CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / In this thesis work, bioactive edible films were produced by using a galactomannan-starch-nisi blend. The galactomannan from the endosperm of seeds of Adenanthera pavonina was extracted and the fine structure of the gum endospermic was studied by NMR techniques. The reason M / G (= 1.46) was determined and its structure is in agreement with those reported in the literature for galactomannans. Study of IR data supported the NMR data obtained in this work. This galactomannan showed rheological behavior typical of seed gums. Gelatinized corn starch was used to produce blends with the galactomannans. In rheological tests, the force applied to the flow curves to the dispersion of gelatinized corn starch and mixtures of starch-galactomannan did not adequately characterize these polymer systems in solution. The oscillatory tests, in turn, were more sensitive to detect differences between the different systems evaluated allowing for a more appropriate characterization. The construction of the sorption isotherms was an interesting approach to characterize edible films produced from blends of systems of polysaccharides and starch-galactomannan-nisin blend. Significant differences were detected in these films and have to relate the behavior of water to the structural arrangement of various edible films produced. The humidity was as dependent on key parameters measured in films such as temperature and content of glycerol. The hysteresis phenomenon was shown to the edible films of starch galactomannan blend. Finally, the mathematical model of sorption described by the G.A.B. equation is suggested as one that best represents the data obtained in experimental conditions tested here. Thermal stability curves obtained by DSC for galactomannan and edible films which produced without and with the antimicrobial agent nisin, led to associate the data with those obtained by aw,corroborating, in thecase of the film containing nisin, the antimicrobial contributes to an increased hydration of the edible film. The presence of nisin in edible films produced with the starchgalactomannan blend and glycerol reduced the growth of L. monocitogenes, reducing the number of colony-forming units and acting as a barrier to contamination. The study of action of nisin through the test of the inhibition zone and the bioassay enabled characterization of the edible films through the using of good techniques. Finally, more studies should be conducted to determine whether additional changes in the composition or the structure of the films could modify the antimicrobial activity due to inactivation of nisin or altering its release / Neste trabalho de Tese, filmes comestÃveis bioativos foram produzidos a partir da blenda galactomanana-amido-nisina. A galactomanana do endosperma de sementes de Adenanthera pavonina foi extraÃda e sua estrutura fina foi estudada atravÃs de tÃcnicas de RMN. Sua razÃo M/G (=1,46) determinada e sua estrutura estÃo de acordo com o que foi relatado na literatura para galactomananas. Estudo de IR corroboram os dados de RMN obtidos nesse trabalho. Essa galactomanana apresentou comportamento reolÃgico tÃpico de gomas de sementes. Amido de milho gelatinizado foi empregado para produzir blendas com a galactomanana. Nos testes reolÃgicos, o esforÃo aplicado para curvas de escoamento da dispersÃo de amido de milho gelatinizado e das misturas de galactomanana-amido nÃo permitiu caracterizar adequadamente esses sistemas de polÃmeros em soluÃÃo. Os ensaios oscilatÃrios, por sua vez, foram mais sensÃveis para detectar as diferenÃas entre os distintos sistemas avaliados permitindo uma caracterizaÃÃo de maneira mais adequada. A construÃÃo de isotermas de sorÃÃo foi numa abordagem interessante para caracterizar filmes comestÃveis produzidos a partir dos sistemas de blendas de polissacarÃdeos e do complexo galactomanana-amido-nisina. DiferenÃas significativas foram detectadas nesses filmes e permitiram relacionar o comportamento da Ãgua ao arranjo estrutural dos diferentes filmes comestÃveis produzidos. A umidade foi observada como dependente de importantes parÃmetros avaliados nos filmes, tais como a temperatura e o conteÃdo de glicerol. O fenÃmeno da histerese foi evidenciado para os filmes comestÃveis da blenda galactomanana-amido. Finalmente, o modelo matemÃtico de sorÃÃo descrito pela equaÃÃo G.A.B. à sugerido como aquele que melhor representa os dados obtidos nas condiÃÃes experimentais testadas aqui. As curvas de estabilidade tÃrmica obtidas por DSCl para a galactomanana e os filmes comestÃveis, produzidos sem o antimicrobiano e contendo a nisina, permitiram associar os dados de DSC aos obtidos pelas medias de aw, corroborando, no caso do filme contendo nisina, que o antimicrobiano contribui para uma maior hidrataÃÃo do filme comestÃvel. A presenÃa de nisina nos filmes comestÃveis produzidos com a blenda galactomanana-amido e glicerol reduziu o crescimento de L. monocitogenes, diminuindo o nÃmero de unidades formadoras de colÃnias e atuando como barreira para a contaminaÃÃo. O estudo da aÃÃo da nisina atravÃs do teste do halo de inibiÃÃo e do bioensaio permitiu caracterizar os filmes comestÃveis atravÃs do uso de tÃcnicas satisfatÃrias. Finalmente, mais estudos devem ser conduzidos a fim de determinar se mudanÃas adicionais na composiÃÃo ou na estrutura dos filmes poderiam modificar a atividade antimicrobiana devido à inativaÃÃo da nisina ou alterando sua liberaÃÃo

