Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O abastecimento público de água em termos de qualidade e quantidade é uma preocupação crescente da humanidade, em função da escassez de recurso hídrico e da deterioração da qualidade dos mananciais. A desinfecção é o objetivo principal e mais comum da cloração, porem aparecem os subprodutos como os THMs (trihalometanos), como produtos resultantes da reação entre substâncias químicas que se utilizam no tratamento oxidativo e matérias orgânicas naturalmente presentes na água. A doença renal crônica constitui, atualmente, importante problema de saúde pública. No Brasil, a prevalência de pacientes mantidos em programas ssistenciais destinados ao controle e tratamento de Insuficiência Renal Crônica (IRC) dobrou nos últimos anos. Em Boa Vista, Roraima não foi realizado nenhum estudo com relação a níveis de THM na água potável distribuída pela Estação de Tratamento. Portanto, houve necessidade de identificar os níveis de clorofórmio na água potável distribuída e verificar possível relação com incidência de insuficiência renal crônica na população atendida pela Estação de Tratamento de Água (ETA). Utilizamos amostras de água da ETA de Boa Vista, Roraima, e estas foram analisadas através da Extração em Fase Sólida (SPE) e posteriormente pela espectrofotometria. Nossas amostras foram coletadas nos meses de janeiro a julho de 2011 na saída da Estação de Tratamento de Água de Boa. Também verificamos a incidência de Insuficiência Renal Crônica em Boa Vista, RR nos anos de 2008 e 2009 no serviço de faturamento do Hospital Geral de Roraima. Realizamos um bioensaio com Ratos Wistar Rattus norvegicusm, fornecido pelo Biotério da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. Os ratos ao término de 80 dias foram sacrificados, retirados os rins e enviados ao Laboratório Central de Roraima para confecção das lâminas histológicas e análise da lesão renal. Obtivemos concentrações de clorofórmio em todos os meses analisados. Durante o bioensaio recriamos as condições onde os ratos ingeriram dosagens diferentes de clorofórmio na água potável (100 e 300 mg/kg). Em nosso estudo elaboramos um método novo para confecção da curva analítica de calibração para o clorofórmio, sendo este um método de baixo custo de mercado e de fácil aplicação. O método proposto apresentou boa precisão e linearidade atendendo o interesse aos limites máximos estabelecidos pela Portaria 518/2004 do Ministério da Saúde, garantindo a aplicabilidade do mesmo para a análise simultânea de clorofórmio em água destinada ao consumo humano. / The public water supply in terms of quality and quantity is a growing concern of mankind, because of water scarcity and deteriorating quality of water sources. Disinfection is the primary purpose of chlorination and more common, but it appears as the by-products like THMs products of the reaction between chemicals that are used to treat oxidative and organic materials naturally present in water. Chronic kidney disease is currently an important public health problem. In Brazil, the prevalence of patients maintained on welfare programs for the control and treatment of chronic renal failure (CRF) has doubled in recent years. In Boa Vista, Roraima was not carried out any studies regarding THM levels in drinking water by sewage treatment plant. Therefore, it was necessary to identify the levels of chloroform in drinking water and check the possible relation with the incidence of chronic renal failure in the population served by ETA. We use water from the water treatment station in Boa Vista, Roraima, and these were analyzed by Solid Phase Extraction (SPE) and subsequently by spectrophotometry. Our samples were collected in January, February, March, April, May and June 2011 off the Water Treatment Plant for Good. We found the incidence of chronic renal failure in Boa Vista, in the years 2007 to 2009 in billing service General Hospital of Roraima. For the bioassay used adult females, with approximately five weeks, Wistar rats Rattus lineage norvegicusm provided by the vivarium of the Federal University of Mato Grosso do Sul mice at the end of 80 days were sacrificed, kidneys removed and sent to Central Laboratory Roraima to make the slides and histological analysis of renal injury. Obtained concentrations of chloroform in all months analyzed. During the bioassay re-create the conditions where rats ingested different doses of chloroform in drinking water (100 and 300 mg / kg). In our study we developed a new method to construct the analytical calibration curve for chloroform, which is a low-cost market and easy to apply. The proposed method showed good precision and linearity having the interest to the ceilings established by Decree 518/2004 of the Ministry of Health, ensuring the applicability thereof to the simultaneous analysis of chloroform in water intended for human consumption.

