Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / La glucose-6-phosphatase (G6Pase) catalyse l'hydrolyse du glucose-6- phosphate (G6P), qui est l'étape terminale aussi bien de la glycogénolyse que de la néoglucogénèse. La localisation dans la membrane du réticulum endoplasmique de la G6Pase est suggérée sur des bases biochimiques et génétiques et cette enzyme est constituée de plusieurs composantes. À ce jour, deux composantes du système G6Pase ont été clonées, une sous-unité catalytique de masse moléculaire 36 kDa (p36) et un transporteur putatif de G6P de 46 kDa (p46). Des études topologiques indiquent que p36 et p46 sont très hydrophobiques, avec 9 et 10 domaines transmembranaires, respectivement. Deux modèles différents ont été proposés pour décrire le système complexe de la G6Pase, nommés le modèle de transport du substrat et le modèle conformationnel. La distribution tissulaire de p36 est essentiellement dans les organes néoglucogéniques comme le foie, le cortex rénal et l'intestin grêle, tandis que l'expression de p46 est plus étendue, étant présente dans la majorité des tissus et dans plusieurs lignées cellulaires. La glycogènose de type I (GSD-I) est une maladie autosomale récessive causée par une déficience en G6Pase, caractérisée par une hypoglycémie sévère et une accumulation excessive de glycogène hépatique. Des mutations dans le gène de p36 sont trouvées essentiellement chez les patients GSD-Ia, tandis que des mutations dans le gène de p46 expliquent la majorité des cas de GSD-Ib, le et Id, nouvellement qualifiés de "non a". Puisqu'une augmentation dans l'activité de la G6Pase est associée avec les deux types de diabète sucré et peut donc contribuer à l'augmentation de la production hépatique de glucose dans cette condition, p36 et p46 peuvent être considérés comme des gènes-candidats pour le diabète. La surexpression de p36 dans des hépatocytes et in vivo au moyen d'un adenovirus résulte en une augmentation de la néoglucogénèse et en une diminution du flux glycolytique et de la synthèse de glycogène, tandis que la surexpression de p36 dans les cellules d'insulinome INS-1 invalide la sécrétion d'insuline induite par le glucose. Il est connu que l'activité de la G6Pase est augmentée dans le foie de rats à jeun ou diabétiques. Le clonage des gènes de la G6Pase (qui incluent maintenant les gènes de p36 et p46) et la disponibilité de sondes d' ADNc ont permis d'examiner si les changements d'activité de la G6Pase dans ces conditions était dûe à des altérations dans l'expression de ces gènes ou était la conséquence de modifications post-traductionnelles de l'enzyme. Il a été rapporté que dans les cellules FAO, le niveau d'ARNm de p36 était augmenté par I' AMP cylique et les glucocorticoïdes, tandis que l'insuline avait un effet dominant négatif de suppression de ce gène. Dans ces mêmes cellules, des concentrations élevées de glucose (25 mM) étaient associées avec une quantité accrue d' ARNm de p36 et cette observation fut ultérieurement confirmé dans des hépatocytes en culture primaire et in vivo. L'expression du gène de p36 est donc règlé par des facteurs nutritionels et hormonaux. La régulation du gène de p46 nouvellement cloné, qui joue un rôle essentiel dans la G6Pase, n'a pas encore été exploré. Dans notre travail nous avons caractérisé l'expression de p46 en parallèle avec p36, dans le diabète expérimental, la déficience alimentaire en Pi, divers traitements hormonaux et différentes concentrations de glucose. Chez les rats rendus diabétiques par traitement à la streptozocine, nous avons trouvé une activité élevée de la G6Pase associée avec une augmentation de l'abondance de l 'ARNm de p46 et une augmentation similaire de la protéine p46 dans le foie, le rein et l'intestin, outre la stimulation de l'expression du gène de p36 documenté auparavent. Chez les rats nourris avec une diète déficiente en Pi, les niveaux relatifs d' ARNm de p36 et de p46 étaient augmentés ensemble dans le foie de concert avec une activité accrue de la G6Pase. Nous avons de plus étudié la régulation gènique de p36 et p46 dans les cellules HepG2, dont les concentrations de nutriments et d'hormones peuvent être aisément manipulés dans le milieu de culture. Nous avons trouvé que le glucose causait une augmentation dose­dépendante dans l'expression des gènes de p36 aussi bien que de p46 au niveau de l 'ARNm et des protéines. Cependant, des études dose-réponse de différentes hormones et agents affectant l'expression des gènes de p36 et p46 ont révélé des sensibilités différentes de ces deux composantes du système G6Pase. Nous montrons dans les cellules HepG2 qu'alors que l'insuline, à des concentrations physiologiques (0.01-10 nM), supprimait l 'ARNm de p36, celle de p46 n'était affectée que de 20-30% et réduite au plus à 50% avec 1 µM d'insuline. De plus, l'AMP cyclique, le glucagon, ainsi que la thapsigargine (un inhibiteur de la Ca2+-ATPase du RE) augmentaient l'ARNm de p36 aux concentrations 10-100 nM, sans affecter la transcription du gène de p46. Par contre, la dexamethasone (0.1-100 nM) augmentait similairement l'ARNm de p36 et de p46. Afin de caractériser ultérieurement l'impact métabolique d'une expression accrue de p46 et de comprendre la fonction de la protéine p46, nous avons surexprimé celle-ci au moyen d'un adenovirus recombinant dans des hépatocytes de rat en