Orientador: Saulo Santesso Garrido / Resumo: Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) são uma alternativa interessante como bioconservantes de alimentos devido a sua eficiência e, principalmente, à baixa toxicidade quando comparados aos conservantes químicos tradicionais. As bacteriocinas, uma classe de PAMs, têm atividade antimicrobiana em espécies responsáveis pela degradação de alimentos e, portanto, atualmente são exploradas como bioconservadores. A Leucocina C-TA33a (LeuC), um tipo de bacteriocina produzida pela cepa bacteriana Leuconostoc mesenteroides TA33a, é conhecida por ter um amplo espectro antimicrobiano. Estudos de alinhamento da estrutura primária de diferentes bacteriocinas revelaram que LeuC conserva em sua estrutura regiões homólogas também compartilhadas por outras bacteriocinas, como Sacacina P, Bavaricina A e Enterocina A, possivelmente revelando uma importante relação entre essas sequências de aminoácidos e suas atividades antimicrobianas. Este estudo tem como objetivo sintetizar diferentes peptídeos baseados na estrutura primária da Leucocina CTA33a, a fim de identificar as principais regiões responsáveis pela atividade antimicrobiana. Os peptídeos LeuC-Nt, LeuC-0Cys, LeuC-Ala9, LeuC-Ala14 e LeuC-Cys9,14 foram sintetizados por metodologia de fase sólida, purificados e analisados por HPLC e caracterizados por ESI-MS. Ensaios em meio líquido foram realizados para a determinação do percentual de inibição de crescimento microbianos dos peptídeos sobre espécies patogênicas. Os micro-organismos testados fora... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Antimicrobial peptides (PAMs) are an interesting alternative, because biopreservatives present high efficiency and low toxicity when compared to classic preservatives. Bacteriocins, a class of PAMs, have antimicrobial activity in species responsible for food degradation and are currently being exploited as biopreservatives. The Leucocin C-TA33a (LeuC), a type of bacteriocin, is produced by the Leuconostoc mesenteroides TA33a strain and is known for a broad antimicrobial spectrum. Studies of alignment of the primary structure of different bacteriocins revealed that LeuC retains in its structure homologous regions also shared by other bacteriocins, such as Sacacin P, Bavaricin A and Enterocin A, possibly revealing an important relationship between these amino acid sequences and their antimicrobial activities. This study aims to synthesize different peptides based on the primary structure of Leucocin C-TA33a, with the objective of identifying the main regions responsible for antimicrobial activity. The peptides LeuC-Nt, LeuC-0Cys, LeuC-Ala9, LeuC-Ala14 and LeuC-Cys9,14 were synthesized by solid phase methodology, purified by HPLC and characterized by ESI-MS. Liquid assays were performed to determine the percentage of inhibition of microorganisms of the peptides on pathogenic species. The microorganisms tested were Salmonella serotype Typhimurium, Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Listeria monocytogenes. Studies were also conducted through circular dichroism, molecular ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Tesis por compendio / [ES] La presente tesis doctoral plantea distintas estrategias para el desarrollo y aplicación de envases activos portadores de agentes de biocontrol, con el fin de inhibir la proliferación de microorganismos como bacterias y hongos patógenos y alterantes y así, conseguir aumentar la seguridad y prolongar la vida útil de los alimentos. El desarrollo de envases activos antibacterianos se llevó a cabo incorporando bacterias ácido lácticas productoras de bacteriocinas, Lactococcus lactis y Lactobacillus sakei en diferentes matrices formadoras de películas. Previa a la preparación de las películas activas, se estudió la actividad antimicrobiana de los agentes naturales seleccionados frente a Listeria monocytogenes. Los resultados sugirieron que, a partir de una determinada concentración inicial de bacterias viables, estos microorganismos son buenos candidatos para ser utilizados como aditivos naturales en materiales de envasado de alimentos, siendo una alternativa al uso de aditivos de origen sintético. En este trabajo se observó que la viabilidad inicial