O presente estudo foi desenvolvido para verificar se o bioensaio Trad-MCN, desenvolvido com inflorescências de Tradescantia pallida cv. Purpurea pode discriminar riscos clastogênicos em diferentes locais e épocas na cidade de Santo André-SP, contaminada por diferentes tipos de poluentes, determinar se as variações da freqüência de micronúcleos podem ser explicadas por fatores ambientais característicos da região e verificar se o potencial acumulador de elementos químicos de T. pallida pode ser usado para mapeamento de fontes emissoras de poluentes contendo metais e outros compostos tóxicos. Vasos com a planta foram expostos em locais com alta contaminação por ozônio (Capuava e Escola), em locais com maior emissão veicular (Centro e Parque Celso Daniel) e em uma área supostamente pouco contaminada (Parque do Pedroso). Durante o período de setembro de 2003 a setembro de 2004, vinte inflorescências jovens foram colhidas quinzenalmente e a freqüência de micronúcleos (MCN) foi estimada. Durante o período de maio a junho de 2004, folhas em diferentes posições nas inflorescências da planta foram colhidas para determinação da concentração de elementos químicos, entre os quais metais pesados, pelo método da ativação de nêutrons. As condições ambientais observadas foram suficientemente estressantes para promover o aumento da freqüência de micronúcleos. O bioensaio Trad-MCN identificou forte risco clastogênico em áreas com maior emissão veicular. Entretanto, a freqüência de micronúcleos em Capuava e no Centro não foram preditas somente por poluentes atmosféricos da região. Condições climáticas extremas, como temperaturas mínima e máxima, baixa umidade relativa do ar e baixa precipitação contribuíram para a intensificação da formação de MCN. Para um sistema eficiente de biomonitoramento é recomendável minimizar os efeitos dos fatores climáticos. A análise por ativação de nêutrons identificou um evidente acúmulo foliar de elementos importantes para biomonitoramento da poluição aérea, tais como: Ba, Ce, Co, Cr, Cs, La, Rb, Sb, Sc e Zn. Verificou-se que a concentração dos metais nas folhas inseridas nas inflorescências não teve relação com a formação de micronúcleos, porém, eles foram marcadores de locais específicos, auxiliando no mapeamento das fontes poluidoras de cada região estudada. A concentração de Ba foi mais elevada nas folhas provenientes das áreas centrais, podendo ser considerado marcador de emissão veicular e La e Zn destacaram-se na área industrial da cidade, sendo considerados marcadores da emissão do pólo petroquímico. Considerando as condições em que foi desenvolvido o presente estudo, a análise das concentrações foliares de elementos tóxicos, foi mais adequada para mapear fontes de emissão de poluentes na atmosfera de Santo André. / The present study aimed at verifying if the Trad-MCN assay, developed with inflorescences of Tradescantia pallida cv. Purpurea might discriminate clastogenic risks among sites and periods at the Santo André city, contaminated by different air pollutants, determining if the variations in the frequency of micronuclei can be explained by environmental factors that characterize the stress situation in each site and verify if the accumulator potential of chemical elements of T. pallida may be used to indicate pollutant sources containing metals or other toxic compounds. Potted plants were exposed in sites characterized by high air contamination by ozone (Capuava and School) and in sites reached by high vehicular emissions (Downtown and C. Daniel Park). From September/2003 to September/2004, twenty young inflorescences were be-weekly collected from each site and the frequencies of micronuclei (MCN) were estimated. From May/2004 to June/2004, leaves of T. pallida inserted in different positions on the inflorecences were collected to determine the concentrations of chemical elements, by instrumental neutron activation analysis, among them heavy metals. The environmental conditions were stressing enough to promote an increase of chromosomal breakages in pollen mother cells of inflorescences of T. Pallida. The Trad-MCN assay identified strong clastogenic risks at the sites reached by vehicular emissions. However, the frequency of micronuclei at Capuava and Downtown could not be only predicted by pollutants that characterized the air contamination in both sites. More extreme climatic conditions, mainly low and high temperatures, low relative humidity and low rainfall, intensified the formation of MCN. Therefore, the biomonitoring system should be improved in order to minimize this negative influence of climatic factors. The neutron activation analysis identified an evident leaf accumulation of important elements for biomonitoring air pollution, such as: Ba, Ce, Co, Cr, Cs, La, Rb, Sb, Sc and Zn. There was no relation between the concentrations of metals in the leaves inserted in the inflorescences and the frequency of micronuclei, however, the metal accumulation could discriminate specific sites, contributing to the mapping of polluted sources in each region studied. Leaf concentrations of Ba were higher in central areas, so that they can be considered markers of vehicular emissions. La and Zn were evidently accumulated in leaves from the industrial areas of the city, being considered indicators of emissions from the petrochemical pole. Taking in account the conditions in which the present study was developed, the analysis of leaf concentrations leaves of toxic elements was more adequate to map emission sources of air pollutants in Santo André.