As emissões veiculares constituem-se em uma das mais graves ameaças a qualidade de vida da população, principalmente nos grandes centros urbanos. Poluentes de origem veicular podem induzir alterações no material genético de organismos a eles expostos, pois nessas emissões, destacam-se entre outros, os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), que são substâncias consideradas carcinogênicas e mutagênicas. A utilização de indicadores sensíveis a ação de agentes genotóxicos serve para avaliar a presença destes compostos no ambiente. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar comparativamente o risco mutagênico das emissões provenientes da combustão dos combustíveis fósseis (gasolina e diesel) e renováveis (álcool e biodiesel), utilizando o bioensaio Trad-SH. Os ensaios foram realizados utilizando veículos do ciclo Diesel (Citröen JUMPER 2.8 L, 2006) e do ciclo Otto (VW FOX 1.6 Flex, 2005 sem o conversor catalítico), em um dinamômetro de chassi, submetidos a um ciclo de condução urbano padronizado (FTP-75) modificado, para a coleta dos gases de escapamento. Os gases foram misturados com o ar ambiente e homogeneizados para simular o que ocorre no trânsito urbano. As inflorescências do clone KU-20 de Tradescantia foram expostas a mistura de poluentes, provenientes dos veículos, dentro de uma câmara de fumigação, por duas horas. Para a avaliação do efeito mutagênico foi feita uma comparação entre as inflorescências não expostas aos poluentes (grupo 1) e as inflorescências expostas as emissões do álcool (grupo 2), do biodiesel (grupo 3), da gasolina (grupo 4) e do diesel (grupo 5). Os dados obtidos dos experimentos foram analisados estatisticamente onde se observou que a freqüência média das mutações no grupo 1 (controle), foi significativamente mais baixa do que aquela dos grupos 2, 3, 4, e 5. Os resultados indicam que as emissões dos veículos abastecidos com combustíveis fósseis (gasolina e diesel), são mais mutagênicas do que as emissões provenientes da combustão dos combustíveis renováveis (álcool e biodiesel). / The vehicle emissions constitute a major serious threat to the population\'s quality of life, especially in the large urban areas. Pollutants from vehicle origin may lead to changes concerning the genetic material of some organisms that have been exposed to them, and within these emissions it is stood out among others the polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH\'s), which are carcinogenic and mutagenic compounds. The use of sensitive indicators to the action of genotoxic agents is useful to prevent and to evaluate the presence of these compounds in the environment. Therefore, this work is aimed at evaluating comparatively the mutagenic risk of emissions from the burning of fossil fuel (gasoline and diesel) and renewable ones (ethanol and biodiesel) by the use of Trad-SH bioassay. The assays were carried out using vehicles from the diesel cycle (Citröen JUMPER 2.8 L, 2006) and the Otto cycle (VW FOX 1.6 Flex, 2005, without a catalytic converter), in a chassis dynamometer, submitled to a standard urban driving cycle (FTP-75) in order to collect the gases of exhaust. The gases were mixed up to the atmosphere air and homogenized to simulate what happens in urban traffic. The inflorescences of KU-20 clone of Tradescantia were exposed to a mixture of pollutants from vehicles, in a fumigation chamber for two hours. To evaluate the mutagenic effect it was necessary to establish a comparison between the inflorescences which were not exposed to pollutants (group 1) and inflorescences exposed to emissions of alcohol (group 2), biodiesel (group 3), gasoline (group 4) and diesel (group 5). Data obtained from experiments were statistically analyzed in which appears that the average frequency of mutations in group 1 (control) was significantly lower than that of groups 2, 3, 4 and 5. The results indicate that emissions from vehicles fueled by fossil fuels (petrol and diesel) are more mutagenic than emissions from the combustion of renewable fuels (ethanol and biodiesel).

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A pesquisa teve o objetivo de averiguar a presença de toxicidade nas cianobactérias planctônicas no deságue da Lagoa de estabilização no igarapé Grande, em Boa Vista, por meio de bioensaio em camundongos de linhagem Swiss albino. O corpo hídrico em estudo está localizado na área urbana de Boa Vista, recebe influência resultante da descarga final dos esgotos domésticos dos moradores próximos e de efluentes do sistema de tratamento de esgotos sanitários da cidade, apresentando florações em alguns trechos. Pesquisas anteriores constataram a presença de florações de cianobactéria planctônica nesse ambiente. No entanto, havia a ausência de estudos sobre a toxicidade das florações de cianobactéria planctônicas existentes no igarapé Grande. A área escolhida foi georeferenciada e denominada como: E1 (montante do deságue da ETE), situada no igarapé grarde; E2 (desague/calha); E3 (jusante do deságue). Foram realizadas três coletas amostrais no período seco e três no período das chuvas. No momento da coleta, foram feitas medidas do pH e temperatura da água. Em seguida, foram realizadas as análises das concentrações de clorofila-a, nitrogênio amoniacal, fósforo total, turbidez e estimativa de densidade celular. Foi observado a presença de cianobactérias da espécie Planktothrix agardhii (Gomont) Anagnostidis et Komárek durante todos os meses de coletas, nos períodos sazonais (seco e chuvoso) e confirmou-se que a Estação de Tratamento de Esgoto Sanitário do município de Boa Vista ETE/BV - é a fonte de entrada dessa espécie de cianobactéria no igarapé Grande. Foi observada a distribuição dos organismos na superfície da água afetando a qualidade físico-química do igarapé Grande. Também o teste estatístico possibilitou a identificação da amônia (NH3) como a variável de maior contribuição para a toxicidade nas estações. Além disso, o resultado foi ratificado pelos testes quimiométricos PCA; FA. O teste (DL50 -24 horas), realizado por meio de bioensaio em camundongos no período seco, do material algáceo da estação E3, apresentou a toxicidade em doses acima de 2.500 mg kg mL- (p.c), com a maior mortalidade de 75% dos indivíduos do grupo que recebeu as concentrações de 100 mg mL-. Os resultados da estação de coleta E2, mostram mortalidade de 25% dos indivíduos na concentração de extrato de 50 mg mL-, 25% de indivíduos e 100 mg mL- dos individuo e 75% de indivíduos com a concentração de 150 mg mL- das amostras coletadas durante o período das chuvas. / The study aimed to access the presence of toxic planktonic cyanobacteria by