de las bacterias ácido lácticas (LAB) es esencial para obtener una buena capacidad antibacteriana por lo que la optimización de la composición de las películas o recubrimientos fue crucial para su aplicación con éxito. El polímero escogido como base para hacer las películas y recubrimientos mediante la técnica de casting, fue el alcohol polivinílico, (PVOH) mezclado con diferentes proteínas, gelatina y caseinato sódico y sus versiones hidrolizadas añadidas en diferentes proporciones. En este estudio L. lactis demostró tener una mayor resistencia a la deshidratación durante la preparación y almacenamiento de las películas que L. sakei. Las películas de PVOH mezcladas con gelatina hidrolizada y caseína hidrolizada dotaron de protección a las bacterias ácido lácticas durante el secado y demostraron tener una mayor efectividad antilisteria. Por último, se varió la proporción de caseína hidrolizada obteniendo una mayor viabilidad de las bacterias en las películas prolongada en el tiempo a mayor proporción de HCas. Para desarrollar un envase activo antilisteria, se adaptaron las matrices para ser aplicadas como recubrimiento sobre ácido poliláctico (PLA) con el objetivo de desarrollar bolsas activas antilisteria para crema de setas y como separadores de lonchas de jamón cocido. Los recubrimientos demostraron tener una efectividad similar a la obtenida con las películas in vitro. Sin embargo, su eficacia disminuyó ligeramente al ser aplicadas en la crema de champiñones y el jamón cocido debido a la complejidad de las matrices alimentarias utilizadas, pero siendo una buena herramienta para, junto a otras estrategias de conservación, asegurar la salubridad de los alimentos. Se llevaron a cabo ensayos sensoriales con consumidores y se obtuvo una buena aceptación de ambos productos. Sin embargo, los consumidores percibieron una alteración del sabor debido a la generación de ácido láctico en la crema de champiñones, acidez que puede ser controlada mediante correctores de acidez sin modificar la efectividad antimicrobiana. Para desarrollar envases que aumentaran la vida útil, se trabajó para ampliar el espectro de acción de L. lactis frente a las bacterias Gram-negativas, normalmente responsables de la descomposición de los alimentos. Combinar el agente de biocontrol productor de nisina, L. lactis, con una baja concentración de ácido fítico, sustancia quelante y desestabilizadora de la membrana bacteriana, amplió el espectro antimicrobiano de L. lactis frente a las bacterias Gram-negativas obteniendo una nueva herramienta para garantizar la seguridad alimentaria y prolongar la vida útil de los alimentos. / [CA] La present tesi doctoral planteja diferents estratègies per al desenvolupament i aplicació d'envasos actius portadors d'agents de biocontrol, amb la finalitat d'inhibir la proliferació de microorganismes com a bacteris i fongs patògens i alteradors i així, aconseguir augmentar la seguretat i prolongar la vida útil dels aliments. El desenvolupament d'envasos actius antibacterians, es va dur a terme incorporant bacteris àcid làctics productores de bacteriocines, Lactococcus lactis i Lactobacillus sakei en diferents matrius formadores de pel·lícules. Prèvia a la preparació de les pel·lícules actives, es va estudiar l'activitat antimicrobiana dels agents naturals seleccionats enfront de Listeria monocytogenes. Els resultats van suggerir que, a partir d'una determinada concentració inicial de bacteris viables, aquests microorganismes són bons candidats per a ser utilitzats com a additius naturals en materials d'envasament d'aliments, sent una alternativa a l'ús d'additius d'origen sintètic. En aquest treball es va observar que la viabilitat inicial dels bacteris àcid làctics (LAB) és essencial per a obtindre una bona capacitat antibacteriana pel que l'optimització de la composició de les pel·lícules o recobriments va ser crucial per a la seua aplicació amb èxit. El polímer triat com a base per a fer les pel·lícules i recobriments mitjançant la tècnica de càsting, va ser l'alcohol polivinílic, (PVOH) mesclat amb diferents proteïnes, gelatina i caseinat sòdic i les seues versions hidrolitzades afegides en diferents proporcions. En aquest estudi L. lactis va demostrar tindre una major resistència