La fonction d'une protéine est souvent subordonnée à l'interaction avec un certain nombre de partenaires. L'étude de la structure tridimensionnelle de ces complexes, qui ne peut souvent se faire expérimentalement, permettrait la compréhension de nombreux processus cellulaires. Le travail présenté ici se compose de deux parties. La première traite de la mise en place d'une fonction de score pour l'amarrage protéine-protéine et la deuxième de l'étude cristallographique d'une protéine tétramérique qui est une cible antibiotique potentielle : la thymidylate synthase X de Paramecium bursaria Chlorella virus. La modélisation des complexes protéine-protéine ou docking comporte deux étapes successives : d'abord, un grand nombre de conformations sont générées, puis une fonction de score est utilisée pour les classer. Cette fonction de score doit prendre en compte à la fois la complémentarité géométrique des deux molécules et les propriétés physico-chimiques des surfaces en interaction. Nous nous sommes intéressés à la seconde étape à travers le développement d'une fonction de score rapide et fiable. Ceci est possible grâce à la tessellation de Voronoï de la structure tridimensionnelle des protéines. En effet, les tessellations de Voronoï ou de Laguerre se sont avérées être de bons modèles mathématiques de la structure des protéines. En particulier, cette formalisation permet de faire une bonne description de l'empilement et des propriétés structurales des résidus. Cette modélisation rend compte l'empilement des résidus à l'interface entre deux protéines. Ainsi, il est possible de mesurer un ensemble de paramètres sur des complexes protéine-protéine dont la structure est connue expérimentalement et sur des complexes leurres générés artificiel- lement. Ces paramètres, sont la fréquence d'apparition des résidus ou des paires de résidus, les volumes des cellules de Voronoï, les distances entre les résidus en contact à l'interface, la surface de l'interface et le nombre de résidus à l'interface. Ils ont été utilisés en entrée de procédures d'apprentissage statistique. Grâce à ces procédures (apprentissage logistique, séparateurs à vaste marge (SVM) et algorithmes génétiques), on peut obtenir des fonctions de score efficaces, ca- pables de séparer les leurres des structures réelles. Dans un deuxième temps, j'ai déterminé expérimentalement la structure de la thymidylate synthase X, cible antibiotique de choix. La thymidylate synthase X est une flavoprotéine qui a été découverte récemment. Elle intervient dans la synthèse du dTMP chez la plupart des procaryotes mais n'existe pas chez les eucaryotes supérieurs. Cette protéine catalyse le transfert de methyle du tétrahydrofolate vers le dUMP grâce à son cofacteur le FAD et au NADPH qui intervient comme substrat. La structure tridimensionnelle de l'homotétramère de la thymidylate synthase X en présence de son cofacteur, le FAD, a été résolue à 2.4 Å par remplacement moléculaire. Comme pour les structures de thymidylate synthase X de Thermotoga maritima et de Mycobacterium tuberculosis précédemment résolues, le monomère se compose d'un coeur de feuillets β et de deux hélices α à son extrémité. Le site actif se trouve à l'interface de trois monomères, la partie isoalloxazine du FAD étant accessible au solvant et proche d'une longue boucle flexible. La fixation du FAD dans cette structure est légèrement différente de celles déjà observées par la conformation de la partie adénine. Cette structure, associée aux études de mutagénèse dirigée de nos collaborateurs, a permis de mettre évidence des résidus jouant un rôle majeur lors de la catalyse.

Dans le cadre de la poursuite de l'exploration des effets anticancéreux des complexes ferrocéniques du tamoxifène, nous avons préparé une série de complexes hybrides résultant de la substitution de la chaîne latérale du ferrocifène (FcTAM) par celle du SAHA, un inhibiteur des histones-déacétylases (HDACi) utilisé dans le traitement de certains lymphomes. A partir de la structure hybride " FcTAM-SAHA ", cinq types de modifications ont été réalisées. Il s'agit [1] de la modification de la fonction acide hydroxamique (CONHOH) en fonction amide primaire (CONH2) ou acide carboxylique (COOH), [2] de la variation de la longueur de la chaîne latérale, [3] de la présence ou non d'un substituant sur le cycle aromatique, [4] de la substitution du métallocène et [5] du remplacement du groupement ferrocényle par un phényle. Les effets antiprolifératifs des nouveaux complexes ont été étudiés sur deux lignées de cancer du sein, MDA-MB-231 (lignée hormono-indépendante et triple-négative) et MCF-7 (lignée hormono-dépendante). Un effet synergique de la toxicité est observé en série FcTAM-SAHA sur les deux lignées cellulaires. De façon un peu inattendue, nous avons trouvé que l'effet antiprolifératif des hybrides phénoliques (type FcOHTAM-SAHA) et des hybrides ferrocénophaniques (type FnTAM-SAHA) était comparable voire légèrement inférieur à celui des complexes non hydroxylés (type FcTAM-SAHA). Cette observation semble indiquer que les propriétés redox des molécules ne s'expriment pas de façon identique pour les précurseurs et les hybrides. Dans tous les cas, les complexes porteurs d'une fonctionnalité chimique acide hydroxamique ou amide primaire sont plus cytotoxiques que les acides carboxyliques et ces effets sont peu influencés par la longueur de la chaîne latérale. Enfin, dans tous les cas, les complexes ferrocéniques ont des effets antiprolifératifs supérieurs à leurs analogues organiques. Cette différence souligne l'importance de la présence du motif ferrocénique et de ses propriétés redox uniques.