mouse bioassay in the outflow of the stabilization pond and in the Igarapé Grande, Boa Vista, RR. The waterbodies under study are located in the urban area of Boa Vista, and are influenced by the final discharge of the domestic sewage from nearby residents and effluents of the sewage treatment plant from the city. Previous research has established the presence of cyanobacterial blooms in this environment. However, there was a lack of studies on the toxicity of the cyanobacteria that bloom in the stabilization pond system and adjacent Igarapé Grande. The study area was geo-referenced and named as E1 (upstream of the sewage treatment plant outflow), located in the Igarapé Grande, E2 (outflow/gutter), and E3 (downstream of the outflow), also in the Igarapé Grande. It was performed three sample collections during the dry season and three during the rainy season. At the time of the samplings measurements of pH and water temperature were carried out. It was also collected samples for the estimation of chlorophyll-a, ammonia nitrogen, total phosphorus, turbidity and cell density evaluation. We observed the presence of the cyanobacteria of the genus Planktothrix agardhii during all the sampled months in both seasons (dry and rainy), confirming the city sewage treatment plant as the main source of entry of this species in the Igarapé Grande. It was also confirmed that the distribution of the organisms on the water surface affects the physico-chemical quality of the Igarapé Grande. Statistical analysis enabled the identification of ammonia as the parameter of greatest contribution to the toxicity in the sampled locations. In addition, confirmation was obtained by the chemometric tests PCA, FA, HCA and PLS. The mouse bioassay tests (LD50 - 24h) showed toxicity at doses above 2,500 mg.Kg-1 b.w. and at concentrations of cell extract over 50 mg mL-. The higher mortality occurred in 75% of individuals in the group that received concentrations of 100 mg mL- of the material collected at E3 during the dry season. The results of E2 sampling station showed mortality of 25% of individuals at extract concentration of 50 mg mL-; 25% of individuals at 100 mg mL- and 75% of individuals at concentration of 150 mg mL- from the samples collected during the rainy season.

A poluição atmosférica já é considerada um caso de saúde pública nos grandes centros urbanos. Freqüentemente as emissões veiculares são as principais causas dessa poluição, principalmente as provenientes dos motores diesel, os quais, além da produção de material particulado (MP), em cuja superfície são adsorvidas substâncias carcinogênicas e mutagênicas, produzem poluentes como os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs). Contudo não existe uma avaliação direta dos riscos dessas emissões nos seres vivos. Plantas bioindicadoras podem dar idéia desses riscos. Este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial de risco mutagênico da exaustão proveniente de um motor diesel, utilizando o bioensaio Trad-SH (clone KU-20) como bioindicador da poluição do ar. Nos experimentos, a exaustão do motor diesel aspirado de 2.0 L de deslocamento volumétrico foi diluído com ar atmosférico de modo a atingir concentrações de uma atmosfera pesadamente poluída (aproximadamente 50, 100 e 150 ppm de CO). Obtidos estes níveis de diluição, as inflorescências foram expostas a esta mistura de poluentes por duas horas (doses agudas). A concentração de CO foi monitorada continuamente por meio de um analisador de gases Horiba Enda utilizando o princípio de absorção seletiva no infravermelho. Para se avaliar o efeito mutagênico foi feita uma comparação entre as inflorescências não expostas aos poluentes (grupo 1) e as inflorescências expostas (grupos 2, 3 e 4) com aproximadamente 50, 100 e 150 ppm de CO respectivamente. Os dados obtidos foram analisados estatisticamente observando-se que, a freqüência média das mutações no grupo 1 (controle), foi significativamente mais baixa do que aquela dos grupos 3 e 4, porém foi similar à do grupo 2. Por sua vez, não houve diferenças significativas nas freqüências de mutações entre os grupos 3 e 4. Os resultados indicam que a exaustão do motor a diesel teve um papel significativo no desenvolvimento de mutações, mas somente quando diluída para concentrações de CO acima de 100 ppm. / Air pollution caused by vehicle emission has been considered as a major public health concern in the urban centers. Emission from diesel engine powered vehicles, in particular, are highly toxic, since carcinogenic and mutagenic compounds can adsorb on the expelled particles leading to the formation of the so-called polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH\'s). A detailed investigation on the risks of those compounds on the living beings using the methodology applied in the work has not been carried out so far. This work is aimed at evaluating the mutagenic potential of the emission from a diesel engine using the Tradescantia stamen hair assay (TSH), by monitoring the stamen hair mutation in the clone KU-20. Experimentally, the inflorescence of the KU-20 clones was kept for 2 h under a simulated urban heavily polluted atmosphere, obtained by mixing the emission from a diesel engine and atmospheric air. The CO concentration in the atmosphere was monitored using a Horiba-Enda gas analyzer. The mutagenic effects of the atmosphere were analyzed by comparing a group of non-exposed control inflorescence (group 1) to inflorescences kept under polluted atmospheres containing 50, 100 and 150 ppm of CO, assigned to as groups 2, 3 and 4. The experimental data were analyzed using statistical methods. The frequency of mutations observed in the inflorescences from group 2 was slightly higher than that observed in the group 1. In the groups 3 and 4, however, the frequency of mutations was significantly higher than that exhibited by the control group. The latter suggests that the emission from a diesel engine plays an important role in the development of plants mutation, specially for atmospheres containing more than 100 ppm of CO.

