Master of Science / Department of Biological & Agricultural Engineering / Donghai Wang / Bioprocessing is widely involved in our daily life and significantly relative to the general public because bio-products are widely used in eating, clothing, and living as well as transportation. Due to the public concern of the environmental deterioration, limited fossil fuel resources, and energy price volatility, biofuel as a clean, safe and sustainable energy needs to be developed in response to this growing concern. Sorghum, an important dryland crop, represents a renewable resource currently grown on 8 million acres throughout the United States. Due to climate variability and the continuous decline of water resources, utilization of dryland to grow sorghum and forage sorghum is critically important in order to ensure available energy resources and sustainable economic development. The objectives of this research were 1) to study the impact of deficit irrigation strategies on sorghum grain attributes and bioethanol production, and 2) to evaluate the potential fermentable sugar yield of pedigreed sorghum mutants. Results showed that average kernel weight and test weight of grain sorghum increased as irrigation capacity increased, whereas kernel hardness index decreased as irrigation capacity increased. Starch content increased as irrigation level increased and protein contents decreased as irrigation level increased. Irrigation also had a significant effect on starch properties and bioethanol yield. Sorghum mutants had a significant effect on chemical composition and physical properties such as glucan content, glucan mass yield, ash content, and high heating value, and also had a significant effect on fermentable sugars yield and enzymatic conversion efficiency.

Le bioéthanol 2G est une alternative viable aux carburants d'origine fossile et de nombreux projets industriels travaillent aujourd'hui à sa mise au point. Il est produit par fermentation des sucres contenus dans la biomasse lignocellulosique (résidus forestiers, résidus agricoles, cultures dédiées…). Ces sucres sont extraits de la biomasse lors d'une étape d'hydrolyse enzymatique, qui fait actuellement partie des points importants à optimiser pour rendre le procédé plus compétitif.L'objectif de cette thèse était de mieux définir les mécanismes mis en jeu lors de l'hydrolyse enzymatique de la lignocellulose afin d'élaborer un modèle prédictif des principaux phénomènes impliqués. Une étude expérimentale menée sur une cellulose de référence (cellulose Avicel) et sur une paille de blé prétraitée par explosion à la vapeur a permis de mieux cerner la réactivité des substrats lignocellulosiques. Les données obtenues ont apporté un nouvel éclairage sur les phénomènes d'adsorption et la perte de vitesse d'hydrolyse au cours du temps. Un focus particulier a été fait sur le rôle de la présence de lignine et sur la modification de la morphologie du substrat au cours de la réaction. Il a ainsi été montré que dans nos conditions, la lignine n'impactait pas la réactivité de la paille de blé explosée vapeur.L'ensemble de ces résultats a été exploité pour développer un modèle cinétique prédictif de l'hydrolyse. Ce modèle distingue l'action des principales enzymes utilisées pour l'hydrolyse (cellobiohydrolases, endoglucanases, β-glucosidases), prend en compte les phénomènes d'inhibition et de synergie entre ces enzymes et s'attache à décrire l'évolution de la morphologie de la cellulose. Il permet de prévoir l'évolution au cours de l'hydrolyse d'un certain nombre de paramètres (degré de polymérisation, surface, enzymes libres) et d'estimer l'effet d'un changement de ratio entre les enzymes du cocktail. Il a été validé sur cellulose Avicel mais doit encore être étendu à des substrats plus complexes comme la paille explosée vapeur. / Many industrial projects are working on 2nd generation bioethanol, which is an promising alternative to fossil biofuels. To achieve its production, lignocellulosic biomass is first pretreated to increase the accessibility of the cellulosic fraction and further hydrolyzed by cellulolytic enzymes to convert cellulose into glucose. Glucose is then converted into ethanol during a fermentation step performed by yeast. In this production scheme, enzymatic hydrolysis is one of the key bottlenecks and should be improved to make the process economically viable.The objective of this PhD thesis was to better understand the mechanisms involved in enzymatic hydrolysis of lignocellulose in order to integrate the main descriptors into a detailed kinetic model. An experimental study was carried on cellulose (Avicel) and steam exploded wheat straw. Enzymes adsorption, decrease of hydrolysis rate, role of lignin and morphology modification of the substrate during hydrolysis were studied. It allowed a better understanding of the parameters that impact the enzymatic hydrolysis.These results were used to develop a kinetic model of the enzymatic hydrolysis. The distinct actions of the main enzymes involved in hydrolysis (cellobiohydrolases, endoglucanases and β-glucosidases) were detailed. The synergy and inhibition phenomena and the evolution of the morphology of the cellulosic substrate were also integrated. This model predicts the evolution of different parameters during reaction time (polymerization degree, enzymes adsorbed, surface area) and the impact of the enzymes ratio on the efficiency of the cocktail. The model was validated on Avicel cellulose but still has to be extended to more complex substrates such as steam exploded wheat straw.