L’immunosuppression a permis d’améliorer l’incidence du rejet aigu sans toutefois améliorer significativement le rejet chronique. Celui-ci est caractérisé par une vasculopathie du greffon (VG) similaire à une forme accélérée d’athérosclérose native accompagnée de fibrose. La pathophysiologie de la VG découle de l’hypothèse de réponse à l’insulte proposée par Russell Ross en 1977. Selon son postulat, l’endothélium stressé par des facteurs immunologiques et non immunologiques initie l’apoptose endothéliale suivi d’une réponse de réparation vasculaire via un épaississement myo-intimal aux sites d’insultes. Toutefois, lorsque les stress endothéliaux initiaux demeurent soutenus, l’apoptose endothéliale et la réponse de réparation perpétuent. Compte tenu que l’inhibition de l’apoptose endothéliale bloque le développement de la VG in vivo, notre hypothèse de travail reposait sur les répercussions paracrines de l’apoptose endothéliale sur les types cellulaires participant au remodelage vasculaire. Nous avons généré un système expérimental in vitro afin d’induire l’apoptose endothéliale en absence significative de nécrose cellulaire. À l’aide d’une approche protéomique multidimensionnelle et comparative, nous avons démontré que les cellules endothéliales apoptotiques exportent spécifiquement 27 signaux post mortem (SPM). Nous avons démontré que certains de ces SPM ont des propriétés anti-apoptotiques (TCTP et EGF), d’autre fibrogénique (CTGF), récapitulant ainsi certains phénotypes cellulaires associés au développement de la VG. Parmi les médiateurs identifiés, 16 n’avaient pas de signal de sécrétion, incluant TCTP, suggérant que des mécanismes de sécrétion non conventionnels soient favorisés durant l’apoptose. Nous avons démontré que la caspase-3 effectrice régule la voie de sécrétion non classique exosomiale associée à l’export extracellulaire de nanovésicules TCTP+VE, anti-apoptotiques et biochimiquement distinctes des corps apoptotiques. Finalement, l’ensemble des données protéomiques ont permis d’émettre l’hypothèse qu’en réponse à un stress apoptotique, la cellule exporte différents médiateurs (solubles et vésiculaires) de manière non conventionnelle nécessitant la fusion d’organelles de la voie endocytaire et autophagique avec la membrane plasmique. Ce mécanisme serait régulé durant la phase effectrice de l’apoptose permettant ainsi d’initier une réponse de réparation extracellulaire seulement lorsque le destin cellulaire a atteint un point de non retour. Ainsi, le testament protéique et nanovésiculaire légué durant l’apoptose endothéliale pourrait servir simultanément de biomarqueur de la VG et de cible thérapeutique afin de diminuer le remodelage vasculaire pathologique. / Immunosuppression regiments improved steadily the incidence of acute rejection with minimal positive effects on chronic rejection. The latter is characterized by a transplant vasculopathy (TV) similar to native atherosclerosis, accompanied with fibrosis throughout the vascular wall of the allograft. The pathophysiology associated to TV arose from pionnering work of Russell Ross in 1977. He proposed the 'Response to Injury' hypothesis revealing that endothelium injury initiated by immunological and non immunological factors favors a vascular repair response through neo-intima thickening at the sites of cellular injury. However, when endothelial insult is maintained, apoptosis ensues and the vascular repair process perpetuates. Since inhibition of endothelial apoptosis prevents TV development in vivo, we hypothesized that endothelial apoptosis regulates the vascular repair process through a paracrine program active on the cellular components of the vessel wall. We have generated an in vitro experimental system to induce endothelial apoptosis in absence of necrosis. Using a multifunctional and comparative proteomic approach, we have identified 27 post mortem signals (PMS) specifically exported by apoptotic endothelial cells. Some of these PMS display anti-apoptotic function (TCTP and EGF), whereas CTGF was identified as a fibrogenic factor, recapitulating the cellular events associated to the development of TV. Interestingly, 16 of these SPM did not contain a peptide signal, suggesting that non conventional secretion mechanisms could be favored during the effector phase of apoptosis. We demonstrated that activated caspase-3 regulates the exosomal secretion pathway associated to the export of nanovesicles TCTP +ve, anti-apoptotic and biochemically different from apoptotic blebs. Finally, the overall proteomic data generated a new hypothesis suggesting that in response to apoptotic stress, the cell exports different mediators (soluble and vesicular) by non conventional mechanism through the fusion of endocytic organelles and autophagic vacuoles with the plasma membrane, releasing their content into the extracellular milieu. This mechanism should be regulated during the effector phase of apoptosis favoring a vascular repair response only when cell’s demise reaches a point of no return. Therefore, these PMS could be used both as biomarkers of apoptosis or as biopharmaceutical targets to decrease the incidence of chronic vascular repair.