culture primaire. Les résultats montrent que la surexpression de p46 a pour conséquence d'induire l' ARNm de p36 et l'activité de la G6Pase. On observait également une diminution de la synthèse du glycogène et du flux glycolytique ainsi qu'une augmentation de la dégradation du glycogène. Puisque des mutations de p46 ont été trouvées chez des patients GSD-1 non a, qui ont par rapport aux patients GSD-1 a des symptômes additionnels comme une neutropénie et une dysfonction des neutrophiles et des monocytes, nous avons formulé l'hypothèse que p46 pourrait avoir d'autres fonctions que celle de contrôler p36, qui est absent des leucocytes. De plus, nous avons d'abord découvert dans une librairie d' ADNc de leucocytes humains et avons ensuite confirmé dans des échantillons sanguins la présence de quatre transcrits différents du gène de p46, dont trois ne sont pas présent dans le foie. Cette découverte supporte la possibilité que d'autres produits du gène de p46, possédant des fonctions distinctes, puissent être formés par épissage alternatif. En conclusion, nos résultats indiquent: (1) que dans le diabète insulinoprive, l'hyperglycémie, la déficience en insuline et l'augmentation de l 'AMP cyclique due à des hormones contrerégulatrices non opposées peuvent contribuer de façon indépendante l'un de l'autre à une expression accrue des gènes de p36 et p46. La surexpression de p46 avec un adenovirus recombinant résulte en des changements métaboliques semblables à ceux d'une surexpression de p36, indicant que des dérégulations aussi bien de p36 que de p46 peuvent être impliquées dans l'activité accrue de la G6Pase, menant à une production hépatique de glucose plus forte qui peut exacerber l'hyperglycemie du diabète; (2) que la régulation hormonale distincte de p36 et p46 indique que celles qui affectent seulement p36 coïncide avec des modifications connues de la production hépatique de glucose, tandis que celles qui affectent p36 et p46 sont consistantes avec une stimulation de la synthèse de glycogène; (3) que p46 pourrait être une protéine multifonctionnelle avec des propriétés tissulaires spécifiques. Dans les tissus où p36 est présent, comme dans le foie, p46 pourrait founir le G6P nécessaire à son hydrolyse par p36. Dans d'autres tissus, qui ne possèdent pas p36, p46 a probablement d'autres fonctions qui sont déficientes dans les leucocytes des patients GSD-lb. / Glucose-6-phosphatase (G6Pase) plays an important role in glucose metabolism by catalyzing the terminal step of both glycogenolysis and gluconeogenesis. Although G6Pase is proposed to be a multifunctional and multicomponent system residing in the membrane of endoplasmic reticulum, until now neither the structure of its components nor the function of each protein has been totally understood. So far two components of the G6Pase system have been cloned, including the G6Pase catalytic subunit (p36) and the putative glucose-6-phosphate translocase (p46). Genetie deficiency of G6Pase leads to glycogen storage disease type-1 (GSD-1), while mutations in p36 and p46 genes account for GSD-Ia and most of GSD-1 non a respectively. Furthermore, diabetes mellitus is associated with increased G6Pase activity, which may contribute to the enhanced hepatic glucose production. Previous studies have shown that p36 gene express10n 1s under nutritional and hormonal regulation. In this work, the gene regulation of newly cloned p46 was investigated and compared with that of p36 gene. We found that under the conditions like increased glucose concentration, dietary phosphate deprivation or streptozotocin-induced diabetes, p36 and p46 genes were similarly up-regulated. However, the sensitivities of these two genes to different hormones or reagents were found to be quite different as shown in HepG2 hepatoma cells. Insulin has dominant negative effects on bath p36 and p46 gene expression, but compared to p36, p46 gene has a much .lower sensitivity to insulin. Glucagon, cAMP and thapsigargin significantly increase p36 gene transcription but barely affect p46 gene, while glucocorticoids remarkably and sensitively induce bath genes. Based on the distinct hormonal regulation of p36 and p46 gene expression, their possible roles in glucose metabolism were proposed. We explored in two ways to study the yet unclear p46 function: (1) On the one hand, in order to study the p46 function in hepatic G6Pase system, we perfonned p46 overexpression in hepatocytes via recombinant adenovirus mediated gene transfer, which resulted in induced p36 transcription and increased G6Pase activity. In addition, overexpression of p46 led to significant metabolic impacts in primary hepatocytes, including decreased glycogen synthesis, increased glycogen degradation and decreased glycolysis; (2) On the other hand, we studied p46 gene transcription in leucocytes, where p36 is absent, and identified four different p46 transcripts, three of which are not present in liver. We hypothesize that mutated p46 gene might be responsible for neutropenia and neutrophil dysfunctions seen in GSD-Ib and le; p46 may bear other functions in leucocytes by differential mRNA splicing. In conclusion, we characterized the gene regulation of newly cloned p46 gene, investigated effects of adenovirus mediated overexpression of p46 on glucose and glycogen metabolisms and discovered different transcripts of p46 gene in leucocytes. Key works: glucose-6-phosphatase catalytic subunit; putative glucose-6- phosphate translocase; glucose; phosphate; hormones; gene regulation; overexpress10n.