Ce travail de thèse a pour objectif l’étude de l’électrochimiluminescence (ECL) et son application pour le développement de nouvelles techniques analytiques. De par son importante sensibilité, l’ECL est une technique performante pour des applications telles que les diagnostics cliniques ou la chimie environnementale (présence d’agents contaminants dans l’eau ou la nourriture). L’immobilisation du luminophore ECL est réalisée généralement sur une phase solide. Cette étape constitue une phase essentielle pour obtenir une méthode d’immobilisation rapide, simple, flexible et efficace de ces luminophores ECL, tout en permettant une utilisation pour des systèmes variés. La première partie de ce travail présente l’optimisation de la déposition électrochimique de films de métallopolymère de ruthénium et son application pour la détection enzymatique. Un film d'épaisseur micrométrique de cet hydrogel redox a été préparé par voltamétrie cyclique. Cet hydrogel immobilisé a permis la détection d’un substrat modèle (le glucose) en utilisant l'enzyme glucose déshydrogénase. La seconde partie se concentre sur le développement d’une nouvelle méthode de photodéposition d’un polymère. Celle-ci permet l’immobilisation de centres actifs sur des régions sélectives. En utilisant les techniques de photolithographie, les figures du masque sont projetées sur la surface des électrodes. Cela permet la réalisation de spots micrométriques dont la taille, forme et épaisseur sont modulables. Les propriétés électrochimiques des films nanométriques obtenus sont comparables à ceux obtenues par électrodéposition. De même, les spectres ECL réalisés avec polymères immobilisés par ces deux stratégies sont identiques. Ces résultats montrent que les états excités induits lors de l’ECL sont identiques avec les deux techniques d’immobilisation. Le développement d'un tel procédé constitue une alternative prometteus pour la réalisation de réseaux de spots ECL différenciés et permettant la détection multipléxée par imagerie ECL. Dans la troisième partie de ce travail, nous avons associé la spectroélectrochimie et l'imagerie ECL pour contribuer à l’étude des mécanismes ECL au niveau d'une bille micrométrique fonctionnalisée par des complexes de ruthénium. En combinant microscopie de fluorescence et imagerie ECL, la distribution des sites électroactifs et des sites ECL a pu être mise en évidence. A partir de cette étude, nous pouvons clarifier les mécanismes conduisant à l'émission ECL au niveau de ces billes fonctionnalisées. / The main goal of this thesis was to study electrogenerated chemiluminescence (ECL) and its application in development of new analytical techniques. Due to its high sensitivity, ECL presents a powerful method for applications in clinical diagnostic and environmental chemistry (presence of contaminants in water or food). The immobilisation of an ECL luminophore is usually performed on a solid phase. This step is an essential point to obtain a technique for fast, simple, flexible and effective immobilisation of ECL luminophores with possibility of applications in various configurations. The first part of this work presents the optimisation of the electrochemical deposition of a ruthenium metallopolymer and its application in enzymatic detection. A redox hydrogel film with micrometric thickness was prepared using cyclic voltammetry. This immobilised hydrogel allows the detection of model substrate (glucose) using enzyme glucose dehydrogenase. The second part of this thesis is focused on the development of a new photodeposition method for the ECL polymer immobilisation. This method allows region-selective immobilisation of active centres. Using photolithographic methods, the figures from the mask are projected on the electrode surface. This allows the formation of micrometric spots which size, shape and thickness is modulated. Electrochemical properties of obtained nanometric films are comparable with those of electrodeposited films. Also, ECL spectra recorded with both immobilisation strategies are identical. It shows that the ECL excited state is the same. The obtained photopatterns were imaged using ECL. The development of such process presents an alternative for realisation of different ECL spot arrays and allows multiplexed detection by ECL imaging. In the third part of this work we have associated spectroelectrochemistry and ECL imaging to study the ECL mechanisms at the level of a single microbead, functionalised with ruthenium complex. Combining fluorescence microscopy and ECL imaging, the distribution of electroactive and ECL sites have been highlighted. From this study we can clarify the mechanism that leads to ECL emission at the level of functionalised beads.