a la deshidratació durant la preparació i emmagatzematge de les pel·lícules que L. sakei. Les pel·lícules de PVOH mesclades amb gelatina hidrolitzada i caseina hidrolitzada van dotar de protecció als bacteris àcid làctics durant l'assecat i van demostrar tindre una major efectivitat antilistèria. Finalment, es va variar la proporció de caseïna hidrolitzada obtenint una millor resposta de les pel·lícules no sols des d'un punt de vista antimicrobià, sinó també de les propietats fisicoquímiques de les pel·lícules, a major proporció de caseïna hidrolitzada.Per a desenvolupar un envàs actiu antilistèria, es van adaptar les matrius per a ser aplicades com a recobriment sobre àcid polilàctic (PLA) amb l'objectiu de desenvolupar bosses actives antilistèria per a crema de bolets i com a separadors de rodanxes de pernil cuit. Els recobriments van demostrar tindre una efectivitat similar a l'obtinguda amb les pel·lícules in vitro. No obstant això, la seua eficàcia va disminuir lleugerament en ser aplicades en la crema de xampinyons i el pernil cuit a causa de la complexitat de les matrius alimentàries utilitzades, però sent una bona eina per a, al costat d'altres estratègies de conservació, assegurar la salubritat dels aliments. Es van dur a terme assajos sensorials amb consumidors i es va obtindre una bona acceptació de tots dos productes, però una alteració del sabor degut a la generació d'àcid làctic en la crema de xampinyons corregible mitjançant correctors d'acidesa sense modificació de l'efectivitat antimicrobiana. Per a desenvolupar envasos que augmentaren la vida útil, es va treballar per a ampliar l'espectre d'acció de L. lactis enfront dels bacteris Gram-negatives, normalment responsables de la descomposició dels aliments. Combinar l'agent de biocontrol productor de nisina, L. lactis, amb una baixa concentració d'àcid fític, substància quelant i desestabilitzadora de la membrana bacteriana, va ampliar l'espectre antimicrobià de L. lactis enfront dels bacteris Gram-negatives obtenint una nova eina per a garantir la seguretat alimentària i prolongar la vida útil dels aliments. / [EN] This doctoral thesis proposes different strategies for the development and application of active packaging containing biocontrol agents, to inhibit the proliferation of microorganisms such as pathogenic and spoilage bacteria and fungi, thus increasing the safety and increasing the shelf life of foodstuffs. The development of antibacterial active packaging was carried out by incorporating bacteriocin-producing lactic acid bacteria, Lactococcus lactis and Lactobacillus sakei in different film-forming matrices. Prior to the preparation of the active films, the antimicrobial activity of the selected natural agents against Listeria monocytogenes was studied. The results suggested that, from a certain initial concentration of viable bacteria, these microorganisms are good candidates to be used as natural additives in food packaging materials, being an alternative to the use of additives of synthetic origin. In this work it was observed that the initial viability of lactic acid bacteria (LAB) is essential to obtain a good antibacterial capacity, so the optimization of the composition of the films or coatings was crucial for their successful application. The polymer chosen as a base to make the films and coatings by casting technique was polyvinyl alcohol (PVOH) mixed with different proteins, gelatin and sodium caseinate and their hydrolysed versions added in different proportions. In this study L. lactis showed higher resistance to dehydration during film preparation and storage than L. sakei. PVOH films mixed with hydrolysed gelatin and hydrolysed casein provided protection to lactic acid bacteria during drying and were shown to have a greater antilisteria effectiveness. Finally, the proportion of hydrolysed casein was varied, obtaining a better response of the films not only from an antimicrobial point of view, but also from the physicochemical properties of the films, the higher the proportion of HCas. To develop an antilisteria active packaging, the matrices were adapted to be applied as a coating on polylactic acid (PLA) with the objective of developing antilisteria active bags for cream of mushroom soup and as