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le récepteur nucléaire orphelin NGFI-B s'est démarqué des autres récepteurs nucléaires par sa capacité à lier I'ADN sous la forme de monomère. L'importance de ce facteur de transcription a été mise en évidence par son rôle dans l'apoptose des cellules T et par son implication à tous les niveaux de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (axe HHS). Le stress induit une cascade neuroendocrinienne qui débute, au niveau de l'hypothalamus, par la sécrétion de CRH qui induit l'expression de NGFI-B dans les cellules corticotrophes de l'hypophyse, et NGFI-B à son tour induit la transcription du gène de la proopiomélanocortine (POMC) en liant un élément de réponse aux facteurs Nur, le NurRE. Cet élément de réponse a la particularité de lier des dimères de Nur77. La POMC est le précurseur de l'ACTH qui est le stimulus majeur de la synthèse des glucocorticoïdes. Les glucocorticoïdes activent ou répriment la transcription de différents gènes importants pour le métabolisme en liant un récepteur nucléaire (GR). Une surexpression de glucocorticoïdes peut avoir des conséquences néfastes sur l'organisme. Aussi régulent-ils leur propre synthèse en exerçant une rétro-inhibition de l'axe HHS en inhibant l'expression et la sécrétion du CRH et de la POMC/ACTH. Les glucocorticoïdes inhibent la transcription de la POMC induite par le CRH en agissant au niveau du NurRE en antagonisant l'activité transcriptionnelle de NGFI-B. Le but de cette étude consistait à déterminer les mécanismes qui sont sous-jacents à l'antagonisme transcriptionnel entre NGFI-B et GR. Nous avons émis l'hypothèse qu'une interaction protéine/protéine directe ou indirecte (séquestration d'un cofacteur commun aux deux récepteurs nucléaires) entre NGFI-B et GR est impliquée dans la répression de la transcription de la POMC. Afin de vérifier cette hypothèse nous avons utilisé des techniques qui permettent d'étudier la nature des interactions entre deux protéines. Ainsi, nous avons démontré une interaction directe entre NGFI-B et GR via leurs domaines de liaison à l'ADN. Cette interaction s'applique aux autres membres de la famille Nur. Nous avons également démontré que GR interagit avec NGFI-B sous la forme de monomère. En parallèle, nous avons observé que l'activité transcriptionnelle de NGFI-B est stimulée par des coactivateurs de la famille SRC et par CBP. Nous avons observé que les dimères ont une capacité plus grande à recruter les coactivateurs que les monomères. Certains résultats expérimentaux suggèrent que l'antagonisme transcriptionnel entre NGFI-B et GR puisse s'appliquer à la régulation de la transcription du gène codant pour le CRH. De plus, il a été démontré que dans les cellules T, les glucocorticoïdes bloquent l'apoptose induite par l'activation du TCR en antagonisant l'activité transcriptionnelle de NGFI-B. Ceci reflète l'importance de l'identification de ce nouveau mécanisme d'action des glucocorticoïdes. De plus, ce mécanisme est similaire à celui qui avait été démontré dans le contrôle de ['expression des gènes impliqués dans la réponse inflammatoire et/ou immunitaire où GR antagonise l'activité transcriptionnelle de NF-KBetAP-1.

La stéroïdogenèse dans les cellules de Leydig est liée au récepteur nucléaire NR4A1. Ce récepteur nucléaire régule la transcription du gène Star qui code pour une protéine essentielle à la stéroïdogenèse. L’expression de Nr4a1 est régulée par trois promoteurs distincts dont l’activité est hormonalement régulée. Deux de ces promoteurs ont été récemment décrits et ont été nommés Nr4a1 IB et Nr4a1 IC (le promoteur original a été renommé Nr4a1 IA). Des analyses qPCR ont montré que ces promoteurs sont actifs dans les cellules de Leydig MA-10 et qu’ils répondent à une stimulation hormonale. Ces promoteurs ont été isolés et fusionnés au gène rapporteur luciférase, et des délétions 5’ progressives ont été produites. Par transfections transitoires dans les cellules de Leydig MA-10 et MLTC-1, deux zones régulatrices importantes ont été localisées pour le promoteur Nr4a1 IB : l’une pour l’activité basale et l’autre, pour l’activation hormonale par l’AMPc et la LH. Bien que la transcription de Nr4a1 soit principalement activée par la voie de l’AMPc, une stimulation par la LH active d’autres voies qui peuvent influencer son profil d’expression. La majorité des études publiées n’ont pas exploré ces voies. À cet égard, la voie PKC est en mesure d’augmenter la quantité d’ARNm et l’activité promotrice de Nr4a1. Par ailleurs, l’inhibition des kinases PKA et PKC suite à une stimulation par la LH montre un profil d’ARNm qui peut être expliqué par l’existence du promoteur Nr4a1 IB récemment identifié dans les cellules de Leydig. Ces données supportent l’existence d’une régulation de l’expression de Nr4a1 impliquant d’autres seconds messagers que l’AMPc et le calcium. Par ailleurs, de nouveaux facteurs de transcriptions ont été testés comme régulateurs des promoteurs alternatifs de Nr4a1. Ces facteurs de transcription son SRF, CLOCK et BMAL1, et c-MAF. Ces informations contribuent à une meilleure compréhension de la régulation de la stéroïdogenèse.