Submitted by WELLINGTON PINE OMORI null (wpomori@hotmail.com) on 2018-03-02T14:43:37Z No. of bitstreams: 1 Tese_Wellington_Pine_Omori.pdf: 3601697 bytes, checksum: 300108bd7832f7e80a842293e639462a (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-03-05T18:02:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 omori_wp_dr_jabo.pdf: 3601697 bytes, checksum: 300108bd7832f7e80a842293e639462a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-05T18:02:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 omori_wp_dr_jabo.pdf: 3601697 bytes, checksum: 300108bd7832f7e80a842293e639462a (MD5) Previous issue date: 2018-02-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A torta de filtro apresenta bagaço residual oriundo do processo de extração do caldo de cana-de-açúcar e quando armazenada por longos períodos, se torna um habitat ideal para o desenvolvimento de comunidades microbianas que atuam na desconstrução da lignocelulose. Nossas análises de dados de sequenciamento de DNA metagenômico sugerem que a torta de filtro armazenada por 40 dias possui uma microbiota com características funcionais e ecológicas exclusivas em relação a outros ambientes com elevada disposição de material lignocelulósico. Assim como em ambientes de compostagem, os filos mais abundantes são Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes e Bacteroidetes. Dentre os principais genes que estes micro-organismos possuem, estão Glicosiltransferases, Carboidrato Esterases e Glicosil Hidrolases, que atuando em conjunto, são passíveis de desconstruírem a lignocelulose e participarem na liberação de açúcares menores, ácidos orgânicos e outros nutrientes. Neste trabalho, identificamos novas enzimas da família AA10 que oxidam a celulose cristalina, demostrando o potencial deste ambiente em possibilitar a adaptação de micro-organismos que expressam enzimas capazes de desestruturar a celulose altamente condensada, possibilitando a liberação de moléculas de glicose. A comunidade microbiana pode acessar nutrientes como Fósforo e Nitrogênio através da despolimerização da biomassa vegetal ou decomposição da microbiota morta. No ciclo biogeoquímico do nitrogênio, a evaporação de amônia é reduzida pela assimilação desta substância pela comunidade microbiana, sendo que a amônia é produzida pela via de amonificação de nitrato e nitrito. Outro ciclo biogeoquímico identificado na torta de filtro foi o do carbono, ocorrendo diminuição da emissão de metano e gás carbônico devido ao uso destas moléculas no metabolismo microbiano. Por apresentar muitas espécies de micro-organismos termofílicos e funções ecológicas similares a compostagens que alcançaram fase termofílica, a torta de filtro armazenada por 40 dias não aparenta conter micro-organismos patogênicos em elevada abundância, o que poderia ser um indício de sua segurança biológica se usado como adubo no solo. No entanto, recomenda-se que novos estudos sejam realizados neste tipo de ambiente agrícola, afim de avaliar como se comportam principalmente os fungos Neosartorya fumigata e Paracoccidioides brasiliensis, os quais são identificados como agentes patogênicos mas que também são encontrados vivendo na natureza como organismos saprofíticos e em interação com alguns mamíferos, sem causar doença. / The filter cake presents residual bagasse from the process of extracting the sugarcane juice and when stored for long periods, it becomes an ideal habitat for the development of microbial communities that act in the deconstruction of lignocellulose. Our analyzes of metagenomic DNA sequencing data suggest that the filter cake stored for 40 days has a microbiota with unique functional and ecological characteristics compared to other environments with high lignocellulosic material. Thus in composting environments, the most abundant phyla are Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes, and Bacteroidetes. Glycosyltransferases, Carbohydrate Estersases and Glycoside Hydrolases, which act together, are capable of deconstructing lignocellulose and participate in the release of smaller sugars, organic acids and other nutrients. In this work, we identify new enzymes of the AA10 family that oxidize crystalline cellulose, demonstrating the potential of this environment to enable the adaptation of microorganisms that express enzymes capable of destabilizing highly condensed cellulose, allowing the release of glucose molecules. The microbial community can access nutrients such as Phosphorus and Nitrogen through the depolymerization of the plant biomass or decomposition of the dead microbiota. In the biogeochemical cycle of nitrogen, the evaporation of ammonia is reduced by the assimilation of this substance by the microbial