Submitted by Biblioteca de Pós-Graduação em Geoquímica BGQ (bgq@ndc.uff.br) on 2016-04-29T16:09:29Z No. of bitstreams: 1 Tese_Ricardo Cesar-2014.pdf: 8808586 bytes, checksum: 7553914038f43221f7bee0f88ba00197 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-29T16:09:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Ricardo Cesar-2014.pdf: 8808586 bytes, checksum: 7553914038f43221f7bee0f88ba00197 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Universidade Federal Fluminense. Instituto de Química. Programa de Pós-Graduação em Geociências-Geoquímica. Niterói, RJ / O presente trabalho trata da avaliação do risco ecológico associado à disposição de sedimentos de dragagem em latossolos e chernossolos, com base em indicadores pedogeoquímicos e ecotoxicológicos. Para tanto, uma amostra de sedimento dragado oriundo do canal do Cunha (Baía de Guanabara-RJ) foi coletada. Estudos preliminares foram conduzidos com uma amostra de lodo de esgoto, de forma a gerar dados-base que subdiassem a adoção de estratégias analíticas com o sedimento dragado. Além da avaliação dos patógenos, foi realizada a caracterização física, química e mineralógica dos materiais. Bioensaios agudos e crônicos com organismos terrestres (minhocas, colêmbolos, enquitreídeos e alface) e aquáticos (microcrustáceos e algas) foram realizados em misturas solo:resíduo. As doses de sedimento (expressas em %) capazes de causar efeitos significativos a 50% dos organismos-teste (CL50 ou CE50) foram estatisticamente estimadas. Os indicadores foram numericamente integrados visando a construção de um índice de risco ecotoxicológico. Os teores de zinco, cobre, chumbo, mercúrio e cromo no sedimento excederam as concentrações estipuladas pela legislação brasileira. As propriedades dos solos estudados desempenharam papel fundamental na redução dos níveis de ecotoxicidade, com especial atenção aos argilominerais 2:1 e aos altos níveis de fertilidade, capazes de atenuar a ecotoxicidade das misturas de Chernossolo. Com o lodo, a reprodução de algas foi o indicador mais sensível (CE50 = 1,61% em Latossolo). Nas misturas de solo:sedimento, a reprodução de algas, a germinação de alface e a imobilidade de microcrustáceos foram os indicadores mais sensíveis, com CE50 em torno de 3,5% em Latossolo. A estimativa numérica do risco revelou níveis maiores de ecotoxicidade para os tratamentos de Chernossolo. Quando os ensaios de reprodução com colêmbolos são excluídos da análise, os riscos são maiores em Latossolo. Tal fato pode estar associado ao fato de que os colêmbolos estão geralmente menos sensíveis à água intertiscial do solo, se comparados aos demais organismos-teste / This work aims to evaluate the environmental risks associated with the disposal of dredged sediments in ferralsols and chernosols, based on pedogeochemical and ecotoxicological indicators. A sample of dredged sediment was collected in the Cunha channel (Guanabara Bay-RJ). Preliminary studies were conducted with a sewage sludge sample (SL), in order to establish analytical estrategies to be adopted in the assays with the sediment. In addition to the pathogens, the physical, chemical and mineralogical properties of the materials were characterized. Acute and chronic bioassays with terrestrial (earthworms, springtails, enchytraeids and lettuce) and aquatic (micro-crustaceans and algae) organisms were performed in mixtures of residue:solo. The doses of sediment (in %) required to cause significant effects on 50% of the exposed organisms (LC50 or EC50) were statistically estimated. The indicators were numerically integrated to estimate the potential risks, based on the construction of an ecotoxicological risk index. The concentrations of zinc, copper, lead, mercury and chromium in the dredged sediment were higher than the limits established by Brazilian legislation. Soil properties played an important role in the reduction of ecotoxicity levels, especially 2:1 clay minerals and high levels of fertility, which were able to reduce the ecotoxicity levels in chernosol mixtures. The assays with SL revealed that the reprocuction of algae was the most sensible indicator (EC50 = 1.61% in ferralsol). In mixtures of soil:sediment, the reproduction of algae, germination of lettuce and immobility of microcrustaceans were the most sensible indicators (EC50 ~ 3.5% in ferralsol). The numerical estimation of the potential risks demonstrated the occurrence of higher levels of ecotoxicity for the chernosols treatments. When the reproduction assay with springtails was excluded from the analysis, the values of risk were higher for the ferralsol mixtures. Such fact is due to the lower sensibility of springtails to soil pore water, compared to the other testorganisms