Submitted by Biblioteca de Pós-Graduação em Geoquímica BGQ (bgq@ndc.uff.br) on 2017-09-18T18:23:01Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO DE MESTRADO - THIAGO DIAS LOPES DA ROSA.pdf: 1856868 bytes, checksum: 24f79a23cf37a8161ea8b1930ad99eb2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-18T18:23:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO DE MESTRADO - THIAGO DIAS LOPES DA ROSA.pdf: 1856868 bytes, checksum: 24f79a23cf37a8161ea8b1930ad99eb2 (MD5) / Universidade Federal Fluminense. Instituto de Química. Programa de Pós-Graduação em Geoquímica, Niterói, RJ / Atualmente, pouco se sabe sobre as possíveis relações entre as concentrações das formas biodisponíveis de metais e os biomarcadores microbiológicos de toxicidade. Este estudo teve como objetivo avaliar a relação entre os indicadores geoquímicos e microbiológicos de biodisponibilidade e toxicidade de metais em sedimentos da região do Saco do Engenho (Baía de Sepetiba, RJ). O fracionamento geoquímico de Cd, Zn, Pb e Cu, através de uma extração seqüencial (BCR de 3 etapas), e 3 indicadores microbiológicos de toxicidade (biomarcadores enzimáticos, demanda energética bacteriana e biomassa) foram avaliados em amostras de sedimentos coletados na Baía de Sepetiba, na região próxima ao Porto de Itaguaí e ao Saco do Engenho. Um bioensaio de ressuspensão de sedimento também foi realizado no qual foram avaliados os mesmos parâmetros microbiológicos além do pH, oxigênio dissolvido, temperatura e a concentração de metais dissolvidos. Nas amostras de sedimento, em geral, as concentrações de metais estavam predominantemente na forma oxidada, associados hidróxidos de Fe e Mn. As concentrações máximas de metais obtidas pela extração seqüencial foram observadas próximas ao Saco do Engenho, atingindo 22 mg.kg-1 de Cd, 3855 mg.kg-1 de Zn, 20 mg.kg-1 de Pb e 18 mg.kg-1 de Cu. Esta região ainda possui uma das principais fontes de Cd e Zn da baía. O total (somatório) das concentrações extraídas pelo método BCR de 3 etapas e a demanda energética bacteriana correlacionaram-se significativamente e foram considerados como os melhores indicadores da biodisponibilidade e toxicidade de metais utilizados. No bioensaio a maior degradação da matéria orgânica, via enzimas esterases, pela atividade bacteriana e as maiores concentrações de metais dissolvidos coincidiram em 192 horas, sugerindo que a comunidade bacteriana influenciou mais a remobilização de metais para fase dissolvida do que as variações físico-químicas do meio. Neste experimento, os indicadores microbiológicos de toxicidade foram limitados quando as concentrações de metais biodisponiveis atingiram níveis letais. Desta forma foi possível concluir que marcadores geoquímicos e microbiológicos são limitados quando aplicados individualmente na avaliação de impactos causados pela contaminação ambiental por metais. / The possible relations between metal bioavailable forms and microbiological indicartors of toxicity are currently poorly understood. This study aims to evaluate the relationship between geochemical and microbiological indicators of metal toxicity in sediments from Saco do Engenho (Sepetiba Bay, Brazil). The geochemical partitioning of Cd, Zn, Pb and Cu (following the BCR method) and toxicity indicators (enzymatic biomarkers, bacterial energetic demand and bacterial biomass) were evaluated in bottom sediments and in a sediment resuspension bioassay. In the bioassay, these variables were also evaluated, besides pH, dissolved oxygen, temperature and dissolved metal concentrations. Sediment samples generally presented trace metals in the oxidized form (associated with Fe and Mn oxides). Maximum trace metal concentrations were found near Saco do Engenho (22 mg kg-1 Cd, 3855 mg kg-1 Zn, 20 mg kg-1 Pb and 18 mg kg-1 Cu), indicating that it still is a major source of Cd and Zn to the bay. The sums of BCR method phases extracted for each metal and the bacterial energetic demand presented a significant positive correlation and were considered as the better indicators of metal bioavailability and toxicity. In the bioassay, the higher activity of the esterase enzyme and metal concentration peaks coincided at 192 h of resuspension, suggesting that bacterial activity influenced metal mobilization to dissolved phase in a greater extent than physicochemical variability. In such experiment, the microbiological indicators were limited when bioavailable metals reach lethal levels. Therefore, it was concluded that geochemical and microbiological markers are limited when applied individually to evaluate metal pollution impacts