separator liner for cooked ham slices. The coatings showed similar effectiveness to that obtained with in vitro films. However, their effectiveness decreased slightly when applied to mushroom soup and cooked ham due to the complexity of the food matrices used, but being a good tool to, together with other preservation strategies, ensure food wholesomeness. Sensory tests were carried out with consumers and a good acceptance of both products was obtained. However, an alteration of taste due to the generation of lactic acid was detected in the mushroom soup that could be corrected by means of acidity correctors without modifying the antimicrobial effectiveness. Finally, life cycle analysis of conventional and active packaging for pastry cream was studied. In any case, despite the limitations regarding the waste product estimation, shelf-life extension through packaging innovation could significantly reduce the environmental impacts of the entire food packaging system. In the present thesis, the potential use of indigenous yeasts with antifungal capacity for the control of Penicillium expansum and the control of the mycotoxin they generate, called patulin, was also explored. In the present investigation, three new yeast strains isolated from the surface of apples were selected for their efficacy against P. expansum. The yeasts were identified as Metschnikowia pulcherrima being 3 different strains. The ability of these yeasts for patulin biodegradation was also demonstrated. Then, different studies on the viability of the yeast and its antifungal effectiveness on different films made with biopolymers naturally present in apples (pectin, cellulose ethers, and apple pomace) were carried out. / The authors acknowledge the financial support of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (AGL2015-64595-R and RTI2018-093452-B-I00). / Settier Ramírez, L. (2021). Envases activos portadores de microorganismos para la bioconservación de alimentos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/175807 / TESIS / Compendio

La sangre obtenida en el matadero es un producto altamente contaminado que requiere un procesamiento inmediato si se pretende utilizarla como insumo alimentario en la fabricación de productos destinados al consumo humano. Si bien es cierto que los sistemas de higienización podrían ser muy eficientes desde el punto de vista de calidad microbiológica, su instalación en la línea de sacrificio comportaría muchas dificultades desde el punto de vista técnico y en algún caso sería muy costoso. La bioconservación podría ser una alternativa para mejorar la calidad microbiológica de la sangre, alargar su vida útil y reducir las posibilidades de procesamiento inmediato. El presente estudio nos permitiría formular la posibilidad de aplicar la bioconservación en sangre de cerdo procedente de matadero industrial, utilizando bacterias ácido lácticas (BAL) como cultivo bioprotector, para lo cual se aislaron cepas de BAL autóctonas y se confeccionaron dos colecciones una de BAL mesófilas y otra de psicrótrofas.Se evaluó el potencial antagonista de la colección de BAL mesófilas y psicrótrofas a 30ºC y a 15ºC respectivamente frente a bacterias contaminantes habituales de este subproducto. Las BAL que demostraron antagonismo en placa (7,1% a 30ºC y 11% a 15ºC) fueron seleccionadas para evaluar el potencial antagonista en sangre, donde el efecto inhibitorio se vio favorecido por la adición de un 2% glucosa. S.aureus y P. fluorescens fueron los indicadores más inhibidos por las cepas mesófilas, en algunos casos con reducciones superiores a 7 unidades logarítmicas. En condiciones psicrótrofas la bacteria más sensible a la presencia de BAL fue Bacillus sp., donde 8 de las 11 BAL ensayadas permitieron reducciones superiores a 4 logs y 1cepa incluso superiores a 7 logs; se obtuvieron reducciones máximas de 3 logs de E.coli y Pseudomonas fue inhibida por todas las BAL ensayadas, en algún caso con reducciones superiores a 5 logs.Las 5 que cepas que presentaron el espectro de inhibición más amplio en condiciones mesófilas y 7 en condiciones psicrótrofas frente a los microorganismos indicadores contaminantes de sangre de matadero se identificaron mediante técnicas moleculares por comparación de la