community, and ammonia is produced by ammonification of nitrate and nitrite. Another biogeochemical cycle identified in the filter cake was that of carbon, with a decrease in the emission of methane and carbon dioxide due to the use of these molecules in microbial metabolism. Because it contains many species of thermophilic microorganisms and ecological functions similar to composting that reached the thermophilic phase, the filter cake stored for 40 days does not appear to contain pathogenic microorganisms in high abundance, which could be an indication of its biological safety if used as soil fertilizer. However, it is recommended that new studies be carried out in this type of agricultural environment, in order to evaluate the behavior of the fungi Neosartorya fumigata and Paracoccidioides brasiliensis, which are identified as pathogens but are also found living in nature as saprophytic organisms and in interaction with some mammals, without causing disease.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RoberioMN.pdf: 839058 bytes, checksum: 1087756ecda3734e7aef07c3e72cb26c (MD5) Previous issue date: 2008-02-27 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / ?-D-glucosidase (EC 3.2.1.21) is one of the most interesting glycosidases, especially for hydrolysis cellobiose releasing glucose, is last step degradation of cellulose. This function makes the ?-D-glucosidase is of great interest as a versatile industrial biocatalyst, being critical to various bio-treatment / biorefinery processes, such as bioethanol production. Hen in the report, a ?-D-glucosidase was extracts from protein extracted of the invertebrate marine Artemia franciscana was purified and characterized with a combination of precipitation with ammonium sulfate (0 - 30%, 30 to 50%, 50 to 80%), the fraction saturated in the range of 30 to 50% (called F-II) was applied in a molecular exclusion chromatography, in Sephacryl S-200, the fractions corresponding to the first peak of activity of ?-D-glucosidase were gathered and applied in a chromatography of ion exchange in Mono Q; the third peak this protein obtained chromatography, which coincides with the peak of activity of ?-D-glucosidase was held and applied in a gel filtration chromatography Superose 12 where the first peak protein, which has activity of ?-D-glucosidase was rechromatography on Superose 12. This enzyme is probably multimerica, consisting of three subunit molecular mass of 52.7 kDa (determined by SDS-PAGE) with native molecular mass of 157 kDa (determined by gel filtration chromatography on Superose 12 under the system FPLC). The enzyme was purified 44.09 times with a recovery of 1.01%. Using up p-nitrophenyl-?-D-glucopiranoside as substrate obtained a Km apparent of 0.229 mM and a Vmax of 1.109 mM.60min-1.mL-1mM. The optimum pH and optimum temperature of catalysis of the synthetic substrate were 5.0 and 45 ?C, respectively. The activity of the ?-D-glucosidase was strongly, inhibited by silver nitrate and N- etylmaleimide, this inhibition indicates the involvement of radical sulfidrila the hydrolysis of synthetic substrate. The ?-D-glucosidase of Artemia franciscana presented degradativa action on celobiose, lactose and on the synthetic substrate ?-nitrophenyl-?-D-glucopiranoside indicating potential use of this enzyme in the industry mainly for the production of bioethanol (production of alcohol from the participating cellulose), and production hydrolysate milk (devoid of milk lactose) / ?-D-glicosidase (EC 3.2.1.21) ? uma das mais interessantes glicosidases, especialmente por hidrolisar celobiose liberando glicose, ?ltimo passo de degrada??o de celulose. Esta fun??o faz com que a ?-D-glicosidase seja de grande interesse como um vers?til biocatalizador industrial, sendo critica para v?rios processos de bio-tratamento / biorrefinaria, como produ??o de bioetanol. Neste trabalho, uma ?-D-glicosidase extra?da de extratos prot?icos do invertebrado marinho Artemia franciscana foi purificada e caracterizada com uma combina??o de precipita??o com sulfato de am?nio (30; 50; 80%), a fra??o saturada na faixa de 50% (chamada F-II) foi aplicada em uma cromatografia de exclus?o molecular em Sephacryl S-200, as fra??es correspondentes ao primeiro pico de atividade da ?-D-glicosidase foram reunidas e aplicadas numa cromatografia de troca i?nica em Mono Q; o terceiro pico prot?ico obtido nessa cromatografia, o qual coincide com o pico de atividade da ?-D-glicosidase, foi reunido e aplicado numa cromatografia gel filtra??o Superose 12 onde o primeiro pico prot?ico, o qual possui atividade da ?