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / hans, and is secreted into the bloodstream. It plays and important role in regulating the metabolic activities of the body, particularly the homeostasis of the blood glucose. Insulin glargine is a recombinant human insulin analogue produced by DNA technology using a strain of Escherichia coli and the insulin glargine differ only by three amino acids from human insulin. Reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) and size exclusion liquid chromatography (SE-LC) methods were developed and validated for the assessment of insulin glargine in biopharmaceutical formulations. A RP-LC method was carried out on a Jupiter C4 column (250 mm x 4.6 mm i.d.), maintained at 30 ºC. The mobile phase A consisted of 0.05 M sodium sulphate buffer, pH 2.5, and the mobile phase B was acetonitrile. The SE-LC method was carried out on a BioSep-SEC-S 2000 column (300 mm x 7.8 mm i.d.), maintained at 25 ºC. The mobile phase consisted of 0.03 M MES acid buffer, pH 2.5, run isocratically at a flow rate of 0.6 mL/min. Chromatographic separation was obtained with retention times of 7.5 min, and 9.9 min, and was linear over the concentration range of 0.05 - 200 μg/mL (R2 = 0.9998) and 0.02 - 180 μg/mL (R2 = 0.9999), respectively, for RP-LC and SE-LC, with photodiode array (PDA) detection at 214 nm and 200 nm for RP-LC and SE-LC methods, respectively. The limits of detection and quantitation were 0.018 and 0.054 μg/mL, respectively, for the RP-LC and 0.009 and 0.027 μg/mL, for the SE-LC. Specificity was established in degradation studies, which also showed that there was no interference of the excipients. Equally, the accuracy was 100.13% and 99.38%, with bias lower than 0.85% and than 0.86%. The validated methods were applied for the determination of insulin glargine and related proteins and high molecular mass, in biotechnology-derived products, giving lower mean differences of the estimated content/potencies of 0.21% and 0.16% for the RP-LC and SE-LC related, compared to the in vitro cell culture assay. It is concluded that represents a contribution to establish alternatives to monitor stability, quality control and thereby assure therapeutic efficacy of the biotechnology-derived medicine. / A insulina humana é um hormônio secretado pelas células β, das ilhotas de Langerhans, e regula os níveis sanguíneos de glicose. A insulina glargina é produzida pela tecnologia do DNA recombinante, expressa em Escherichia coli, e difere da insulina humana pela modificação da aspargina na posição 21 da cadeia A por uma glicina, além da adição de dois resíduos de arginina C-terminais na cadeia B. No presente trabalho foram desenvolvidos e validados métodos por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) e por exclusão molecular (CL-EM) para a avaliação de insulina glargina em formulações biofarmacêuticas. No método por CL-FR, foi utilizada coluna Júpiter C4 (250 mm x 4,6 mm d.i.), mantida a 30 ºC. A fase móvel A foi constituída por tampão sulfato de sódio 0,05 M, pH 2,5, e a fase móvel B por acetonitrila, eluídas com fluxo constante de 0,5 mL/min. No método por CL-EM foi utilizada coluna BioSep-SEC-S 2000 (300 mm x 7.8 mm d.i.), mantida a 25 ºC. A fase móvel foi constituída de tampão MES 0,03 M, pH 2,5, eluída em vazão isocrática de 0,6 mL/min. Para ambos os métodos utilizou-se detector de arranjo de diodos (DAD) com detecções em 214 nm e 200 nm para CL-FR e CL-EM, respectivamente. A separação cromatográfica foi obtida nos tempos de 7,5 e 9,9 min, sendo linear na faixa de concentração de 0,05 - 200 μg/mL (R2 = 0,9998) e 0,02 - 180 μg/mL (R2 = 0,9999), respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. Os limites de detecção e quantificação foram 0,018 e 0,054 μg/mL, respectivamente, para o método por CL-FR e 0,009 e 0,027 μg/mL por CL-EM. A especificidade foi avaliada em estudos de degradação, que também demonstraram que não houve interferência dos excipientes. A exatidão foi 100,13 e 99,38%, com bias inferior a 0,85 e 0,86%, respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. Os métodos propostos foram aplicados para avaliação da potência de insulina glargina, de proteínas relacionadas agregados de alta massa molecular em formulações biofarmacêuticas, e os resultados foram comparados com o bioensaio por cultura de células in vitro, observando-se diferenças das médias de teor/potência 0,21% e 0,16% inferiores para os métodos por CL-FR e CL-EM. Concluí-se que representa contribuição para estabelecer procedimentos para monitorar a estabilidade, o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biotecnológico.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Human interferon-α2a (hIFN-α2a) is a natural protein produced by the cells of the immune system with antiviral, antiproliferative and immunomodulatory properties. A size exclusion liquid chromatography (SE-LC) method was validated for the determination of recombinant interferon-α2a (rhIFN-α2a) in pharmaceutical formulations without human serum albumin. The SE-LC method was carried out on a BioSep-SEC-S 2000 column (300 mm x 7.8 mm i.d.) maintained at 25°C. The mobile phase consisted of 0.001 M monobasic potassium phosphate, 0.008 M sodium phosphate dibasic and 0.2 M sodium chloride buffer, pH 7.4, run at a gradiente flow rate and using photodiode array (PDA) detection at 214 nm. The chromatographic separation was achieved with retention time of 17.2 min, and was linear over the concentration range of 0.5-50 MUI/mL (r2 = 0.9996). The accuracy was 101.39% with bias lower than 1.67%. The limits of detection and quantitation were 0.22 and 0.5 MIU/mL, respectively, and the method validation demonstrated acceptable results for precision and robustness. The proposed method was applied for the analysis of rhIFN-α2a in pharmaceutical dosage forms, and the content/potencies correlated to the previously validated reversed-phase (RP-LC), and the in vitro bioassay. The pharmaceutical samples were analyzed by the chromatographic methods and compared to the bioassay, showing mean differences between the estimated potency of 1.50% higher for SE-LC, and 2.45% lower for the RP-LC. The alternative methods studies contribute to improve the quality control, assuring the therapeutic efficacy of the biological medicine. Moreover, the pharmacokinetic