Cette thèse propose une méthode pour construire des réseaux de régulation causales réalistes, qui a une taux de faux positifs inférieur aux méthodes traditionnelles. Cette approche consiste à intégrer des informa- tions hétérogènes à partir de deux types de prédictions de réseau pour déterminer une explication causale du gène observé co-expression. Ce processus d'intégration se modélise comme un problème d'optimisation combinatoire, de complexité NP-difficile. Nous introduisons une approche heuristique pour déterminer une solution approchée en un temps d'exécution pratique. Notre évaluation montre que, pour l'espèce modèle E. coli, le réseau de régulation résultant de l'application de cette méthode a une précision supérieure à celle construite avec des outils traditionnels. La bactérie Acidithiobacillus ferrooxidans présente des défis particu- liers pour la détermination expérimentale de son réseau de régulation. En utilisant les outils que nous avons développés, nous proposons un réseau de régulation putatif et analysons la pertinence de ces régulateurs centraux. Il s'agit de la quatrième contribution de cette thèse. Dans une deuxième partie de cette thèse, nous explorons la façon dont ces relations réglementaires se manifestent, en développant une méthode pour compléter un réseau de signalisation lié à la maladie d'Alzheimer. Enfin, nous abordons le problème ma- thématique de la conception de la sonde de puces à ADN. Nous concluons que, pour prévoir pleinement les dynamiques d'hybridation, nous avons besoin d' une fonction de l'énergie modifiée pour les structures secondaires des molécules d'ADN attaché surface et proposons un schéma pour la détermination de cette fonction.

Cette thèse est consacrée au développement d'assemblages supramoléculaires, qui miment la nature amphiphile des membranes cellulaires. A cette fin, des bicouches lipidiques supportées (SLB) ont été conçues pour l'insertion de la FhuA (protéine de membrane externe d'E. coli). L'interaction de FhuA présente dans la SLB, avec le pb5 (la protéine du bactériophage T5) a ensuite été étudiée par QCM-D. De plus, des bicouches lipidiques suspendues (tBLM) ont été construites sur des monocouches auto-assemblées (SAM) d'un nouveau thiol d'ancrage. Dans cette étude, la formation de tBLM a été minutieusement étudiée par différentes techniques telles que la QCM-D, l'AFM et l'EIS, afin de déduire le rôle du thiol d'ancrage dans le processus de formation de tBLM. En outre, un amphipol biotinylé (B-PCApol), a été employé pour l'immobilisation des protéines membranaires, par exemple la FhuA et de l'intégrine avß3 (humain) sur des surfaces contenant la streptavidine. Avec leurs assemblages respectifs, la constante de dissociation du complexe FhuA-pb5 a été déterminée, tandis que les interactions de l'intégrine avec vitronectine (son ligand naturel) ont été étudiées par SPR. La dernière partie de cette thèse est dédiée à l'étude d'événements de reconnaissance biomoléculaire entre une lectine (ConA) et des sucres multivalents présentés sur un châssis moléculaire, RAFT.