L’antibiorésistance est un problème de santé publique majeur, causé principalement par l’usage abusif d’antibiotiques dans les élevages. Les probiotiques sont une alternative potentielle aux antibiotiques. Cependant, acheminer ces microorganismes vivants et fonctionnels jusqu’au côlon est un grand défi, à cause du pH et des sels biliaires à affronter lors du passage gastro-intestinal. L’objectif de ce travail était de développer une matrice prébiotique capable de maintenir la survie et l’activité des probiotiques pendant le transit gastro-intestinal et de permettre leur libération dans le côlon. Pour atteindre cet objectif, cinq types de matrices sphériques (A, AI5, AI10, AI15, AI20) à base d’inuline (0 %, 5 %, 10 %, 15 % et 20 %) et d’alginate (2 %) ont été préparés par la méthode d’extrusion/gélification ionotropique. Trois souches probiotiques ont été utilisées au cours du développement des billes : Pediococcus acidilactici UL5 (UL5), Lactobacillus reuteri (LR) et Lactobacillus salivarius (LS). Dans un premier temps, toutes les formulations ont été caractérisées d’un point de vue physicochimique et microbiologique. Ces analyses ont permis de révéler une distribution homogène de l’inuline et de l’alginate au sein des matrices et ont démontré que la viabilité et la capacité antimicrobienne des souches utilisées n’étaient pas affectées par l’encapsulation. À la lumière de ces résultats, trois formulations A, AI5 et AI20 ont été sélectionnées pour la suite de l’étude. Dans un deuxième temps, la mucoadhésion et le comportement des billes A, AI5 et AI20 ont été étudiés dans les parties supérieures du tractus gastro-intestinal. Ces études ont démontré que la présence de l’inuline améliore les propriétés mucoadhésives des billes. Elles ont également établi que seule la formulation AI5 résiste jusqu’à la fin de la digestion. Ce comportement est expliqué en partie par l’interaction alginate-inuline décelée par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR). Cette interaction était stable pour les billes AI5 au pH 6,8 mais instable pour la formulation AI20. Enfin, le comportement et la dynamique bactérienne de la formulation AI5 dans les milieux coliques fermenté et non fermenté ont été étudiés. Cette étude a révélé que les billes AI5 se dégradent et libèrent la totalité des bactéries après environ 4 heures d’incubation dans le milieu fermenté. Cette dégradation est due aux enzymes très abondantes dans ce milieu. En conclusion, la formulation AI5 s’est avérée être un très bon véhicule pour protéger les bactéries dans les parties supérieures du tube digestif et favoriser leur libération dans le côlon. Elle pourrait donc, être utilisée pour une application en alimentation animale. / Antibioresistance is a major public health issue, principally caused by the abusive use of antibiotics in farming. Probiotics are a potential alternative to antibiotics. However, delivering them alive and functional to the colon is a great challenge because of the pH and bile salts faced within the gastrointestinal tract. This work aims to develop a prebiotic matrix able maintain the probiotics alive and active during the gastrointestinal transit and able to release them in the colon. To reach this objective, five types of beads (A, AI5, AI10, AI15, AI20) were made of inulin (0 %, 5 %, 10 %, 15 % and 20 %) and alginate (2%) by extrusion/ionotropic gelation method. Three probiotic strains were used during the conception of the beads: Pediococcus acidilactici UL5 (UL5), Lactobacillus reuteri (LR) and Lactobacillus salivarius (LS). Firstly, all the formulations underwent physicochemical and microbiologic characterizations. These first characterizations revealed high yields of the inulin trapped in the beads. They also revealed the homogeneous distribution of inulin and alginate inside the matrix and demonstrated that the encapsulation did not affect the viability and the antimicrobial activity of the used strains. In the light of these results, the A, AI5 and AI20 formulations were chosen to continue the study. Secondly, the mucoadhesiveness and the behaviour of the A, AI5 and AI20 within the upper parts of the intestinal tract were studied. These studies demonstrated that the presence of inulin improve the mucoadhesiveness of the beads. They also demonstrated that only the AI5 formulation was able to resist until the end of the digestion. This behaviour was partly explained by the interaction of the alginate and the inulin found by the FTIR. This interaction was stable for the AI5 beads in pH 6.8 but unstable for the AI20 formulation. Finally, the behaviour and the bacterial dynamics of the AI5 formulation in the fermented and unfermented colonic medium were studied. This study revealed that the AI5 beads were degraded and released all of the bacteria after around 4 hours in the fermented medium. This degradation is probably due to the enzymes abundantly present in this medium. In conclusion, the abilities of AI5 formulation to protect the bacteria in the upper parts of the digestive tract and to release them to the colon can be affirmed. It could be used for an application in animal feeding.