parameters of the formulations A and B were evaluated by subcutaneous injection in rats, showing comparable profiles with Cmax of 7924.60 and 8698.68 pg/mL, respectively, and Tmax= 60 min. / O interferon-α2a humano (hIFN-α2a) é uma proteína produzida pelas células do sistema imune com propriedades imunomoduladora, antiviral e antiproliferativa. No presente trabalho, foi validado método por cromatografia líquida por exclusão molecular (CL-EM), para determinação de interferon-α2a recombinante (rhIFN-α2a) em formulações farmacêuticas sem albumina. O método CL-EM foi validado empregando coluna BioSep-SEC-2000 S (300 mm x 7,8 mm d.i.) mantida a temperatura de 25°C. A fase móvel foi composta de tampão fosfato de potássio monobásico 0,001 M, fosfato de sódio dibásico 0,008 M e cloreto de sódio 0,2 M, pH 7,4, eluída em gradiente de fluxo e utilizando arranjo de diodos (DAD) com detecção em 214 nm. A separação cromatográfica foi alcançada com o tempo de retenção de 17,2 min e o método foi linear no intervalo de concentração de 0,5-50 MUI/mL (r2 = 0,9996). A exatidão média foi de 101,39%, com erro calculado inferior a 1,67%. Os limites de detecção e quantificação foram de 0,22 e 0,5 MUI/mL, respectivamente e a validação demonstrou parâmetros aceitáveis de precisão e robustez. O método proposto foi aplicado para análise de formulação farmacêutica de rhINF-α2a e os teores/potências correlacionados com aqueles fornecidos pelos métodos previamente validados por CL-FR e bioensaio in vitro. Estabeleceu-se correlação entre os métodos, demonstrando que os biofármacos comerciais apresentaram diferenças entre as médias 1,5% maiores para o CL-EM, e 2,45% menores para CL-FR, em relação ao bioensaio. Assim, contribuiu-se para estabelecer alternativas que aprimoram o controle de qualidade, assegurando a eficácia terapêutica do produto biológico. Além disso, avaliaram-se os parâmetros farmacocinéticos das formulações A e B após injeção subcutânea em ratos, demonstrando perfis comparáveis com Cmax de 7924,60 e 8698,68 pg/mL, respectivamente, e Tmax= 60 min.

O presente estudo foi desenvolvido para verificar se o bioensaio Trad-MCN, desenvolvido com inflorescências de Tradescantia pallida cv. Purpurea pode discriminar riscos clastogênicos em diferentes locais e épocas na cidade de Santo André-SP, contaminada por diferentes tipos de poluentes, determinar se as variações da freqüência de micronúcleos podem ser explicadas por fatores ambientais característicos da região e verificar se o potencial acumulador de elementos químicos de T. pallida pode ser usado para mapeamento de fontes emissoras de poluentes contendo metais e outros compostos tóxicos. Vasos com a planta foram expostos em locais com alta contaminação por ozônio (Capuava e Escola), em locais com maior emissão veicular (Centro e Parque Celso Daniel) e em uma área supostamente pouco contaminada (Parque do Pedroso). Durante o período de setembro de 2003 a setembro de 2004, vinte inflorescências jovens foram colhidas quinzenalmente e a freqüência de micronúcleos (MCN) foi estimada. Durante o período de maio a junho de 2004, folhas em diferentes posições nas inflorescências da planta foram colhidas para determinação da concentração de elementos químicos, entre os quais metais pesados, pelo método da ativação de nêutrons. As condições ambientais observadas foram suficientemente estressantes para promover o aumento da freqüência de micronúcleos. O bioensaio Trad-MCN identificou forte risco clastogênico em áreas com maior emissão veicular. Entretanto, a freqüência de micronúcleos em Capuava e no Centro não foram preditas somente por poluentes atmosféricos da região. Condições climáticas extremas, como temperaturas mínima e máxima, baixa umidade relativa do ar e baixa precipitação contribuíram para a intensificação da formação de MCN. Para um sistema eficiente de biomonitoramento é recomendável minimizar os efeitos dos fatores climáticos. A análise por ativação de nêutrons identificou um evidente acúmulo foliar de elementos importantes para biomonitoramento da poluição aérea, tais como: Ba, Ce, Co, Cr, Cs, La, Rb, Sb, Sc e Zn. Verificou-se que a concentração dos metais nas folhas inseridas nas inflorescências não teve relação com a formação de micronúcleos, porém, eles foram marcadores de locais específicos, auxiliando no mapeamento das fontes poluidoras de cada região estudada. A concentração de Ba foi mais elevada nas folhas provenientes das áreas centrais, podendo ser considerado marcador de emissão veicular e La e Zn destacaram-se na área industrial da cidade, sendo considerados marcadores da emissão do pólo petroquímico. Considerando as condições em que foi desenvolvido o presente estudo, a análise das concentrações foliares de elementos tóxicos, foi mais adequada para mapear fontes de emissão de poluentes na atmosfera de Santo André. / The present study aimed at verifying if the Trad-MCN assay, developed with inflorescences of Tradescantia pallida cv. Purpurea might discriminate clastogenic risks among sites and periods at the Santo André city, contaminated by different air pollutants, determining if the variations in the frequency of micronuclei can be explained by environmental factors that characterize the stress situation in each site and verify if the accumulator potential of chemical elements of T. pallida may be used to indicate pollutant sources containing metals or other toxic compounds. Potted plants were exposed in sites characterized by high air contamination by ozone (Capuava and School) and in