L’excès des particules de LDL dans le sang constitue un facteur de risque majeur dans le développement des maladies cardiovasculaires. Dans ce contexte, nous étudions la protéine PCSK9 qui favorise directement ce facteur de risque. Cette protéine est sécrétée en majorité au niveau du foie par les hépatocytes et possède la capacité de reconnaître et de lier le récepteur LDLR. Le rôle premier de ce dernier est d’éliminer les particules de LDL circulant dans le plasma. Ainsi, lorsque la PCSK9 forme un complexe avec le LDLR et l’amène à la dégradation, la conséquence directe de la diminution des ces récepteurs est une accumulation malsaine des particules LDL dans le plasma. L’importante implication de la PCSK9 dans le métabolisme des lipides nous a menés vers des recherches de caractérisation de cette protéine ainsi que dans l’étude de son mode d’action. La PCSK9 est composée de trois domaines et notre intérêt s’est porté sur l’étude structure-fonction des deux domaines dont la fonction était inconnue, soit le domaine en N-terminal : le prodomaine et de son domaine en C-terminal : CHRD. Le premier article présenté dans cette thèse révèle l’importance d’une région acide (acide aminés 33-58) régulatrice de l’activité de la PCSK9 localisée en N-terminal du prodomaine ainsi que l’effet du pH acide, équivalent à celui des endosomes tardifs, qui accroît la capacité de la PCSK9 à induire la dégradation du LDLR. Le deuxième article dissèque davantage la structure de la PCSK9 et met en lumière la différence des prérequis structurels de la région ‘’Hinge’’ ainsi que du module M2, composant du domaine CHRD, dans la voie intracellulaire et la voie extracellulaire d’activité de la PCSK9. La mutation R434W localisée dans la région ‘’Hinge’’ résulte dans une inhibition totale de l’activité intracellulaire de la PCSK9 tandis que son activité extracellulaire est réduite à ~70%. Contrairement, la perte du module M2 du domaine CHRD est bien tolérée par la PCSK9 lors de son activité intracellulaire mais totalement inhibitrice pour son activité extracellulaire. Le troisième article se distingue en présentant une nouvelle stratégie d’inhibition de l’activité de la PCSK9 en utilisant une chimère composée de la fraction Fc de l’immunoglobuline IgG1 humaine couplée avec le prodomaine de la PCSK9. La protéine fusion Fcpro lie directement la PCSK9, crée un encombrement structurel qui résulte dans une régulation négative l’activité de la PCSK9. En résumé, nous présentons dans cette thèse, trois manuscrits qui apportent une contribution à la connaissance des composantes structurelles de la PCSK9 et leur implication dans le rôle de la protéine en tant que régulateur négatif du LDLR. / Hypercholesterolemia is one of the major risk factors leading to cardiovascular disease. In this context, we focused our study on a protein that directly influences hypercholesterolemia: PCSK9. Since 2003, the coding gene for PCSK9 has been identified as the third locus responsible for familial hypercholesterolemia (FH3). PCSK9 is a protein secreted mostly from the liver by hepatocytes and has the capacity to recognize, bind and direct to degradation the LDLR receptor. The latter is responsible for the elimination the LDL particles from the plasma. The direct consequence of the LDLR degradation induced by PCSK9 is the harmful accumulation of the bad cholesterol in the blood. Since PCSK9 activity has undesirable consequences on lipid metabolism homeostasis, we directed our research to characterize this protein to better understand its mechanism of action. Three domains compose PCSK9 structure and we focused on the ‘’structure-function study’’ of two domains, of which roles were still unknown: the prodomain located at the N-terminal extremity and the CHRD domain at the C-terminus of PCSK9. The first manuscript presented in this thesis brings to light the importance of the acidic N-terminal sequence of the prosegment (amino acids 33-58) and its effect on the activity of PCSK9. It also presents a novel mechanism for fine-tuning the activity of PCSK9, which is enhanced at acidic pHs close to those of late endosomes. The second manuscript dissects further the PCSK9 structure, revealing that the structural requirements of the hinge and the M2 module located in the CHRD domain are not the same for the intracellular and extracellular pathways of PCSK9-induced LDLR degradation. Although the R434W natural mutation in the hinge region is absolutely deleterious for the intracellular activity of PCSK9, it reduces by ~70% the extracellular one. In contrast, the loss of M2 module of the CHRD domain is tolerated for the intracellular activity of PCSK9 but not for the extracellular one. The third manuscript demonstrates for the first time that a chimera containing the prosegment (Fcpro) directly binds PCSK9 and effectively acts as a negative regulator (inhibitor) of its ability to induce LDLR degradation. Our work presents a new strategy to develop such inhibitors by interfering with the structure of PCSK9 and exploiting the properties of the PCSK9 prosegment and the advantage of its fusion to a humanized Fc of IgG1. In summary, the present research data sheds new light on the functional contribution of the prodomain and the CHRD domain of PCSK9.