Descreve-se os achados epidemiológicos e clínico-patológicos das clostridioses diagnosticadas no Setor de Patologia Veterinaria da Universidade Federal do Rio Grande do Sul no período 1996-março/2010. Este estudo incluiu uma pesquisa retrospectiva nos arquivos do SPV e uma etapa prospectiva, a qual também teve o objetivo de desenvolver exames complementares específicos para cada clostridiose. As clostridioses mais prevalentes foram tétano (em equinos, bovinos, ovinos e caprinos), botulismo (em bovinos, suínos e aves) e enterotoxemia (em caprinos). Também houve casos de edema maligno em equinos, bem como de carbúnculo sintomático e hemoglobinúria em bovinos. Adicionalmente, foram coletadas amostras de soro sanguíneo de animais afetados por tétano, em diferentes estágios de evolução da doença, para subsequente inoculação em camundongos (testes de bioensaio) e comprovação da técnica no diagnóstico da enfermidade. / This study describes the epidemiological and clinicopathological findings of clostridial diseases diagnosed in the 1996-March, 2010 period in the Setor de Patologia Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (SPV_UFRGS). A retrospective survey in the files of SPV was complemented with a prospective phase, which also aimed developing complementary diagnostic tests of clostridiosis. The most prevalent clostridiosis were tetanus (in horses, cattle, sheep and goats), botulism (in cattle, pigs and birds), and enterotoxemia in goats. There also were cases of malignant edema in horses, blackleg and bacillary hemoglobinuria in cattle. In addition, blood serum samples from animals affected by tetanus on different stages of the disease evolution were applied in mice bioassay, as a complementary diagnosing test for the disease.

Descreve-se os achados epidemiológicos e clínico-patológicos das clostridioses diagnosticadas no Setor de Patologia Veterinaria da Universidade Federal do Rio Grande do Sul no período 1996-março/2010. Este estudo incluiu uma pesquisa retrospectiva nos arquivos do SPV e uma etapa prospectiva, a qual também teve o objetivo de desenvolver exames complementares específicos para cada clostridiose. As clostridioses mais prevalentes foram tétano (em equinos, bovinos, ovinos e caprinos), botulismo (em bovinos, suínos e aves) e enterotoxemia (em caprinos). Também houve casos de edema maligno em equinos, bem como de carbúnculo sintomático e hemoglobinúria em bovinos. Adicionalmente, foram coletadas amostras de soro sanguíneo de animais afetados por tétano, em diferentes estágios de evolução da doença, para subsequente inoculação em camundongos (testes de bioensaio) e comprovação da técnica no diagnóstico da enfermidade. / This study describes the epidemiological and clinicopathological findings of clostridial diseases diagnosed in the 1996-March, 2010 period in the Setor de Patologia Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (SPV_UFRGS). A retrospective survey in the files of SPV was complemented with a prospective phase, which also aimed developing complementary diagnostic tests of clostridiosis. The most prevalent clostridiosis were tetanus (in horses, cattle, sheep and goats), botulism (in cattle, pigs and birds), and enterotoxemia in goats. There also were cases of malignant edema in horses, blackleg and bacillary hemoglobinuria in cattle. In addition, blood serum samples from animals affected by tetanus on different stages of the disease evolution were applied in mice bioassay, as a complementary diagnosing test for the disease.