This thesis deals with guided self-assembly of gold nanoparticles from their colloidal solutions onto silicon substrates and possible employment of nanoparticles for detection of biomolecules. It was found that by adjustment of solution pH and surface chemistry modification by means of electron beam irradiation it is possible to facilitate nanoparticle deposition to patterns with almost single particle precision. Spectroscopic ellipsometry was then employed in analysis of self-assembled layers of nanoparticles and its combination with a theory of effective medium approximation has proven the ability to assess nanoparticle dimensions and volume fractions. By experiments with thiolated oligonucleotides it has been shown that using ellipsometry one can detect even with very subtle changes in nanoparticle environment caused by biomolecules, thus promising its possible use in the field of biodetection.

La concentration locale des messagers chimiques sécrétés par les cellules peut être mesurée afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires liés à diverses maladies, dont les métastases du cancer. De nouvelles techniques analytiques sont requises pour effectuer ces mesures locales de marqueurs biologiques à proximité des cellules. Ce mémoire présentera le développement d’une nouvelle technique basée sur la réponse plasmonique sur des leviers AFM, permettant d’étudier les réactions chimiques et biologiques à la surface des leviers grâce au phénomène de résonance des plasmons de surface (SPR), ainsi qu’à la diffusion Raman exaltée par effet de pointe (TERS). En effet, il est possible de localiser l’amplification du signal Raman à la pointe d’un levier AFM, tout comme le principe de la diffusion Raman exaltée par effet de surface (SERS) basée sur la diffusion de la lumière par des nanoparticules métalliques, et permettant une large amplification du signal Raman. La surface du levier est recouverte d’une nano-couche métallique d’or, suivi par des réactions biologiques pour l’immobilisation d’un récepteur moléculaire, créant ainsi un biocapteur sur la pointe du levier. Une détection secondaire utilisant des nanoparticules d’or conjuguées à un anticorps secondaire permet également une amplification du signal SPR et Raman lors de la détection d’antigène. Ce mémoire démontrera le développement et la validation de la détection de l’immunoglobuline G (IgG) sur la pointe du levier AFM.Dans des projets futurs, cette nouvelle technique d’instrumentation et d’imagerie sera optimisée grâce à la création d’un micro-détecteur protéique généralement adapté pour l’étude de la communication cellulaire. En intégrant le signal SPR à la microscopie AFM, il sera alors possible de développer des biocapteurs SPR couplés à une sonde à balayage, ce qui permettra d’effectuer une analyse topographique et de l’environnement chimique d’échantillons cellulaires en temps réel, pour la mesure des messagers moléculaires sécrétés dans la matrice extracellulaire, lors de la communication cellulaire. / Measurement of the local concentration of chemical messengers secreted by cells may give a better understanding of molecular mechanisms related to different diseases, such as cancer metastasis. Current techniques are not suited to perform such measurements and thus, new analytical techniques must be developed. This Master’s thesis reports the development of a new technique based on the plasmonic response of atomic force microscopy (AFM) tips, which will ultimately allow monitoring of chemical and biological molecules on the surface of a cantilever by use of surface plasmon resonance (SPR) and tip-enhanced Raman scattering (TERS). Indeed, it is possible to localize the enhancement of the Raman signal on the AFM tip using principles associated to surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS), based on the absorption of light by nanometer-sized metal particles, resulting in a large enhancement of the Raman signal. The AFM tip was constructed by the deposition of a nanometer-size gold layer, followed by the assembly of a biosensor with a biomolecular receptor. Gold nanoparticles (AuNPs) conjugated with a secondary antibody served as the secondary detection step. In addition, the use of the gold nanoparticles for antigen detection allows an amplification of the SPR and Raman signals. This Master’s thesis will demonstrate the development and validation of a biosensor for immunoglobuline G (IgG) at the tip of an AFM cantilever.This thesis sets the basis for future projects, where this new imaging technique will be developed for monitoring cellular communication by exploiting the plasmonic signal at the AFM tip. Different biosensors will then be developed and coupled to an AFM probe for scanning the chemical environment and detect in real-time chemical messengers secreted in the extracellular matrix in cellular communication.