Le récepteur à neurotrophine TrkC a été identifié comme étant un récepteur à dépendance : en l'absence de son ligand NT-3, il déclenche l'apoptose. En effet, la survie des cellules qui expriment ces récepteurs dépend de la disponibilité en ligand, un mécanisme qui inhibe la prolifération incontrôlée et la migration des cellules tumorales. TrkC, en tant que récepteur à tyrosine kinase, est généralement considéré comme un proto-oncogène. Or nous montrons que l'expression TrkC est diminuée dans une grande fraction des cancers colorectaux humains, principalement par méthylation du promoteur de TrkC. En outre, ce mécanisme confère un avantage sélectif aux lignées cellulaires colorectales pour inhiber la mort des cellules tumorales. De plus, la réexpression de TrkC dans les lignées tumorales colorectales est associée à la mort des cellules tumorales et à l'inhibition in vitro des caractéristiques de transformation cellulaire, et in vivo de la croissance tumorale. Ensemble, ces données permettent de conclure que TrkC est un gène suppresseur de tumeur dans le cancer colorectal. Le mécanisme moléculaire par lequel TrkC déclenche l'apoptose implique le clivage de son domaine intracellulaire, ce qui libère un fragment pro-apoptotique (TrkC KF). Nous montrons que TrkC KF interagit avec Cobra1, un cofacteur de BRCA1, et que Cobra1 est nécessaire à l'apoptose induite par TrkC. Cobra1 conduit TrkC KF à la mitochondrie, où il favorise l'apoptose apoptosome-dépendante. Ainsi, nous proposons qu'en l'absence de NT-3, le clivage protéolytique de TrkC conduit à la libération d'un fragment tueur qui déclenche l'apoptose mitochondriale, via le recrutement de Cobra1

Les protéines amyloïdes sont retrouvées sous forme de fibres dans de nombreuses maladies neurodégénératives. En tentant d’élucider le mécanisme de fibrillation, les chercheurs ont découvert que cette réaction se fait par un phénomène de nucléation passant par des oligomères. Il semblerait que ces espèces soient la principale cause de la toxicité observée dans les cellules des patients atteints d’amyloïdose. C’est pourquoi un intérêt particulier est donc porté aux premières étapes d’oligomérisation. Dans ce mémoire, nous nous intéressons à une séquence d’acide aminé fortement hydrophobe de l’α-synucléine appelée composante non β -amyloïde (Non-Amyloid β Component ou NAC). Cette dernière est retrouvée sous forme de fibres dans les corps et les neurites de Lewy des patients atteints de la maladie de Parkinson. De plus, elle constitue une composante minoritaire des fibres impliquées dans la maladie d’Alzheimer. Nous avons observé les changements structuraux qui ont lieu pour le monomère, le dimère et le trimère de la séquence NAC de l’α-synucléine. Nous nous sommes aussi intéressés aux conséquences structurelles observées dans des oligomères hétérogènes qui impliqueraient, Aβ1−40. Pour cela nous utilisons des dynamiques moléculaires, d’échange de répliques couplées au potentiel gros-grain, OPEP. Nous constatons une disparition des hélices α au profit des feuillets β , ainsi que le polymorphisme caractéristique des fibres amyloïdes. Certaines régions se sont démarquées par leurs capacités à former des feuillets β . La disparition de ces régions lorsque NAC est combinée à Aβ laisse entrevoir l’importance de l’emplacement des résidus hydrophobes dans des structures susceptibles de former des fibres amyloïdes. / Amyloid proteins are found in fiber form in many neurodegenerative diseases. In attempting to elucidate the mechanism of fibrillation, researchers have found that fibril formation occurs by a nucleation mechanisms involving oligomers. It seems, in particular, that the latter species are responsible for the toxicity observed in the cells of patients suffering from amyloidosis. That is why special interest is focused in the early stages of oligomerization. In this this work, we focus on a highly hydrophobic amino acid sequence of the α-synuclein called Non-Amyloid β Component (NAC). The NAC is recovered in the form of fibers in the body and Lewy neurites in patients with Parkin- son’s disease. Moreover, it is a minority component of the fibers involved in Alzheimer’s disease. In particular, we observe the structural changes taking place for the monomer, dimer and trimer of the NAC region of α-synuclein. We are also interested in the structural consequences observed in heterogeneous oligomers which involve Aβ1−40. We use Hamiltonian and temperature replica exchange molecular dynamics (HT-REMD) simulations combined with the coarse-grained OPEP potential. We observe a loss of α-helices in favor of β -strands and the characteristic polymorphism of amyloid fibers. We also find that some regions are distinguished by their ability to form β -strands. The disappearance of these regions when combined Aβ with NAC suggests the importance of the location of hydrophobic residues in amyloid fibers structures.