Descreve-se os achados epidemiológicos e clínico-patológicos das clostridioses diagnosticadas no Setor de Patologia Veterinaria da Universidade Federal do Rio Grande do Sul no período 1996-março/2010. Este estudo incluiu uma pesquisa retrospectiva nos arquivos do SPV e uma etapa prospectiva, a qual também teve o objetivo de desenvolver exames complementares específicos para cada clostridiose. As clostridioses mais prevalentes foram tétano (em equinos, bovinos, ovinos e caprinos), botulismo (em bovinos, suínos e aves) e enterotoxemia (em caprinos). Também houve casos de edema maligno em equinos, bem como de carbúnculo sintomático e hemoglobinúria em bovinos. Adicionalmente, foram coletadas amostras de soro sanguíneo de animais afetados por tétano, em diferentes estágios de evolução da doença, para subsequente inoculação em camundongos (testes de bioensaio) e comprovação da técnica no diagnóstico da enfermidade. / This study describes the epidemiological and clinicopathological findings of clostridial diseases diagnosed in the 1996-March, 2010 period in the Setor de Patologia Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (SPV_UFRGS). A retrospective survey in the files of SPV was complemented with a prospective phase, which also aimed developing complementary diagnostic tests of clostridiosis. The most prevalent clostridiosis were tetanus (in horses, cattle, sheep and goats), botulism (in cattle, pigs and birds), and enterotoxemia in goats. There also were cases of malignant edema in horses, blackleg and bacillary hemoglobinuria in cattle. In addition, blood serum samples from animals affected by tetanus on different stages of the disease evolution were applied in mice bioassay, as a complementary diagnosing test for the disease.

Botulinum toxin type A (BTTA) is a polypeptide with 1296 amino acids and its used in some pathologies like hyperhidrosis and migraine, but the cosmetic area is the most important application. BTTA is produced from broth-culture synthesized by the Clostridium botulinum as a single peptide with 150 kDa. Reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) method was developed and validated for the assessment of botulinum toxin type A in biopharmaceutical formulations. A RP-LC method was carried out on a Zorbax 300 SB C18 column (150 mm x 4.6 mm i.d.), maintained at 45 ºC. The mobile phase A consisted of 0.05 M sodium sulphate buffer, pH 2.8, and the mobile phase B was acetonitrile, run isocratically at flow rate 0.3 mL/min. Cromatographic separation was obtained with retention time of 11.4 min, and was linear over the concentration range of 0.2-100 IU/mL (r2 = 0.9999) with photodiode array (PDA) detection at 214 nm. The limits of detection and quantitation were 0.04 and 0.16 IU/mL, respectively. Specificity was established in degradation studies, which also showed that there was no interference of the excipients. Equally, the accuracy was 100.31% with bias lower than 0.80%. The method was correlated with in vivo and in vitro bioassays. Moreover, the in vitro cytotoxicity test of related proteins and higher molecular weight forms showed significant differences (p <0.05) compared to intact molecule. The validated methods were applied for the determination of BTTA in biopharmaceutical-derived products, giving mean values of the estimated content/potencies 1.16% lower compared to the in vivo bioassay. It is concluded that represents a contribution to establish new alternatives to monitor stability, quality control and thereby assure efficacy of the biotechnology-derived product. / A toxina botulínica tipo A (BTTA) é um polipeptídio constituído de 1296 aminoácidos e é recomendada para patologias, como hiperhidrose e enxaqueca, mas é especialmente usada como cosmético. A toxina botulínica é produzida através do processo de fermentação bacteriana e após sucessivas etapas de purificação resulta em uma proteína com 150 kDa responsável pelo seu efeito biológico. No presente trabalho foi desenvolvido e validado método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) para a avaliação de potência de BTTA em formulações de produtos biofarmacêuticos. No método foi utilizada coluna Zorbax 300 SB C18 (150 mm x 4,6 mm d.i.), mantida a 45 ºC. A fase móvel A foi constituída por tampão sulfato de sódio 0,05 M, pH 2,8, e a fase móvel B por acetonitrila, eluídas em vazão isocrática de 0,3 mL/min. O método utilizou detector de arranjo de diodos (DAD) a 214 nm. A separação cromatográfica foi obtida em 11,4 min, sendo linear na faixa de concentração de 0,2-100 UI/mL (r2 = 0,9999). Os limites de detecção e quantificação foram 0,04 e 0,16 UI/mL, respectivamente. A especificidade foi avaliada em estudos de degradação, que também demonstraram que não houve interferência dos excipientes. A exatidão foi 100,31 com bias inferior a 0,80. O método validado foi correlacionado com bioensaios in vivo e in vitro. Além disso, realizou-se o teste de citotoxicidade in vitro das formas degradadas, as quais apresentaram diferença significativa em relação a forma intacta (p <0,05). O método proposto foi aplicado para avaliação da potência de BTTA em formulações biofarmacêuticas, e os resultados foram comparados com o bioensaio in vivo, observando-se diferença das médias de teor/potência de 1,16% inferior para o método cromatográfico. Contribuíu-se assim para estabelecer procedimentos que aprimoram a caracterização ou o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia do produto biotecnológico.