Chaque année, les compagnies novatrices mettent sur le marché des nouvelles molécules à visée thérapeutique, pour le bien-être de tous. Dans le développement de ces nouveaux médicaments, les études de métabolisme et l'évaluation des interactions médicamenteuses potentielles constituent une étape essentielle et requise pour l'approbation réglementaire. L'approche expérimentale est basée sur l'utilisation des modèles animaux et les données recueillies servent à la prédiction de la cinétique et de la toxicité chez l'humain. Plusieurs espèces, incluant la souris, le rat, le chien, le lapin, le porc et le singe, sont ainsi utilisées. Cependant, cette approche souffre de quelques limites, en particulier des différences inter-espèces au niveau des enzymes impliqués dans la biotransformation des médicaments chez l'humain, dont les cytochromes P450. De ce fait, il n'est pas rare d'utiliser plusieurs modèles animaux pour prédire la cinétique et la toxicité chez l'homme. Le cobaye (cavia porcellus), qui présente plusieurs avantages au niveau de sa physiologie, pourrait ainsi constituer un modèle animal de plus pour ces études. L'objectif de cette étude est donc de caractériser la sous-famille des cytochromes P450 2C, le transporteur membranaire MDRl/P-gp ainsi que les récepteurs nucléaires PXR et CAR chez le cobaye. Cette étude s'inscrit dans un effort de fournir des données fondamentales afin de supporter l'utilisation de cet animal comme modèle de métabolisme des médicaments. Pour ce faire, les séquences des gènes codant pour ces protéines ont été déterminées par des techniques de biologie moléculaire. L'immunobuvardage de type Western a permis de démontrer l'expression des protéines CYP2C, P-gp/MDRl et PXR. Des études fonctionnelles pour le CYP2C ont été réalisées par l'incubation de microsomes hépatiques de cobaye avec le diclofenac et le tolbutamide, deux substrats du CYP2C9 chez l'homme, en présence des inhibiteurs spécifiques au CYP2C9 ; le sulfaphénazole, l'acide tiénilique et le fluconazole, et au CYP3A4; le kétoconazole. Ces études ont démontré la formation de 4'-hydroxydiclofénac et de 4'-hydroxytolbutamide, deux metabolites du CYP2C9, et l'inhibition de ces réactions par l'acide tiénilique seulement. Des études fonctionnelles de P-gp/MDRl ont été réalisées avec l'essai d'accumulation de calcéine-AM dans des cellules HEK293 transfectées avec le gène ABCB1/MDR1 de cobaye. Elles ont démontré une activité de transport à l'égard de ce substrat, et une inhibition par le verapamil, un inhibiteur de la P-gp. Les études de distribution de la P-gp/MDRl, par les techniques de PCR et d'immunobuvardage de type Western, ont démontré l'expression de cette protéine dans l'intestin, le foie, le poumon, le ventricule, l'oreillette, le cervelet, le lobe du cerveau et la glande surrénale du cobaye. Bref, ces résultats montrent que le cobaye exprime un enzyme fonctionnel de la sous-famille des cytochromes P450 2C, le transporteur membranaire P-gp/MDRl fonctionnel et les récepteurs nucléaires PXR et CAR. En se basant sur ces résultats et considérant l'importance de ces protéines dans la biotransformation des médicaments, il est raisonnable de postuler que cela renforce la pertinence d'utiliser cet animal comme modèle dans de telles études.

Introduction Le trouble lié aux substances est une condition neuropsychiatrique complexe particulièrement difficile à traiter avec les méthodes thérapeutiques actuelles et les rechutes sont fréquentes. Le craving, cette envie de consommer la substance, est un facteur critique dans la rechute. Les techniques de stimulation cérébrale non-invasive telles que la stimulation transcrânienne par courant continu (tDCS) et la stimulation magnétique transcrânienne répétée (rTMS) ont démontré des résultats intéressants dans plusieurs conditions psychiatriques, dont dans la réduction du craving chez les patients souffrant de troubles liés aux substances. Cela dit, les mécanismes d’action de ces techniques demeurent mal définis. Objectifs L’objectif de cette thèse est de déterminer les mécanismes d’action de la tDCS et rTMS, et de les mettre en perspective dans le trouble lié aux substances. Méthodes Nous avons effectué 3 études combinant la tDCS ou rTMS avec l’imagerie par résonance magnétique (IRM). Nous avons combiné la stimulation cérébrale avec la spectroscopie par résonance magnétique (MRS), qui permet de quantifier la concentration de métabolites cérébraux, et l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), qui permet de mesurer la connectivité fonctionnelle entre structures cérébrales. Résultats La première étude a combiné l’administration de la tDCS au cortex préfrontal et la MRS. Les résultats démontrent que la tDCS permet l’élévation de n-acétylaspartate (NAA) et glutamine+glutamate (Glx) dans le cortex préfrontal dorsolatéral (DLPFC) et le striatum. Ceci suggère que la tDCS a un effet excitateur rapide sur le DLPFC et facilite la transmission corticostriatale. La deuxième étude a combiné la tDCS avec l’IRMf, dans un devis expérimental calqué sur celui de l’étude 1. Les résultats indiquent que la tDCS administrée au DLPFC augmente la connectivité fonctionnelle entre le DLPFC et le striatum, ce qui suggère une augmentation de l’activité des voies corticostriatales. La troisième étude est une étude de cas clinique où nous avons administré la rTMS à un patient du trouble lié aux substances et obtenu des mesures en MRS avant puis après la rTMS. Les résultats cliniques démontrent une diminution du craving et des symptômes anxieux chez le patient. Les résultats neurophysiologiques démontrent que la rTMS a permis l’élévation de NAA et Glx dans le DLPFC, striatum et le cortex cingulaire. Ces résultats suggèrent que la rTMS a un effet excitateur sur le DLPFC et ses structures sous-jacentes, ce qui pourrait expliquer la diminution de symptômes. Conclusion Les résultats démontrent que la tDCS et la rTMS administrés au DLPFC ont des effets excitateurs locaux, sur le DLPFC, et distaux, suivant les voies corticostriatales. Ces résultats suggèrent que ces techniques peuvent moduler l’activité des voies glutamatergiques préfrontales. Ceci pourrait participer à diminuer le craving chez les patients de dépendances aux substances et suggère que la stimulation cérébrale non-invasive est une technique alternative à explorer dans cette perspective. / Introduction Substance use disorders (SUD) is a complex neuropsychiatric disorder that is particularly difficult to treat with conventional treatment methods and relapse is frequent. Cravings are a critical factor in relapse and constitute an important target for abstinence. Noninvasive brain stimulation techniques such as transcranial direct current stimulation (tDCS) and repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) have demonstrated interesting clinical potential in a wide range of neuropsychiatric disorders, including the decrease of craving in patients of SUD, when administrated to the dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). However, neurophysiological mechanisms of action of tDCS and rTMS remain largely unknown. Objectives The objective of the thesis is to characterize some of these mechanisms of action and put them in perspective of its potential therapeutic effect in SUD. Methods To investigate this, we conducted 3 studies combining tDCS or rTMS and magnetic resonance imaging (MRI) techniques in healthy individuals and SUD patients. We combined brain stimulation with agnetic resonance spectroscopy (MRS), which allows to measure levels of brain metabolites within a voxel of interest, and functional MRI (fMRI), which allows to measure functional connectivity levels between cerebral structures. Results The first study combined prefrontal tDCS and MRS in healthy subjects. Results show that tDCS elevated brain metabolites n-acetylaspartate (NAA) and glutamine+glutamate (Glx) in the DLPFC and striatum. This suggests that tDCS has fast excitatory effects over the DLPFC and facilitates corticostriatal transmission. The second study replicated the same design as the first one, with tDCS combined with fMRI. Results show that tDCS elevated functional connectivity of the DLPFC with the striatal region, suggesting a fast excitatory effect of the corticostriatal pathways. The final study is a case report in which we administrated rTMS to the prefrontal cortex of a SUD patient. We gathered MRS measurements before and after the rTMS regimen. Clinical results show that rTMS decreased cravings for substances and anxiety symptoms. Neurophysiological results show that rTMS elevated levels of NAA and Glx in the DLPFC, striatum and cingulate cortex. These results suggest that rTMS has an excitatory effect over the DLPFC and its downstream targets, which may explain reduction of symptoms of SUD and anxiety. Conclusion Taken together, these findings suggest that tDCS and rTMS of the DLPFC have excitatory effects on the stimulation target and downstream structures. This suggests that tDCS and rTMS can modulate activity within prefrontal glutamatergic pathways. Such effects may explain reduction of craving in patients of SUD and support the idea that noninvasive brain stimulation has therapeutic potential in this condition.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / Les travaux présentés dans la présente thèse proposent un avancement des connaissances tant en termes de développement fondamental de méthodes d'analyse en dynamique moléculaire et en arrimage moléculaire, qu'en avancement des connaissances dans le domaine du développement pharmaceutique dans trois contextes. Le premier contexte est celui de la calcification de la valve aortique. Il s'agit d'une problématique qui augmente constamment en prévalence, surtout avec le vieillissement de la population. L'inhibition de la protéine Ectonucleotidase pyrophosphatase/phosphodiestérase de type 1 (NPP1) a été démontrée in vivo comme une avenue de traitement possible de cette condition. La dynamique moléculaire a été utilisée pour caractériser la dynamique et les réseaux d'interactions de cette protéine. Pour cette analyse, une nouvelle méthode a été mise au point. De plus, la dynamique moléculaire a aussi été utilisée pour faire la recherche de sites de liaisons allostériques potentielles sur NPP1 en vue d'identifier le site de liaison de l'inhibiteur QPS1. Le second contexte est celui du cancer du sein estrogéno dépendant. Le cancer du sein fait partie des principales causes de mortalité dans le monde et la majorité de ces cancers sont estrogénos dépendants. La protéine 17β-Hydroxystéroïde déshydrogénase de type 1 (17β-HSD1) est impliquée dans la prolifération de ces cancers. L'arrimage moléculaire a été utilisé pour développer une relation de structure-activée entre trois séries d'inhibiteurs de dérivés de l'estradiol. La première série de molécules présente une mode d'inhibition covalente irréversible. Une nouvelle méthodologie a été mise au point pour l'arrimage de ces composés. La relation de structure-activité développée pour ces trois séries de molécules ouvrent la porte vers de nouvelles modifications potentielles. Enfin, le troisième contexte est celui des produits naturels. Ces derniers sont une source énorme de nouvelles molécules thérapeutiques. L'étude par modélisation porte sur les produits naturels éther de diphényle qui ont été caractérisés comme ayant un potentiel anti-inflammatoire. La comparaison de structure en 2D et l'arrimage moléculaire ont permis d'identifier le Récepteur gamma activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPAR-γ) comme une cible pouvant expliquer leur effet anti-inflammatoire. La relation de structure-activité développée ouvre sur des directions d'améliorations potentielles. / The work described in this thesis proposes an advancement of knowledge both in terms of fundamental development of analytical methods in molecular dynamics and molecular docking, and an advancement of knowledge in the field of pharmaceutical development in three contexts. The first context is that of aortic valve calcification. This is a problem that is constantly increasing in prevalence, especially with the aging of the population. Inhibition of the enzyme Ectonucleotidase pyrophosphatase / phosphodiesterase type 1 (NPP1) has been shown in vivo as a possible treatment avenue for this condition. Molecular dynamics has been used to characterize the dynamics and interaction networks of this protein. For this analysis, a new method has been developed. In addition, molecular dynamics was also used to search for potential allosteric binding sites on NPP1 in order to identify the binding site of the QPS1 inhibitor. The second context is that of estrogen-dependent breast cancer. Breast cancer is one of the leading causes of death worldwide and the majority of these cancers are estrogen dependent. The protein 17 β-Hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (17β-HSD1) is involved in the proliferation of these cancers. Molecular docking was used to develop an activated structural relationship between three series of inhibitors of estradiol derivatives. The first series of molecules presents a mode of irreversible covalent inhibition. A new methodology has been developed for the docking of these compounds. The structure-activity relationship developed for these three series of molecules opens the door to new potential modifications. Finally, the third context relates to natural products. These are a huge source of potential new therapeutic molecules. The modelling study focuses on natural diphenyl ether products that have shown anti-inflammatory activity. The 2D structure comparison and molecular docking allowed the identification of the gamma receptor activated by peroxisome proliferators (PPAR-γ) as a target that may explain their anti-inflammatory effect. The structure-activity relationship developed opens up potential directions for improvement.