-D-glicosidase, foi recromatografado em Superose 12. Esta enzima provavelmente ? multimerica, constitu?da por tr?s subunidades, de massa molecular de 52,7 kDa (determinado por SDS-PAGE) e com massa molecular nativa de 157 kDa (determinado por cromatografia gel filtra??o em Superose 12 sob o sistema FPLC). A enzima foi purificada 44,09 vezes com uma recupera??o de 1,01%. Utilizando-se ?-nitrofenil-?-D-glicopiranos?deo como substrato obtivemos uma Km aparente de 0,229 mM (12,7 ?M de produto/cm/hora) e Vm?x de 1,109 mM.60min-1.mL-1. O pH ?timo e a temperatura ?tima de cat?lise do substrato sint?tico foram 5,0 e 45?C, respectivamente. A atividade ?-D-glicosid?sica foi fortemente inibida por nitrato de prata e N-etilmaleimida, esta inibi??o indica o envolvimento de radicais sulfidrila na hidr?lise do substrato sint?tico. A ?-D-glicosidase de Artemia franciscana apresentou a??o degradativa sobre celobiose, lactose e sobre o substrato sint?tico ?-nitrofenil-?-D-glicopiranos?deo, indicando potencial uso desta enzima na ind?stria principalmente para produ??o de bioetanol (produ??o de ?lcool a parti de celulose) e produ??o de leite hidrolisado (leite destitu?do de lactose)

Os resíduos lignocelulósicos agroindustriais, como a casca de arroz e a casca de soja, são fontes abundantes e de baixo custo na produção biotecnológica de compostos de alto valor agregado como etanol e xilitol, por figurarem como fontes de celulose e hemicelulose. No presente trabalho será estudada a capacidade de conversão dos açúcares provenientes destes resíduos por diferentes leveduras ampliando os conhecimentos sobre a produção biotecnológica de alcoóis. A capacidade de Candida shehatae, Saccharomyces cerevisiae, e a co-cultura destas duas leveduras na conversão do açúcar presente no hidrolisado de casca de arroz (RHH) utilizado como substrato para a produção de etanol foi estudada. Em experimentos em agitador orbital, as co-culturas dessas leveduras apresentaram rendimentos de etanol (YP/S) de 0,42 e 0,51 em meio sintético simulando a composição do hidrolisado e em RHH, respectivamente. Ao analisar a produção de etanol com culturas puras de C. shehatae o rendimento de etanol foi ligeiramente inferior (0,40). Visando analisar o metabolismo das leveduras sob condições de anaerobiose e de limitação de oxigênio, foram realizados experimentos em biorreatores, onde a utilização de co-culturas produziu rendimentos de etanol similares em ambas condições (0,50-0,51) em meio sintético, enquanto que em RHH, rendimentos de 0,48 e 0,44 foram obtidos, respectivamente. Novas estratégias de produção de etanol a partir de hidrolisado de casca de arroz também foram testadas, como a sacarificação e co-fermentação simultânea por S. cerevisiae, Spathaspora arborariae e pela combinação destas leveduras. Nas culturas sob limitação de oxigênio, S. cerevisiae foi capaz de metabolizar a glicose presente RHH, resultando em um rendimento de etanol (YP/S) de 0,45. A co-cultura de S. cerevisiae e S. arborariae foi capaz de metabolizar pentoses e hexoses presentes em RHH, obtendo YP/S de 0,48 g g -1 e rendimento de xilitol (YX/X ) de 0,39 g g -1 e com o uso de sacarificação e co-fermentação simultânea produziu-se 14,5 e 3 g L-1 de etanol e xilitol, respectivamente. No hidrolisado de casca de soja (SHH), testou-se a capacidade das celulases provenientes do fungo Penicillium echinulatum S1M29, em aumentar a quantidade de açúcares no meio de hidrolisado. O rendimento de sacarificação foi de 72 %, quando foi utilizado 15 FPU g-1 de matéria seca, incubado num agitador orbital a 120 rpm, 50 ºC durante 96 h. Após a sacarificação, a capacidade das células imobilizadas de S. cerevisiae, C. shehatae, S. arborariae, ou a combinação de C. shehatae, S. arborariae com S. cerevisiae, para a conversão de açúcares presentes em SHH como substrato para a produção de etanol foi estudada. Os melhores coeficientes de rendimento de etanol (YP/S) foram de 0,45, 0,47 e 0,38, utilizando culturas puras de S. cerevisiae, C. shehatae, e S. arborariae respectivamente, e YP/S de 0,48 e 0,40 g g -1, para co-culturas de S. cerevisiae e C. shehatae ou S. arborariae, respectivamente. As leveduras com os melhores rendimentos de etanol (S. cerevisiae e C. shehatae) tiveram seu metabolismo testado em biorreatores imobilizados. Estas culturas em biorreatores produziram um rendimento do etanol de 0,49, para S. cerevisiae e 0,41 g g -1 usando C. shehatae. Visando a melhora do processo de fermentação do hidrolisado de casca de soja (HCS), realizaram-se experimentos estatísticos (Plackett-Burman e CCD), para diferentes condições operacionais e formulações do meio. Com o Plackett-Burman testou-se os efeitos da suplementação com quatro nutrientes (peptona, extrato de levedura, milhocina e Tween 80). Através do planejamento fatorial composto central (CCD) com quatro