Ce travail a pour objet l’étude et le développement d’un capteur électrochimique pour la détection sélective quantitative des analytes biologiques à l’échelle nano. Il se divise en deux parties après une présentation de l’état de l’art sur les maladies nosocomiales et les capteurs électrochimiques. Tout d’abord, nous avons développé un protocole spécifique qui repose sur la fonctionnalisation localisée de la microélectrode de travail par dépôt électrophorétique d'oxyde de graphène réduit/polyéthylènimine (rGO/PEI) pour amplifier le signal de détection. Le microsystème réalisé en salle blanche, a été exploité avec succès pour la détection sélective de la dopamine avec une limite de détection de 50 nM.Ensuite, nous avons utilisé la même plateforme constituée d’électrodes de plus grande taille (mm) pour la réalisation d’un capteur immunologique. Il a démontré son efficacité, de manière spécifique et sélective, pour discriminer la souche sauvage E. Coli UTI89 de UTI89 Δfim (sans opéron), avec une limite de détection de 10 cfu mL−1. En outre, le concept d’utilisation d’une électrode modifiée par rGO/PEI par la modification covalente avec des anticorps pathogènes est général. Il peut être facilement adapté à toute autre espèce pathogène, rendant l’approche générique. Le capteur a donc abouti à des résultats intéressants en milieu aqueux, sérique et urinaire, ce qui est essentiel pour son utilisation potentielle pour le diagnostic clinique des maladies pathogènes. / The purpose of this work concerns the study and development of an electrochemical sensor for both quantitative and selective detection of biological analytes at the nanoscale. It is divided into two parts after a presentation of the state of the art on nosocomial diseases and electrochemical sensors. First, we have developed a specific protocol based on the localized functionalization of the working microelectrode by electrophoretic deposition. The strategy is based on the localizedfunctionalization of the working microelectrode by electrophoretic deposition of reduced graphène oxide / polyethyleneimine (rGO / PEI) to amplify the detection signal. The microsystem built in a clean room has been successfully tested for the selective detection of dopamine with a detection limit of 50 nM. In addition, the microsystem showed good performance in detecting dopamine levels.Then, we have also used the same electrode platform at a larger scale (mm) for the specific and selective detection of the immunological sensor which has demonstrated its effectiveness in distinguishing the UTI89 E. Coli wild-type strain of UTI89 Δfim (without operon), with a detection limit of 10. cfu mL-1. In addition, the concept of rGO / PEI modified electrode by covalent modification with pathogenic antibodies is general and can be easily transposed to any other pathogenic species, making the approach very versatile and generic.The sensor works in aqueous, serum and urinary media, which is essential for its potential use in clinical diagnosis of pathogenic diseases.