Le néocortex déclenche des activités paroxystiques suite aux lésions cérébrales traumatiques. Avec des blessures cérébrales pénétrantes, la déafférentation s'accompagne d'une longue période silencieuse du cortex atteint, et d'une augmentation des périodes d'hyperpolarisation du néocortex entourant la lésion. L'activité synchrone du réseau neuronal après une période de latence conduirait à l'épileptogenèse. Des tentatives de modifier la nature des crises ont été effectuées à l'aide de modèles animaux. L'une des plus prometteuse étant la chimiogenèse par l'injection des vecteurs viraux afin d'anéantir la réponse de certains récepteurs couplés aux protéines G aux ligands habituels, alors qu'ils réagissent aux médicaments désirés, comme N-oxyde de clozapine. Ces récepteurs appelés « DREADDs » exclusivement activés par ces médicaments ont été étudiés pour réduire le nombre et la sévérité des crises. Selon les résultats non-publiés de notre laboratoire, l'utilisation d'un DREADD excitateur près de «undercut» serait antiépileptogène. Nous pensons qu'une excitation ciblée pourrait optimiser l'effet antiépileptogène. L'excitation est directement liée aux neurones transduits. Nous postulons qu'une transduction optimale des neurones pourrait être atteinte par un dosage optimisé du virus injecté, tant au titre viral qu'au volume injecté. Pour prouver notre hypothèse nous avons utilisé trois différentes titrations de AAV2/8 et injecté différents volumes de ces titrations aux souris. Le volume de transfection corticale et le nombre des neurones transduits ont été quantifiés. Avec la titration E11gc/ml aucune transfection n'a été observée. Avec la titration E12gc/ml une corrélation quasi-linéaire a été observée entre le volume viral injecté, et le volume cortical transfecté, ainsi que le nombre de neurones transduits. Avec la titration E13gc/ml, une meilleure corrélation a été observée à la transduction neuronale qu'à la transfection corticale, par rapport au volume viral injecté. En conclusion, la titration E12gc/ml paraît être un meilleur choix pour nos futures études, la fiabilité de la titration E13gc/ml n'ayant pas été démontrée. / The neocortex is the origin of paroxysmal activities that occur after traumatic brain injuries. In penetrating brain injuries, deafferentation causes long silent periods in affected cortex and increased hyperpolarization period in neocortical tissue around the injury. The synchronous neural network activity after a latent period may lead to epileptogenesis. Some attempts to alter seizures were done using animal models. One of the most promising involves chemogenetic tools via AAV viral vector injection to make some G protein-coupled receptors unresponsive to their natural ligands, and activated by the desired drug, such as clozapine-N-oxide. These designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADDs) have been studied in reducing the numbers and severity of seizures. According to unpublished works in our lab, using excitatory DREADDs in the vicinity of undercut was antiepileptogenic. We believe there could be an optimal level of excitation for yielding an optimal antiepileptogenic response. This excitation is in direct relation with neurons transfected. We hypothesize that the optimal neuronal transduction might be achieved with optimal dosage of virus delivered, in terms of viral titration and the volume of virus injected. To test this, we used three different titrations of AAV2/8 and we injected different volumes of these titrations in adult mice. Cortical transfection volume and number of neuronal transductions were estimated. With E11gc/ml titration, no transfection was visible. With E12gc/ml titration, an almost linear correlation was observed between the volume of virus injected and the number of neurons transduced and the cortical volume of transfection. With E13gc/ml titration the correlation between the injected AAV volume and the number of neuronal transductions was still good but there was a poor correlation between AAV volume and transfection volume. We concluded that E12gc/ml titration was a more reliable option for our further studies. The reliability of E13gc/ml titration needs to be proven.

Les allocolchicinoïdes constituent une famille de composés présentant un système tricyclique de 6, 7 et 6 carbones respectivement, dont le premier cycle est hautement oxygéné. Plusieurs membres de cette famille possèdent des propriétés biologiques intéressantes. Leurs propriétés anticancéreuses envers une variété de lignées cancéreuses résistantes ont augmenté l'intérêt pour ce type de composé depuis quelques années. Afin d'exploiter des résultats novateurs obtenus récemment dans notre laboratoire, notre groupe de recherche s'est attaqué à la synthèse d'analogues d'allocolchicinoïdes. Celle-ci fait intervenir, comme étapes clés, un couplage de Suzuki menant à des o-aminométhylbiphényles ainsi qu'une cyclisation énantiosélective 7-exo-tet provenant d'une réaction de lithiation-substitution utilisant un complexe chiral BuLi?ligand. Dans ce contexte, une librairie de ligands chiraux a été synthétisée. Les résultats pour l'affinité de ces ligands envers différents métaux ainsi que les résultats préliminaires en synthèse énantiosélective seront présentés dans cette thèse.