repetições no ponto central e seis pontos axiais, analisou-se os efeitos das condições de fermentação (temperatura, pH e tamanho do inóculo) para a produção de etanol por C . guilliermondii. Os resultados demonstraram que nenhuma suplementação do meio foi necessária, sendo C. guilliermondii capaz de crescer em hidrolisado não-suplementado e não-desintoxicado. As melhores condições de cultura foram determinadas pelo CCD como sendo de 28 °C, pH 5.0, e 109 UFC ml-1 de tamanho do inóculo, respectivamente. O coeficiente de produtividade de etanol atingiu um máximo de 1,4 g L-1 h-1 cerca de 80 % do rendimento teórico esperado, resultando em um coeficiente de rendimento de etanol (YP/S) de 0,41 g g-1. / The lignocellulosic agroindustrial residues such as rice hull and soybean hull are abundant and inexpensive wastes and can be used in biotechnological production of high value-added compounds such as ethanol and xylitol, like sources of cellulose and hemicellulose. In this paper was tested the ability of converting sugars from these wastes by different yeasts, using the knowledge about the biotechnological production of alcohols. The ability of Candida shehatae, Saccharomyces cerevisiae, or the combination of these two yeasts in converting the mixed sugar composition of rice hull hydrolysate (RHH) as substrate for ethanol production is presented. In shake flask experiments, co-cultures showed ethanol yields (YP/S) of 0.42 and 0.51 in synthetic medium simulating the sugar composition of RHH and in RHH, respectively, with both glucose and xylose being completely depleted, while pure cultures of C. shehatae produced slightly lower ethanol yields (0.40). Experiments were scaled-up to bioreactors, in which anaerobiosis and oxygen limitation conditions were tested. Bioreactor co-cultures produced similar ethanol yields in both conditions (0.50-0.51) in synthetic medium, while in RHH, yields of 0.48 and 0.44 were obtained, respectively. New technologies to produce ethanol from RHH were tested, with the simultaneous saccharification and co-fermentation by S. cerevisiae, Spathaspora arborariae and the combination of these yeasts. In bioreactor cultures under oxygen limitation, S. cerevisiae was capable of metabolizing glucose from RHH, which contained small amounts of acetic acid, furfural, and hydroxymethylfurfural, achieving ethanol yields of 0.45. In the co-culture of S. cerevisiae and S. arborariae pentoses and hexoses from RHH, were converted to ethanol and xylitol, with yields of 0.48 and 0.39, and using simultaneous saccharification and co-fermentation with both yeasts produced ethanol and xylitol to final concentrations of 14.5 g L-1 and 3 g L-1, respectively. In soybean hull hydrolysate (SHH), was studied the ability of cellulase from Penicillium echinulatum S1M29, to increase the amount of sugars in the hydrolysate medium. The saccharification yield was 72 % using 15 FPU g-1 dry matter on orbital shaker at 120 rpm, 50 °C for 96 h. After saccharification, the ability of immobilized cells of S. cerevisiae, C. shehatae, S. arborariae, or a combination of C. shehatae, S. arborariae with S. cerevisiae for the conversion of sugars present in SHH as a substrate for ethanol production was studied. In shaker cultivations, the bioconversion of SHH into ethanol showed yields (YP/S) of 0.43, 0.47, and 0.38, in cultures of S. cerevisiae, C. shehatae, and S.arborariae, respectively. Co-cultures of S. cerevisiae and C. shehatae or S. cerevisiae and S. arborariae, produced YP/S of 0.48 and 0.40, respectively. S. cerevisiae and C.shehatae were immobilized in Ca-alginate and cultivated in bioreactors to analyse the possibility of scaling up this process. Immobilized-cell cultures showed yields of 0.45 and 0.38, respectively. Aiming to improve the fermentation of soybean hull hydrolysate (HCS), operational conditions and medium formulation were optimized using statistical experimental designs (Plackett-Burman and CCD). Plackett-Burman was used to analysate the effects of supplementation with four nutrients (peptone, yeast extract, corn steep liquor and Tween 80). Using factorial central composite design (CCD) with four replications at the center point and six axial points, was examined the effects of fermentation conditions (temperature, pH, and inoculum size) for ethanol production by Candida guilliermondii BL13. Results showed that C. guilliermondii was capable of growing in non-supplemented, non-detoxified hydrolysate, and the best culture conditions were determined to be 28 °C, pH 5.0, and 109 CFU mL-1 inoculum size, respectively. Ethanol productivity peaked at 1.4 g L-1 h-1 and yields of 0.41 g g-1, about 80 % of expected theoretical yields, were observed.