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Erythropoietin is a sialoglycoprotein which promotes the increase of erythropoiesis. Clinically is used for the treatment of anaemia associated to chronic renal failure. Identification and separation of isoforms of recombinant human erythropoietin (rhEPO) in biopharmaceuticals of different origins, was carried out by isoelectric focusing (IEF) western blotting and, also by lectin binding with Triticum vulgaris, showing 4-7 isoforms distributed in the isoeletric range of 4.4 to 5.2. N-acetylneuraminic acid content was quantified by reversed-phase liquid chromatography method with fluorescence detection giving values higher than 108.74 ηg/μg. Biological activity was evaluated by the normocythaemic mice bioassay, and investigating the TF-1 cell line in vitro. The correlation of the results of both of the methods were significant, as calculated by the Pearson s coefficient (r = 0.9967). In addition, the content/potency of the biopharmaceutical products was assessed by validated reversed phase and size exclusion liquid chromatography methods, showing mean values 2.11% and 1.21% lower, respectively, related to the in vivo bioassay. Sample was degraded under UV light to generate deamidate/sulphoxide forms and treatment at 65ºC for 12 hours to produce dimeric and aggregated forms. The potencies were evaluated by the normocythaemic mice assay and the TF-1 cell culture assay giving mean reduction of 14.05% and 32.87%, respectively, related to the intact molecule. The alternative in vitro assay investigated in the context of the reduction or replacement of the animals, and the evaluation of the correlations between physicochemical and biological methods, represent improvements which can be applied to the production steps and for the quality control of rhEPO, contributing to ensure the batch-to-batch consistency of bulk and finished biological products. / A eritropoietina é uma sialoglicoproteína que promove o aumento da eritropoiese. Clinicamente é usada para o tratamento de anemias associadas à falência renal crônica. No presente realizou-se identificação e separação das isoformas de eritropoietina humana recombinante (rhEPO) em produtos biofarmacêuticos de diferentes origens, por focalização isoelétrica (IEF), seguida de imunodetecção, e também por ligação à lectina Triticum vulgaris, demonstrando a presença de 4 a 7 isoformas, distribuídas na faixa de ponto isoelétrico de 4,4 a 5,2. Quantificou-se o conteúdo de ácido N-acetilneuramínico por cromatografia líquida por fase-reversa e detecção por fluorescência obtendo teores acima de 108,74 ηg/μg. Avaliou-se a atividade biológica pelo bioensaio em camundongos normocitêmicos e pesquisou-se o ensaio alternativo baseado na cultura da linhagem celular TF-1 in vitro. Os resultados dos bioensaios apresentaram correlação significativa, conforme calculado pelo coeficiente de correlação de Pearson (r = 0,9967). Paralelamente, determinou-se o teor/potência dos produtos pelas metodologias validadas por cromatografia líquida por fase reversa e por exclusão molecular, que forneceram média de resultados 2,11% e 1,21% menores, respectivamente, em relação ao bioensaio in vivo. Submeteu-se amostra à degradação por luz UV para obter as formas desamidadas/oxidadas e tratamento a 65°C por 12 horas para as diméricas e agregadas. Efetuou-se a avaliação pelo bioensaio in vivo e in vitro, que apresentaram redução média de 14,05% e 32,87% respectivamente, em relação à molécula intacta. Desse modo, o ensaio biológico alternativo in vitro, pesquisado no contexto da redução ou substituição do uso de animais, e as avaliações de correlação entre métodos físico-químicos e biológicos, representam aprimoramentos aplicáveis para as etapas do processo de produção e para o controle de qualidade de rhEPO, contribuindo para garantir a consistência lote-a-lote da solução concentrada e dos produto biológicos acabados.