NOR-1 appartient à la superfamille des récepteurs nucléaires qui regroupe une variété de facteurs de transcription, dont les récepteurs des hormones thyroïdiennes, des hormones stéroïdiennes, des acides rétinoïques, de la vitamine D. Ces protéines produisent une multitude de réponses biologiques via la régulation de gènes cibles. Ils régulent différentes fonctions cellulaires, dont la prolifération, la différentiation, l’apoptose et l’homéostasie. Ils peuvent également être impliqués dans la tumorigénèse. NOR-1, NGFI-B et NURR1 forment une sous-famille de récepteurs nucléaires orphelins. Ces protéines sont plus spécifiquement associées au développement et à l’homéostasie du système nerveux central. Elles sont codées par des gènes de réponse précoce, dont la transcription est rapidement induite, dans différents types cellulaires, lorsque stimulée par des facteurs de croissance. NGFI-B et NOR-1 exerceraient une fonction importante dans le processus de sélection négative des cellules T lors de l’apoptose induite par l’activation des récepteurs TCR. De plus, NGFI-B, NOR-1 et NURR1 seraient impliqués dans le contrôle de l’axe hypothalamo/hypophyso/surrénalien. L’inactivation du gène NURR1 chez la souris a permis de révéler son rôle essentiel dans le développement des neurones dopaminergiques du mésencéphale. Aucun phénotype majeur n’a été observé à ce jour chez la souris homozygote mutante pour NGFI-B. La fusion des gènes EWS et NOR1 a été mise en évidence dans des tumeurs osseuses de type chondrosarcome myxoïde extrasquelettique. Cette translocation chromosomique est à l’origine de la synthèse d’une protéine hybride formée de l’extrémité N-terminale de EWS et de la séquence de NOR-1 complète. Cette protéine de fusion, appelée EWS/NOR-1, jouerait un rôle crucial dans le développement tumoral. EWS n’est pas l’unique partenaire de NOR-1 dans les chondrosarcomes myxoïdes estrasquelettiques. Trois autres protéines liées au récepteur nucléaire selon le même patron ont été identifiées, soit TAF 2N, TCF12 et TFG. Nous avons comparé l’activité transcriptionnelle des protéines NOR-1 et EWS/NOR-1. Le domaine d’activation AF2 du récepteur nucléaire NOR-1 serait essentiel à l’activité transcriptionnelle de l’oncogène EWS/NOR-1. Ces résultats suggèrent le recrutement de coactivateurs spécifiques à NOR-1 lors du processus tumoral menant au développement des chondrosarcomes myxoïdes extrasquelettiques. Au moment d’initier nos travaux, aucune souris déficiente pour le récepteur NOR-1 n’avait encore été produite. Afin de mieux comprendre le rôle du récepteur nucléaire orphelin NOR-1, plus particulièrement chez les mammifères, nous avons inactivé le gène chez la souris. Au préalable, l’analyse de la structure du gène, de son patron d’expression ainsi que des différentes isoformes de la protéine a été effectuée. Nos résultats montrent une absence de phénotype majeur qui pourrait découler en partie d’une redondance fonctionnelle exercée par NGFI-B et/ou NURR 1. / NOR-1 is a member of the nuclear receptor superfamily which comprises a great diversity of transcription factors. The steroid, thyroid, retinoid, and vitamin D receptors represent some widely-know members of this superfamily. The nuclear receptors induce a vast number of biologic responses by the regulation of target genes. They are involved in the control of different cell functions like growth, differentiation, metabolism and apoptosis. They also play roles in tumorigenesis. NOR-1, NGFI-B and NURR1 form a subfamily of orphan nuclear receptors. They are associated to the central nervous system development and homeostasy. These proteins are coded by immediate-early genes which are rapidly induced by growth factors in different cell types. NOR-1 and NGFI-B have an important function in T-cell receptor (TCR)-mediated apoptosis. NOR-1, NGFI-B and NURR1 could be involved in neuroendocrine control at the level of the hypothalamic/pituitary/adrenal axis. A NURR1 knock-out mouse has been created and shows the essential role of this nuclear receptor in the development of mesencephalic dopamine neurons. The NGFI-B knock-out mouse shows no significant phenotype both at the level of thymocyte apoptosis and on the regulation of the adrenocortical function. The EWS and NOR-1 gene fusion was discovered in extraskeletal myxoid chondrosarcoma bones tumors. This chromosom translocation is at the origin of a hybrid protein composed of the N-terminal of EWS fused to the full length nuclear receptor NOR-1. It is presumed that the EWS/NOR-1 fusion protein plays a central role in the tumoral process. Threes other NOR-1 fusion partners were discovered in extraskeletal myxoid chondrosarcomas. TAF2N, TCF12 and TFG are fused to the nuclear receptor by a similar pattern. We have compared the NOR-1 and EWS/NOR-1 transcriptional activity in different chondrocyte cell lines. The AF2 domain of NOR-1 is essential for the transcriptional activity of the EWS/NOR-1 fusion protein. This result suggests that some NOR-1 specific co-activators participate to the tumorigenic process involved in the development of extraskeletal myxoid chondrosarcomas development. In order to better understand the orphan nuclear receptor NOR-1, we have created a NOR-1 knock-out mouse. Analysis of this mouse indicate an absence of significant phenotype. These observations suggest functional redundancy between NGFI-B or NURR1 (or both) and NOR-1.