O uso de resíduos agrícolas como fonte de carbono para a geração de energia renovável parece uma solução promissora para reduzir nossa dependência em combustíveis fósseis. Na natureza, como na compostagem, comunidades microbianas formam redes metabólicas complexas que degradam eficientemente a biomassa disponível através de um conjunto de enzimas sinérgicas. Entretanto, a desconstrução da lignocelulose continua uma desafio para a indústria devido a natureza recalcitrante do substrato e a baixa atividade das enzimas, aumentando o preço do biocombustível produzido. Estudos de metagenômica e metatranscriptômica de comunidades microbianas complexas tornam possível acessar as funções metabólicas empregadas por consórcios lignocelulolíticos e revelar novos biocatalisadores que podem melhorar a conversão industrial da lignocelulose. Aqui, através de uma abordagem metagenômica, foi examinada a diversidade de microrganismos obtidos em condições laboratoriais quando um meio definido ou um complexo foi usado no seu crescimento. Em seguida, a comunidade microbiana derivada de compostagem foi crescida em meio mínimo com bagaço de cana-de-açúcar como única fonte de carbono. A degradação do substrato foi monitorada e o metatranscriptoma da cultura resultante foi sequenciado, seguido pela seleção e caracterização funcional de vários alvos. Durante as cinco semanas de estudo, a comunidade microbiana crescida em meio mínimo mostrou maior diversidade e enriquecimento em microrganismos capazes de degradar a lignocelulose do que a comunidade microbiana crescida no meio complexo. A partir do metatranscriptoma foi descoberta a primeira hidrolase de glicosídeo da família 11 com atividade exoxilanase (C21). A estrutura cristalográfica da C21, refinada à 1,76 Å, revelou que a atividade exoxilanase observada se deve a presença de duas alças que não estão presentes nas demais estruturas dos membros da família 11 de hidrolase de glicosídeo depositadas até então. A adição da C21 a um coquetel comercial provocou um aumento na velocidade de hidrólise do Avicel quando na presença de xilooligômeros. As análises metagenômica e metatranscriptômica da comunidade microbiana proveniente da compostagem revelaram que o uso de um meio definido pode deslocar espécies generalistas, levando a uma fonte enriquecida para explorar enzimas com aplicação biotecnológica. Também demonstrou a diversidade de mecanismos envolvidos na degradação in situ da lignocelulose. / Using of the globally abundant crop residues as carbon source for energy generation seems a promising solution to reduce our dependency on fossil fuels. In nature, such as in compost habitats, microbial communities create complex metabolic networks that efficiently degrade the available plant biomass using a set of synergistic enzymes. However, deconstruction of lignocellulose remains a challenge for industry due to recalcitrant nature of the substrate and enzymes low activity, raising the price of the produced biofuel. Metagenomics and metatranscriptomics studies on complex microbial communities can assess the metabolic functions employed by the lignocellulolytic consortia and unveil novel biocatalysts that could improve industrial lignocellulose conversion. Here, using 16S rRNA amplicon metagenomic approach, we examined the diversity of microorganisms obtained in the laboratory setting when a nutrient-limited or nutrient-rich media are used. Then, a microbial community derived from compost was grown in minimal medium with sugarcane bagasse as a sole carbon source. The substrate degradation was monitored and the metatranscriptome from the resulting cultures was sequenced; several target genes were selected and functional characterized. During a five-week time course, the microbial community grown in minimal medium showed greater diversity and enrichment in lignocellulose-degrading microorganisms than the one grown in nutrient rich medium. Metatranscriptomics analysis revealed the first glycoside hydrolase from family 11 with exo-xylanase activity (C21). C21 crystal structure, refined at 1.76 Å, explained the molecular basis of exo-xylanase activity due to two extra loops previously unseen in the other reported structures from members from glycoside hydrolase family 11. A supplementation of commercial enzyme mix with C21 showed improvement in Avicel hydrolysis in the presence of inhibitory xylooligomers. The combination of metagenomic and metatranscriptomic analysis of compost-derived microbial community showed that nutrient-limited medium may displace bacterial generalist species, leading to an enriched source for mining novel enzymes for biotechnology applications. It also unveiled a diversity of mechanisms involved in lignocellulose degradation in situ.