Le mercure est présent dans l'environnement à cause de phénomènes naturels (volcans) ou des activités humaines (combustion de combustibles fossiles). Le mercure existe sous forme de mercure élémentaire (Hg0), ionique (HgII) ou organique tel le méthylmercure (MeHg). Ces diverses formes sont en flux constant les uns avec les autres dans le cycle biogéochimique naturel. De par leur grande hydrophobicité et leur capacité à pénétrer les membranes biologiques, les composés organomercuriels contituent la forme la plus toxique de mercure retrouvée dans l’environnement Des niveaux élevés de MeHg ont d’ailleurs été détectés dans la chaire de poissons de nombreuses régions du monde. Conséquemment, une consommation de produits de la mer contaminés représente un grave danger pour la santé humaine. Certaines bactéries isolées à partir d'environnements contaminés par le mercure ont évolué vers un système qui leur permet de convertir efficacement les composés mercuriels présents autant sous forme ionique qu’organique en un mercure élémentaire moins toxique. Cette résistance au mercure s’explique par l'acquisition d'un élément génétique connu sous le nom d’opéron mer. L’opéron mer code entre autre pour deux enzymes importants : la lyase organomercurielle MerB et la réductase mercurielle MerA. MerA catalyse la réduction du HgII conduisant à la formation du mercure élémentaire Hg0 qui est un composé volatile et moins toxique. MerB, quant à elle, catalyse la protonolyse de la liaison carbone-mercure de composés organomercuriels pour produire un composé réduit de carbone et du mercure ionique (HgII). Au vu des effets des organomercuriels et de la réduction de HgII, MerA et MerB sont considérés comme des enzymes clés pouvant servir à la biorestauration des cours d'eau contaminés par les organomercuriels. Une compréhension claire des détails mécanistiques de la façon dont MerA et MerB fonctionnent ensemble au niveau atomique est donc cruciale dans la mise en œuvre de biotechnologies implicant l’opéron mer dans les efforts de bioremédiation. Dans cette étude, nous avons utilisé la résonance magnétique nucléaire (RMN)et la cristallographie aux rayons X pour caractériser la structure et le mécanisme enzymatique de MerB de E. coli. Sur la base d’études structurales précédentes de MerB de E. coli, trois résidus (Cys96, Asp99 et Cys159) ont été identifiés comme constituant la triade catalytique nécessaire au clivage de la liaison carbone-Hg. En guise de suivi aux études antérieures, mon projet consiste d’abord à utiliser la cristallographie aux rayons X afin de définir les rôles de Cys96, Asp99 et Cys159 dans la liaison du substrat et dans le clivage. Deux approches ont été mises en œuvre pour atteindre cet objectif. Tout d'abord, les mutants MerB ont été testés pour définir le rôle des résidus catalytiques. Deuxièmement, les inhibiteurs de MerB et d'autres substrats non organicomercuriels potentiels ont été utilisés pour explorer le site actif de MerB. Une sérine se retrouve à la position de Asp99 dans quatre variants de MerB répertoriés chez les bactéries. Pour mieux comprendre le rôle de Asp99, nous avons comparé la sérine présente dans le variants MerB de Bacillus megaterium (MerB2) et introduit un variant D99S à la protéine MerB du type sauvage d’E. coli (MerB D99S). Nous avons pu constater que la forme purifiée de MerB D99S se caractérisait par une couleur rose après avoir visualisé sa structure cristalline aux rayons X, révélant la présence d'un métal lié au niveau de son site actif. Les analyses par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS) et par fluorescence des rayons X indiquèrent que MerB D99S se liait au cuivre au niveau du site actif. En outre, les analyses par résonance paramagnétique électronique (EPR) et des études de RMN ont identifié la forme CuII du cuivre. L'addition de substrats organomercuriels a pu déplacer le CuII entrainant ainsi une diminution de l’activité catalytique de MerB D99S. En revanche, MerB2 n'a pu être co-purifié avec le cuivre, bien que la structure aux rayons X du complexe MerB2-Hg soit pratiquement identique à la structure du complexe MerB D99S-Hg. Ceci suggère que le résidu Asp99 est essentiel au clivage des liaisons carbone-Hg de composés organiques du mercure et dirige la spécificité de la liaison au métal. De plus, la liaison cuivre-MerB D99S propose un lien possible entre l'évolution de MerB et son homologue structural, la protéine NosL. Dans la seconde approche, nous nous sommes intéressés au site actif de MerB en testant sa liaison à des composés organostanniques et à des composés organoplombiques avec un inhibiteur de MerB connu sous le nom de triéthylétain (TET) qui se lie au résidu Asp99 sans s’associer aux cystéines du site actif. Une liaison similaire a été observée avec un autre inhibiteur à savoir le triméthylplomb (TML). Quant au diméthylétain (DMT), il inhibe MerB à l'aide d'un mécanisme alternatif en se liant d'abord à Asp99 puis à Cys96 conduisant à un changement critique dans le site actif perturbant ainsi l’interaction π-cation entre Trp95 et Arg155. D’autres inhibiteurs comme le diéthylétain (DET) et le diéthylplomb (DEL) ont été caractérisés comme étant un substrat de MerB où les deux groupes éthyle ont été clivés pour donner les produits ioniques SnIV PbIV qui se lient au site actif de manière similaire à HgII. DMT, DET et DEL présentent une affinité pour la liaison à MerB supérieure à celle de son substrat initial MeHg. Ces résultats suggèrent que les composés organomercuriels ne sont pas les seuls substrats pour MerB et Asp99 est le premier résidu à se lier aux composés organométalliques suivis de la liaison à Cys96 et Cys159. Ces observations suggèrent un agrandissement de l’éventail d'applications