secuencias correspondientes al gen que codifica la síntesis de 16S ARNr (16S ADNr) con las secuencias publicadas en las bases de datos. De las 7 cepas antagonistas en condiciones psicrótrofas 5 se identificaron como Lactococcus garvieae y 2 como Enterococcus malodoratus/gilvius raffinosus. Todas las BAL con potencial antagonista en condiciones mesófilas pertenecían al género Lactobacillus, 3 de elllas se identificaron como Lactobacillus murinus/animalis y una se identificó como Lactobacillus reuteri. TA20 que tuvo un gran espectro de inhibición a ambas temperaturas se identificó como Lactococcus garvieae.En este estudio se evaluaron tres métodos de conservación a largo plazo de las cepas que mostraron potencial antagonista. Se comparó la liofilización, la atomización frente a la congelación a -80ºC que era método que se había utilizado hasta el momento para conservar ambas colecciones de BAL. En general, los métodos de deshidratación (atomización y liofilización) y mantenimiento en refrigeración a 5ºC de los cultivos deshidratados se han mostrado más eficaces que la congelación. / Blood from slaughtered animals is a product with a high contamination level that requires an immediately processing after collection if the object is to use it as a food ingredient destined to human consumption. Nevertheless, even if hygienic collection systems used in abattoirs were be efficient enough to control the microbiological quality, their installation in the slaughtered line would be technically complicate and in some case would be so expensive.Bioconservation is an alternative to improve microbiological quality, to extend its shelf life and reducing the possibility of immediate processing after collection.The present study would permit us to formulate the possibility to applicate bioconservation in porcine blood from industrial abattoirs, using lactic acid bacteria (LAB) strains as biopreservative cultures. So a mesophylic and a psicrotrophyc LAB strains collections were confectioned.The antagonistic capacity toward usual contaminant bacteria in blood of the mesophylic and psicrotrophyc collections at 30ºC and 15ºC respectively were investigated. The LAB that demonstrated the widest inhibitory spectrum in agar plate evaluation (7,1% at 30ºC and 11% at 15ºC) were screened in order to evaluate their inhibitory activity in blood, where was observed that the addition of glucose at 2% had a positive effect in the inhibitory levels. The most sensible indicators to the mesophylic LAB were S. aureus and P. fluorescens. In some cases it was obtained reductions of 7 logarithmic units. In psicotrophic conditions the most sensible bacteria to LAB presence was Bacillus spp. where 8 of the 11 strains assayed inhibited in more than 4 logarithmic units and 1 of them inhibited this indicator in 7 logarithmic units..It was obtained maxim reductions of 3 logs versus E. coli. P. fluorescens was inhibited by all the assayed strains and in some case it was obtained reductions superior to 5 logs.The 5 mesophylic and 7 psictrophyc strains that demonstrated the widest inhibitory spectrum toward the indicators microorganisms from abattoir blood were identified using molecular techniques though comparison of the gene sequences that codify the synthesis of 16S RNAr (16S DNAr) with the sequences in the data base.5 from the 7 strains with antagonistic capacity in psicotrophyc conditions were identified like Lactococcus garvieae and the other two strains were identified like Enterococcus malodoratus/gilvius/raffinosus. All the antagonistic LAB in mesophylic conditions belonged to genus Lactobacillus, 3 of them were identified like Lactobacillus murinus/animalis and one of them as Lactobacillus reuteri. TA20 that had a widest spectrum at both assay temperatures was identified as Lactococcus garvieae.In this study there were evaluated three methods of conservation of cultures belonged to those LAB that demonstrated antagonistic capacity. It was compared freeze-drying, spray drying against freezing at -80ºC, that is the method used to conserve both LAB collections. Generally, the dehydration methods (freeze-drying and spray drying) and maintaining in refrigeration at 5ºC of dehydrated cultures showed to be better than freezing at -80ºC.