Atualmente, o aumento da preocupação com a sustentabilidade ambiental, alinhado às perspectivas de esgotamento das reservas de petróleo, tem direcionado às buscas por fontes renováveis de energia. O emprego de resíduos agroindustriais, principalmente de usinas sucroalcooleiras destaca-se como sendo uma alternativa para a produção de etanol de segunda geração. Dentre as metodologias aplicadas para disponibilização dos açúcares fermentescíveis está a hidrólise enzimática. Ainda, para facilitar esta etapa e torná-la mais acessível, submete-se, previamente, o material lignocelulósico a um pré-tratamento, com o objetivo de contribuir com a susceptibilidade da celulose a ataques enzimáticos. No entanto, devido à complexidade das estruturas lignocelulósicas, os processos de hidrólise e pré-tratamento precisam se tornar mais eficientes e economicamente viáveis. Desta forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar e caracterizar os pré-tratamentos hidrotérmico e organossolve (etanol 50%), isoladamente, e estes combinados em diferentes condições, assim como a influência destes procedimentos na estrutura e composição da biomassa, bem como na hidrólise enzimática. Os resultados demonstraram que os pré-tratamentos hidrotérmicos a 160 ºC nas condições analisadas foram pouco efetivos na melhora do acesso enzimático durante a etapa de hidrólise, pois atuaram de maneira branda na parede celular, pouco solubilizando a hemicelulose e lignina, conforme as análises físicas comprovaram. Os tratamentos combinados hidrotérmico 30 min e 60 min a 160 ºC seguidos pelo organossolve por 150 min apresentaram semelhança morfológica e alta solublização da lignina e hemicelulose, justificando os valores de hidrólise. Nossos resultados abrem perspectivas de novos estudos que visam a otimização dos pré-tratamentos hidrotérmicos e organossolve, além da compreensão das alterações composicionais e morfológicas que levam à melhoria da hidrólise enzimática na biomassa lignocelulósica. / The concerns with environmental sustainability and perspectives of petroleum reserves depletion motivated exploration of new and sustainable energy sources. In this context, renewable energies start to receive significant attention in the world´s energy matrix, with biofuels playing a special role. The use of agro-industrial residues, mainly from the sugarcane industry, stands out as a viable alternative for the production of second-generation ethanol. The enzymatic hydrolysis of the biomass has a number of advantages for polysaccharides depolimerization, such as high substrate specificity, low environmental impact and lack of corrosion issues. To further facilitate this procedure and to make biomass more accessible, the lignocellulosic material has to be previously submitted to a pretreatment in order to increase the cellulose accessibility and susceptibility to the enzymatic action. This process aims at the disorganization of the chemical structure of the lignocellulosic matter, facilitating the further steps of hydrolysis and fermentation. Due to the complexity of the lignocelluloses structures, their pretreatment and hydrolysis processes have to become more efficient and economically viable to be efficiently applied at an industrial scale. Therefore, the objective of this work is to evaluate the hydrothermal and organosolv (50% ethanol) pretreatments, separately and combined in different conditions, and the influence of these procedures on the structure and composition of the biomass and on the efficiency of enzymatic hydrolyses. Our results demonstrated that the hydrothermal pretreatments at 160ºC within the analyzed reaction conditions had minor effects on improving the enzymatic efficiency, being not harsh enough to introduce significant modifications of the cell wall composition and structure, as demonstrated by our physical and chemical analyses. The combined hydrothermal treatments lasting 30 min and 60 min at 160ºC followed by the organosolv step for 150 min resulted in significant morphological changes and high lignin and hemicelluloses solubilization, resulting in an efficient enzymatic hydrolysis. Our results open perspectives of further studies aimed at optimization of hydrothermal and organosolv pretreatments and comprehension of compositional and morphological changes which lead to improved enzymatic hydrolysis of the lignocelulosic biomass.