possibles pour MerB dans la bioremédiation de certains sites contaminés par des composés organométalliques tels les organoplombiques et organostanniques. Mot-clé: Organomercuriallyase, Merb, organoplombiques. Organostanniques, protéine de liaison cuivre, carbone liaison métallique clivage, méthylmercure, Organomercuriels, biorestauration, résonance magnétique nucléaire, la cristallographie aux rayons X. / Mercury is introduced into the environment from either natural occurrences (volcanoes) or from human activities (combustion of fossil fuels). Mercury exists as elemental mercury (Hg0), ionic mercury (HgII) or organic mercury like methylmercury (MeHg) and these forms are in constant flux with each other as part of the natural biogeochemical cycle. Organomercurial compounds like MeHg are the most toxic form because of their hydrophobicity and their ability to efficiently permeate membranes and bioaccumulate in organisms. High levels of MeHg have been found in fish in many areas around the world, and therefore human consumption of contaminated seafood represents a serious danger for human health. Bacteria isolated from mercury-contaminated environments have evolved a system that allows them to efficiently convert both ionic and organic mercury compounds to the less toxic elemental mercury. The mercury resistance is due to the acquisition of a transferable genetic element known as the mer operon. The mer operon encodes for several proteins including two enzymes, the organomercurial lyase MerB and the mercuric ion reductase MerA. MerB catalyzes the protonolysis of the carbon-mercury bond of organomercurial compounds to produce a reduced-carbon compound and inorganic ionic mercury HgII. MerA catalyzes the reduction of HgII to elemental mercury Hg0, which is volatile and less toxic. Due to their ability to cleave MeHg and reduce the resulting HgII product, MerB and MerA are considered crucial to bioremediation efforts to clean up MeHg from contaminated waterways. A clear understanding of the mechanistic details of how MerB and MerA function together at the atomic level is crucial for appropriate utilization of the mer system in bioremediation efforts. We have been using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and X-ray crystallography to structurally and mechanistically characterize E. coli MerB. Based on previous structural studies of E. coli MerB, three residues (Cys96, Asp99 and Cys159) have been identified as a catalytic triad which is required for carbon-Hg bond cleavage. As a follow up to the earlier studies, my project involves using X-ray crystallography to define the roles of Cys96, Asp99 and Cys159 in substrate binding and cleavage. Two different approaches were implemented to fulfill this goal. Firstly, MerB mutants were tested to define the role for the catalytic residues. Secondly, MerB inhibitors and other potential non-organomercurial substrates were used to probe MerB active site. The Cys,-Asp-Cys catalytic triad found in E.coli MerB is conserved in all MerB variants except four variants where aspartic acid is replaced by a serine. To understand the role of Asp99, we compared a serine-containing MerB variant (Bacillus megaterium MerB2) and an E. coli MerB mutant (MerB D99S) to wild type E. coli MerB. Interestingly, the purified MerB D99S protein was found to contain a pink color. X-ray crystal structure indicated the presence of a bound metal in the active site of MerB D99S. Analysis by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) and X-ray fluorescence indicated that MerB D99S binds copper in the active site. Further, electron paramagnetic resonance (EPR) and NMR studies identified the copper as CuII. Addition of organomercurial substrate displaces bound CuII but MerB D99S shows diminished catalytic activity. In contrast, MerB2 did not co-purify with copper although the X-ray structure of MerB2-Hg complex is virtually identical to the structure of the MerB D99S-Hg. This suggests that the aspartic acid residue is crucial for the cleavage of carbon-Hg bonds of organomercurials as well as metal-binding specificity. Furthermore, the binding of copper to the MerB D99S protein suggests a possible evolutionary link between MerB and its structural homolog, the copper-binding protein NosL. In the second approach, we probed the active site of MerB through testing its binding to organotin and organolead compounds. The known MerB inhibitor triethyltin (TET) binds to Asp99 without binding to any of the active site cysteines. A similar binding has been observed with trimethylead (TML). Dimethyltin (DMT) inhibits MerB using an alternative mechanism. It first binds to Asp99 then Cys96, which induces a dramatic change in the active site by disrupting a cation-π interaction between Try95 and Arg155. In contrast, diethyltin (DET) and diethylead (DEL) were found to be substrates for MerB, where both ethyl groups were cleaved and the SnIV and PbIV products bound to the active site in a similar manner to HgII. DMT, DET and DEL show higher binding affinity to MerB than its initial substrate MeHg. These results suggest that organomercurials may not be the only substrates for MerB and Asp99 is the first residue to bind to organometals followed by subsequent binding to Cys96 and Cys159. In addition, these observations suggest that there are other possible applications for employing MerB in bioremediation of organolead and organotin contaminated sites while other organometals may have implications when using MerB in bioremediation systems. Keyword: Organomercuriallyase, MerB, Organolead. Organotin, Copper binding protein, Carbon metal bond cleavage, Methylmercury, Organomercuriels, Bioremédiation, Nuclear magnetic resonance, X ray crystallography.