En recherche pharmacologique, les cellules vivantes sont largement utilisées comme milieu d’analyse pour l’étude de phénomènes biologiques, par exemple l’apoptose et la réorganisation cellulaire. Différents outils de caractérisation sont développés pour analyser et traduire l’information biologique en information quantifiable. L’imagerie à résonance de plasmons de surface (SPR) est sensible aux variations d’indice de réfraction d’un milieu à l’interface d’une couche métallique. Elle trouve beaucoup d’applications en recherche pharmacologique, car elle permet l’acquisition d’images en temps réel et ne nécessite pas de marquage biologique comme en fluorescence. Cependant, la nature propagative des plasmons de surface (PSP) limite la résolution spatiale en entraînant un étalement de l’information dans la direction de propagation des PSP. Cela signifie qu’il est difficile de résoudre spatialement des détails inférieurs à la distance de propagation des PSP, généralement de l’ordre des dizaines de micromètres. Plusieurs groupes de recherche travaillent à améliorer la résolution spatiale en imagerie SPR. Toutefois, bien que des résolutions spatiales inférieures à celle de la propagation ont été obtenues, certains compromis ont été effectués, par exemple la diminution de la résolution temporelle ou d’indice de réfraction.Ce projet de thèse s’insère dans cette problématique en concevant et réalisant des dispositifs plasmoniques permettant d’améliorer la résolution spatiale en imagerie SPR, tout en minimisant les compromis avec les autres paramètres d’imagerie. Ces puces SPR sont composées de surfaces métalliques nanostructurées dont le mode guidé combine les propriétés des plasmons propagatifs et des plasmons localisés. Un logiciel de modélisation numérique a permis de démontrer comment la géométrie des surfaces nanostructurées peut être optimisée de manière à réduire la longueur d’atténuation du mode plasmonique tout en conservant un fort contraste d’imagerie. Une géométrie optimale a été identifiée et des structures de l’ordre du micromètre ont été observées à l’aide des puces SPR nanostructurées optimisées. Les résultats expérimentaux ont montré une réduction de la propagation d’un facteur de 6.3 comparativement à des surfaces métalliques uniformes.Les performances en imagerie des puces SPR nanostructurées ont été validées au cours d’études de réponses cellulaires causées par stimulation à l’aide d’agents pharmacologiques. Les puces ont été employées dans l’étude de changements d’intégrité de couches confluentes de cellules suivant stimulation. La quantification de trous intercellulaires dans la couche a montré une augmentation significative du nombre de petits trous détectés (~ 1-2 µm2) lors de l’utilisation des puces SPR nanostructurées. Cette augmentation de la sensibilité à l’activité cellulaire est le résultat de l’amélioration de la résolution spatiale. Finalement, l’étude de la morphologie de cellules au cytosquelette fortement linéaire a permis d’observer des structures subcellulaires et de suivre la réorganisation du cytosquelette de cellules individuelles. Les puces SPR nanostructurées conçues et réalisées au cours de cette thèse montrent un fort potentiel d’applications en imagerie sans marquage de cellules vivantes. / In pharmacological research, living cells are widely used as the sensing medium for biological studies, such as cell apoptosis and cellular reorganization. Different characterization systems are developed to analyze and quantify biological information. Surface plasmon resonance (SPR) imaging is sensitive to minute refractive index variations occurring in a medium at the proximity of a metal layer. It has found many applications in pharmacological research since it allows the real-time image acquisition and does not require biological labeling like for fluorescence. However, the propagative nature of surface plasmons (PSPs) limits the spatial resolution by spreading the information in the direction of propagation of the PSPs. This means that it is difficult to spatially resolve details smaller than the attenuation length of the PSPs, generally of the order of tens of micrometers. Several research groups have worked on this limitation in order to improve the spatial resolution in SPR imaging. However, although spatial resolutions lower than that of the propagation have been obtained, those techniques require compromises, such as loss in temporal resolution or in refractive index.In this thesis project, plasmonic devices were designed and characterized in order to improve spatial resolution in SPR imaging, while minimizing compromises with other imaging parameters. These SPR chips are composed of nanostructured metal surfaces where the guided mode combines the properties of propagative plasmons and localized plasmons. An in-house numerical modeling software has demonstrated how the geometry of nanostructured surfaces can be optimized to reduce the attenuation length of the plasmonic mode, while maintaining a high imaging contrast. An optimum geometry was identified, and micron-sized structures have been observed using the optimized nanostructured SPR chips. Experimental results showed a reduction in propagation by a factor of 6.3 compared to uniform metal surfaces.The imaging performances of nanostructured SPR chips were assessed by studying cellular responses following pharmacological stimulation. The chips were used in real-time monitoring of integrity changes in confluent endothelial cell layer following stimulation. Quantification of intercellular gaps in the monolayers showed a significant increase in the number of small holes detected (~ 1μm2) when using nanostructured SPR chips. This increase in sensitivity to cellular activity is the result of improved spatial resolution. Finally, the study of morphology in highly linear cytoskeleton cell enabled the observation of subcellular structures and the monitoring of cytoskeleton reorganization in individual cells. The nanostructured SPR chips designed and realized during this thesis show a strong potential label-free live cell imaging.