sites reached by high vehicular emissions (Downtown and C. Daniel Park). From September/2003 to September/2004, twenty young inflorescences were be-weekly collected from each site and the frequencies of micronuclei (MCN) were estimated. From May/2004 to June/2004, leaves of T. pallida inserted in different positions on the inflorecences were collected to determine the concentrations of chemical elements, by instrumental neutron activation analysis, among them heavy metals. The environmental conditions were stressing enough to promote an increase of chromosomal breakages in pollen mother cells of inflorescences of T. Pallida. The Trad-MCN assay identified strong clastogenic risks at the sites reached by vehicular emissions. However, the frequency of micronuclei at Capuava and Downtown could not be only predicted by pollutants that characterized the air contamination in both sites. More extreme climatic conditions, mainly low and high temperatures, low relative humidity and low rainfall, intensified the formation of MCN. Therefore, the biomonitoring system should be improved in order to minimize this negative influence of climatic factors. The neutron activation analysis identified an evident leaf accumulation of important elements for biomonitoring air pollution, such as: Ba, Ce, Co, Cr, Cs, La, Rb, Sb, Sc and Zn. There was no relation between the concentrations of metals in the leaves inserted in the inflorescences and the frequency of micronuclei, however, the metal accumulation could discriminate specific sites, contributing to the mapping of polluted sources in each region studied. Leaf concentrations of Ba were higher in central areas, so that they can be considered markers of vehicular emissions. La and Zn were evidently accumulated in leaves from the industrial areas of the city, being considered indicators of emissions from the petrochemical pole. Taking in account the conditions in which the present study was developed, the analysis of leaf concentrations leaves of toxic elements was more adequate to map emission sources of air pollutants in Santo André.

A cebola comum Allium cepa L. (2n=16), devido à sua excelente condição cromossômica, tem sido largamente utilizada como um sistema de testes para se examinar os efeitos citogenéticos causados por diversos compostos químicos em material biológico. Em estudos de monitoramento de riscos ambientas, observou-se limitação no crescimento das raízes quando as cebolas são expostas a aguas residuárias provenientes de indústrias químicas. Nesse estudo, nós avaliamos este sistema de testes escolhendo alguns compostos de metais pesados, cujos efeitos em outros sistemas de testes já se encontram descritos. Além disso, foram estuados vários fatores que poderiam interferir nos resultados tais como: temperatura; luminosidade; qualidade da água e qualidade das cebolas. As concentrações mais baixas empregadas (1,5 mg/l) nos testes, de cádmio e cobre demostraram alta capacidade inibidora sobre o crescimento das raízes. O zinco apresentou toxicidade moderada a 1,5 mg/l e crescente às concentrações sucessivas mais elevadas. Efluentes industriais, contendo misturas de níquel e sulfatos ou cobre e cianeto, demonstraram-se altamente inibidores às concentrações mais baixas empregadas (0,7%), resultados que demonstram a alta sensibilidade do teste aos sais de metais pesados. Quanto às condições experimentais que levaram a esses resultados, os testes revelaram que não existe influência pronunciada dos fatores luminosidade e temperatura. Quanto à água para controle e diluição, não deve ser de torneira devido ao efeito inibidor do zinco e do cobre. Os resultados foram contraditórios em relação a um possível efeito osmótico da água destilada, sendo conveniente adicionar entre 100 a 250 mg/l de NaCl. A melhor resposta foi obtida com cebolas de origem argentina de 3,5 a 4,0 cm de diâmetro sendo preferível a manutenção de cascas para evitar murchamento. / The common onion Allium cepa. L., due to its excellent chromosome conditions, has been widely used as a test system for examining the citogenetic effects of several chemical compounds on biological material. It has been observerd, in monitoring environmental studies, some growth restriction on Allium roots when they are exposed to wastewater from chemical factories. In this study, we evaluate these test systems by choosing some hard metals which harmful effects on biological materials has been already described. Furthermore, some factors that could interfere on the results, such as: temperature; light; water quality and onion quality were studied. The lowest concentration (1.5 mg/l) for cadmium and cupper were found to have hard capacity to inhibit root growth. The zinc showed moderate toxicity at 1.5 mg/l and this effect was more evident at increased concentrations. The industrial wastewater that contains mixture of nickel and sulphate or cupper and cyanate inhibited root growth at lower concentration (0.7%). These results showed that the test system has high sensitivity for hard metals. There was no direct influence of temperature and light on the experiment conditions. With regard to the type of water, tap water should not be used because of inhibition on the root growth caused by zinc and copper. The results contradicted a potential osmotic effect of distillated water, being convenient to add 100 - 250 mg/l of NaCl. The best response was obtained with onions from Argentina with 3.5 - 4.0 cm of diameter being recommended to keep the onion peel for avoiding dryness.