Les approches thérapeutiques à base d’anticorps monoclonaux font partie des avenues les plus encourageantes pour le traitement de nombreux cancers. Les cellules ovariennes de hamster chinois (CHO) demeurent la plateforme d’expression d’anticorps la plus couramment utilisée dans l’industrie et est actuellement la plus efficace pour la production à grande échelle. Ces cellules sont capables de produire des anticorps présentant un patron de glycosylation très proche du profil humain et d’atteindre des niveaux de production généralement plus élevés que ceux obtenus avec les autres lignées cellulaires continues existantes. Ces dernières années, les progrès accomplis dans le développement de procédés en cuvée alimentée (fed-batch) ont permis d’augmenter significativement les rendements de production. Néanmoins, les performances des procédés de culture demeurent limitées par les caractéristiques métaboliques des cellules utilisées. Celles-ci présentent en effet une glycolyse et une glutaminolyse dérégulées associées à une forte production de métabolites toxiques tels que le lactate et les ions ammonium. Seule une fraction minime du pyruvate issu de la métabolisation du glucose est incorporée dans le cycle des acides tricarboxyliques (ATC), ce qui explique en partie le métabolisme peu efficace des cellules CHO. Une des enzymes responsables de la connexion entre la glycolyse et le cycle des ATC est la pyruvate carboxylase qui catalyse la conversion du pyruvate en oxaloacétate. Dans les cellules CHO, seulement 5 à 10 % du pyruvate est métabolisé par cette enzyme. Ce projet de recherche s’appuie sur l’hypothèse selon laquelle contrer la déficience de l’activité de la pyruvate carboxylase dans les cellules CHO pourrait pallier en partie au phénomène de dérégulation de la glycolyse, ce qui permettrait d’améliorer la productivité d’anticorps des cellules tout en maintenant une glycosylation adéquate du produit final. Au cours de ces travaux, une lignée cellulaire exprimant de façon stable l’enzyme pyruvate carboxylase de levure, au niveau cytosolique (PYC2) a été générée. Cultivées en mode cuvée alimentée, ces cellules ont montré une croissance et une production d’anticorps améliorées par rapport à la lignée parentale non modifiée. L’analyse des flux métaboliques par marquage isotopique a permis de caractériser en détail le métabolisme de ces cellules. Des différences majeures dans la distribution des flux métaboliques intracellulaires notamment au niveau des flux associés à la lactate déshydrogénase et au cycle de Krebs ont été mises en évidence. L’analyse de la glycosylation a révélé pour sa part, que l’augmentation de la production d’anticorps associée à la modification du métabolisme n’avait pas altéré significativement la qualité du produit final. De façon générale, ce projet de recherche semble corroborer l’existence d’un lien entre la productivité d’anticorps et le métabolisme cellulaire. La caractérisation du métabolisme des cellules CHO et plus précisément du métabolisme du lactate participe à améliorer notre compréhension du métabolisme des cellules CHO et pourrait permettre une amélioration plus rationnelle des fonctions cellulaires d’une part, et des conditions de culture d’autre part. / Antibody-based therapy is a promising approach for cancer treatment. Chinese hamster ovary (CHO) cells represents the most common and efficient antibody expression platform for large scale production. Their abilities to perform human-like glycosylation and produce high antibody titer make them the most suitable system compared to other continuous cell lines. In the past few years, advances in fed-batch process development led to significantly increase production yields. Nevertheless, the metabolic features of continuous cell lines constitute a hurdle to the improvement of process performances. Continuous cell lines typically exhibit a deregulated glycolysis and glutaminolysis causing the accumulation of toxic metabolites such as lactate and ammonia. Thus, only a small percentage of pyruvate, derived from glucose, is incorporated into the tricarboxylic acids (TCA) cycle explaining at least, in part the inefficient CHO cell metabolism. The mitochondrial pyruvate carboxylase, which catalyzes the conversion of pyruvate into oxaloacetate, is one of the key enzymes at the junction of the glycolysis and the TCA cycle. In CHO cells, only 5-10 % of the pyruvate pool is metabolized via this pathway. In this project, we hypothesized that counteracting the pyruvate carboxylase deficiency in CHO cells could alleviate in part, the deregulated glycolysis and consequently improve antibody production yield while maintaining satisfactory antibody glycosylation. In this work, a recombinant CHO cell line producing an antibody was further genetically modified with the insertion of a cytoplasmic yeast pyruvate carboxylase (PYC2) gene. Cultivated in fed-batch mode, PYC2 cells exhibited enhanced cell growth and antibody production yield compared to the parental cell line. Metabolic flux analysis using isotopic tracer led to a detailed characterisation of both cell line metabolism. The metabolic flux distribution obtained highlighted major differences in lactate and TCA fluxes. Comparative glycosylation analysis revealed that the metabolism alteration associated with the increase in antibody production did not significantly alter the product quality. This work seems to corroborate the presumed existence of a link between metabolism and antibody productivity. The cell metabolism characterization and more precisely, lactate production contribute to gain knowledge in CHO cell metabolism and led to rationally improve cellular functions and culture conditions.