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul - FAPERGS / The human parathyroid hormone (hPTH) is a polypeptide secreted by the parathyroid glands that is essential for the maintenance of the calcium ion homeostasis in the blood. The recombinant DNA technology has enabled the expression of hPTH gene in Escherichia coli, and thus the large-scale production of recombinant human parathyroid hormone (rhPTH 1-34), teriparatide, which contain the active amino-terminal fragment of the full length hPTH. The rhPTH is clinically used to treat osteoporosis at high risk of fractures in postmenopausal women, men with osteoporosis primary or hypogonadal and adults with glucocorticoid-induced osteoporosis (GIO). Cappilary zone electrophoresis (CZE) method was developed and validated for the assessment of rhPTH in biopharmaceutical formulations. The analysis for CZE method was performed on a fused-silica capillary (effective length, 40 cm; 50 μm i.d.), using electrolyte solution consisted of 50 mM dihydrogen phosphate solution at pH 3.0. The capillary was maintained at 25º C, the applied voltage was 20 kV. Injections were performed using a pressure mode at 50 mbar for 45 s, with detection by photodiode array detector set at 200 nm. Separation was obtained with a migration time of 5.3 min, and was linear over the concentration range of 0.25-250 μg mL-1 (r2 = 0.9992). The limits of detection and quantitation were 0.12 and 0.40 μg/mL, respectively. Specificity and stability-indicating capability were established in degradation studies, which also showed that there was no interference of the excipients. The accuracy was 100.28% with bias lower than 0.85%. Moreover, the in vitro cytotoxicity test of acidic, photolytic and thermal degradated forms showed significant differences (p<0.05) compared to intact molecule. The cell proliferation and alkaline phosphatase activity bioassays in UMR-106 cells were developed and applied to assess the biological activity of rhPTH in biopharmaceutical formulations The results of content/potency were correlated to those of the validated reversed-phase liquid chromatography (RP-LC), size-exclusion liquid chromatography (SE-LC) and CZE methods, showing significant correlation (p> 0.05) Thus, the application of the validated physico-chemical methods together with in vitro bioassays, was suggested to improve quality control of rhPTH biotechnology-derived product and to support studies of biosimilars. / O hormônio da paratireóide humano (hPTH) é um polipeptídeo produzido e secretado pelas glândulas paratireóides, e é fundamental para a manutenção da homeostase dos íons cálcio no sangue. A tecnologia do DNA recombinante possibilitou a expressão do gene do hPTH em Escherichia coli, e a produção em grande escala do hormônio da paratireóide humano recombinante (rhPTH 1-34), também denominado Teriparatida, o qual apresenta a sequência de aminoácidos responsável pela porção biologicamente ativa do paratôrmonio natural. O rhPTH é clinicamente indicado para o tratamento da osteoporose de alto risco de fraturas em mulheres pós-menopausa, de homens com osteoporose primária ou hipogonadal, e da osteoporose associada à terapia sistêmica com glicocorticóides. Neste trabalho foi desenvolvido e validado método por eletroforese capilar de zona (ECZ) para a avaliação de rhPTH em produtos biofarmacêuticos. No método por ECZ, utilizou-se capilar de sílica fundida (40 cm de comprimento efetivo x 50 μm d.i.) e solução eletrolítica composta de fosfato de sódio dihidrogenado 50 mM, pH 3,0. O capilar foi mantido a temperatura de 25ºC, e a tensão aplicada foi de 20 kV. O tempo de injeção foi de 45 s, com pressão de 50 mBar, e detecção por arranjo de diodos (DAD), em 200 nm. A separação eletroforética foi obtida com tempo de migração de 5,3 min, sendo linear na faixa de concentração de 0,25-250 μg/mL (r2 = 0,9992). Os limites de detecção e quantificação foram de 0,12 e 0,40 μg/mL, respectivamente. A especificidade foi avaliada através de análises com os excipientes da formulação biofarmacêutica e estudos de degradação, demonstrando a seletividade do método. A exatidão foi 100,28% com bias inferior a 0,85%. Além disso, realizou-se o teste de citotoxicidade in vitro das formas degradadas, apresentando, para as amostras submetidas às condições ácida, fotolítica e térmica, diferença significativa (p< 0,05) em relação à molécula íntegra. Os bioensaios de proliferação celular e da atividade da fosfatase alcalina em células UMR-106 foram desenvolvidos e aplicados para avaliação da atividade biológica de rhPTH em formulações biofarmacêuticas. Os resultados de teor/potência foram correlacionados com os métodos já validados por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR), cromatografia líquida por exclusão molecular (CL-EM) e ECZ, apresentando correlação significativa (p> 0,05). Assim, sugere-se que o métodos físico-químicos validados sejam aplicados paralelamente aos bioensaios in vitro para aprimorar o controle da qualidade do produto biotecnológico de rhPTH, e para avaliação da biossimilaridade de rhPTH.