Neste trabalho foi explorado o potencial das actinobactérias como produtoras de agentes antimicrobianos contra bactérias causadoras da mastite bovina. Para este fim, foram otimizados dois diferentes bioensaios um de antagonismo e o outro de antibiose, contra 13 bactérias Gram-positivas e Gram-negativas relacionadas a mastite bovina. Através do bioensaio de antagonismo 120 actinobactérias foram triadas, sendo 55% delas consideradas ativas. Para o ensaio de antibiose foram triados 70 extratos brutos e 60% mostram a formação de halos de inibição. Os extratos brutos Caat 1-54, Caat 2-63 e Caat 8-25 foram considerados os mais promissores dentre todos os extratos estudados. Esses extratos brutos foram submetidos a estudos de desreplicação empregando LC-PAD-MS/MS e isolamento guiado por bioensaio para a identificação de seus metabolitos ativos. Os extratos Caat 1-54 e Caat 2-63 foram ativos principalmente contra as linhagens de bactérias Gram-positivas e a ação antimicrobiana observada foi atribuída a presença da lisolipina I e actinomicina D e V, respectivamente. O extrato Caat 8-25 foi ativo tanto contra bactérias Gram-positivas como para as Gram-negativas, sendo a oxitetraciclina associada a atividade contra as linhagens Gram-positivas e a herbicidina B ativo contra linhagens Gram-negativas. O estudo de desreplicação por LC-MS/MS também possibilitou a identificação de outros metabolitos secundários presentes nos diferentes extratos estudados. Para o extrato Caat 2-63 foi identificada a presença de outros peptídeos provenientes da via biossintética da actinomicina D e, no extrato bruto Caat 8-25 também foi identificado herbicidina F. Um estudo de mudança no metabolismo também foi realizado para a actinobactérias Caat 1-54 produtora de lisolipina. Através da suplementação de íons brometo no meio de cultivo em diferentes períodos da fermentação foi observada a produção de um análogo da lisolipina com bromo e da lisolipina clorada e bromada. Estudos de DESI-TLC-MS associado a bioautografia em TLC também foram aplicados para análise do extrato bruto Caat 2-63 e mostraram a potencialidade desta metodologia para acelerar a identificação de compostos ativos, pois a análise por espectrometria de massas na região da placa cromatográfica correspondente ao halo de inibição revelou a presença de actinomicina D e V, as quais já haviam sido associadas a atividade antimicrobiana deste extrato bruto. Assim os resultados obtidos nesta tese confirmam o grande potencial das actinobactérias como fonte promissoras de compostos bioativos e que a espectrometria de massas empregada nos seus diferentes modos de análise acelera o processo de identificação desses compostos. / In this work were used two different bioassays to evaluate the antimicrobial potential of some actinomycetes against bacteria that cause bovine mastitis. For this propose an antagonism and antibiose assays were optimized against 13 Gram-positive and Gram-negative bacteria related with bovine mastitis. Through antagonism bioassay 120 actinomycetes were screened and 55% were considered active. In disk diffusion bioassay, 70 crude extracts were screened and 60% showed inhibition zones. The crude extracts Caat 1-54, Caat 2-63 and Caat 8-25 were considered the most promising of all the extracts. Dereplication studies and fractionation guided by bioassay were procedure with this extracts to identify the actives metabolites. The extracts Caat 1-54 and Caat 2-63 were active against strains of Gram-positive bacteria and the antimicrobial effect was related to lisolipin I and actinomycin D and V, respectively. The extract Caat 8-25 was active against both Gram-positive and Gram-negative bacteria. Oxytetracycline were associated with activity against Gram-positives strains and a herbicidin B was active against Gram-negative bacteria. Using dereplication strategies by LC-MS/MS others compounds were characterized in different crude extracts. The extract Caat 2-63 was also identified the presence of other peptides from the same biosynthetic pathway of actinomycin D and for crude extract Caat 8-25 were identified herbicidin F. In addition, studies of the shift in secondary metabolism carried out for actinobacteria Caat 1-54 (lysolipin producer). Culture medium supplementation by bromide ions at different stages of fermentation induce the production of bromine lysolipin analog and a chloro-bromine lysolipin. DESI-MS TLC studies associated with TLC bioautography were used to analyze a crude extract Caat 2-63. This study showed how this method could be used to accelerate the identification of active compounds, because mass spectrometry analysis in situ at bioautigraphy inhibition zone showed the presence of actinomycin D and V, which had been associated with antimicrobial activity of this crude extract. Therefore, the results of this thesis confirm the potential of actinobacteria as bioactives compounds source and the importance of mass spectrometry experiments to accelerate the identification of these compounds.