that the pathogenic NPRL2 variant L105P is unable to associate with NPRL3 and DEPDC5, suggesting the critical role of NPRL2 Leu105 residue in organizing the assembly of GATOR1 complex. Finally, I showed that NPRL2 is acetylated on conserved lysine residues that are adjacent to the Leu105 site. Acetylation on Lys103 and Lys104 residues was more abundant in the mutant L105P compared to the wild-type NPRL2. These results suggest NPRL2 as a potential novel target of regulation by lysine acetylation, which may act as an impediment to protein interactions within the GATOR1 complex. Future work aimed at determining the functional consequences of lysine acetylation in NPRL2 will be necessary.