Os resíduos lignocelulósicos agroindustriais, como a casca de arroz e a casca de soja, são fontes abundantes e de baixo custo na produção biotecnológica de compostos de alto valor agregado como etanol e xilitol, por figurarem como fontes de celulose e hemicelulose. No presente trabalho será estudada a capacidade de conversão dos açúcares provenientes destes resíduos por diferentes leveduras ampliando os conhecimentos sobre a produção biotecnológica de alcoóis. A capacidade de Candida shehatae, Saccharomyces cerevisiae, e a co-cultura destas duas leveduras na conversão do açúcar presente no hidrolisado de casca de arroz (RHH) utilizado como substrato para a produção de etanol foi estudada. Em experimentos em agitador orbital, as co-culturas dessas leveduras apresentaram rendimentos de etanol (YP/S) de 0,42 e 0,51 em meio sintético simulando a composição do hidrolisado e em RHH, respectivamente. Ao analisar a produção de etanol com culturas puras de C. shehatae o rendimento de etanol foi ligeiramente inferior (0,40). Visando analisar o metabolismo das leveduras sob condições de anaerobiose e de limitação de oxigênio, foram realizados experimentos em biorreatores, onde a utilização de co-culturas produziu rendimentos de etanol similares em ambas condições (0,50-0,51) em meio sintético, enquanto que em RHH, rendimentos de 0,48 e 0,44 foram obtidos, respectivamente. Novas estratégias de produção de etanol a partir de hidrolisado de casca de arroz também foram testadas, como a sacarificação e co-fermentação simultânea por S. cerevisiae, Spathaspora arborariae e pela combinação destas leveduras. Nas culturas sob limitação de oxigênio, S. cerevisiae foi capaz de metabolizar a glicose presente RHH, resultando em um rendimento de etanol (YP/S) de 0,45. A co-cultura de S. cerevisiae e S. arborariae foi capaz de metabolizar pentoses e hexoses presentes em RHH, obtendo YP/S de 0,48 g g -1 e rendimento de xilitol (YX/X ) de 0,39 g g -1 e com o uso de sacarificação e co-fermentação simultânea produziu-se 14,5 e 3 g L-1 de etanol e xilitol, respectivamente. No hidrolisado de casca de soja (SHH), testou-se a capacidade das celulases provenientes do fungo Penicillium echinulatum S1M29, em aumentar a quantidade de açúcares no meio de hidrolisado. O rendimento de sacarificação foi de 72 %, quando foi utilizado 15 FPU g-1 de matéria seca, incubado num agitador orbital a 120 rpm, 50 ºC durante 96 h. Após a sacarificação, a capacidade das células imobilizadas de S. cerevisiae, C. shehatae, S. arborariae, ou a combinação de C. shehatae, S. arborariae com S. cerevisiae, para a conversão de açúcares presentes em SHH como substrato para a produção de etanol foi estudada. Os melhores coeficientes de rendimento de etanol (YP/S) foram de 0,45, 0,47 e 0,38, utilizando culturas puras de S. cerevisiae, C. shehatae, e S. arborariae respectivamente, e YP/S de 0,48 e 0,40 g g -1, para co-culturas de S. cerevisiae e C. shehatae ou S. arborariae, respectivamente. As leveduras com os melhores rendimentos de etanol (S. cerevisiae e C. shehatae) tiveram seu metabolismo testado em biorreatores imobilizados. Estas culturas em biorreatores produziram um rendimento do etanol de 0,49, para S. cerevisiae e 0,41 g g -1 usando C. shehatae. Visando a melhora do processo de fermentação do hidrolisado de casca de soja (HCS), realizaram-se experimentos estatísticos (Plackett-Burman e CCD), para diferentes condições operacionais e formulações do meio. Com o Plackett-Burman testou-se os efeitos da suplementação com quatro nutrientes (peptona, extrato de levedura, milhocina e Tween 80). Através do planejamento fatorial composto central (CCD) com quatro repetições no ponto central e seis pontos axiais, analisou-se os efeitos das condições de fermentação (temperatura, pH e tamanho do inóculo) para a produção de etanol por C . guilliermondii. Os resultados demonstraram que nenhuma suplementação do meio foi necessária, sendo C. guilliermondii capaz de crescer em hidrolisado não-suplementado e não-desintoxicado. As melhores condições de cultura foram determinadas pelo CCD como sendo de 28 °C, pH 5.0, e 109 UFC ml-1 de tamanho do inóculo, respectivamente. O coeficiente de produtividade de etanol atingiu um máximo de 1,4 g L-1 h-1 cerca de 80 % do rendimento teórico esperado, resultando em um coeficiente de rendimento de etanol (YP/S) de 0,41 g g-1. / The lignocellulosic agroindustrial residues such as rice hull and soybean hull are abundant and inexpensive wastes and can be used in biotechnological production of high value-added compounds such as ethanol and xylitol, like sources of cellulose and hemicellulose. In this paper was tested the ability of converting sugars from these wastes by different yeasts, using the knowledge about the biotechnological production of alcohols. The ability of Candida shehatae, Saccharomyces cerevisiae, or the combination of these two yeasts in converting the mixed sugar composition of rice hull hydrolysate (RHH) as substrate for ethanol production is presented. In shake flask experiments, co-cultures showed ethanol yields (YP/S) of 0.42 and 0.51 in synthetic medium simulating the sugar composition of RHH and in RHH, respectively, with both glucose and xylose being completely depleted, while pure cultures of C. shehatae produced slightly lower ethanol yields (0.40). Experiments were scaled-up to bioreactors, in which anaerobiosis and oxygen limitation conditions were tested. Bioreactor co-cultures produced similar ethanol yields in both conditions (0.50-0.51) in synthetic medium, while in RHH, yields of 0.48 and 0.44 were obtained, respectively. New technologies to produce ethanol from RHH were tested, with the simultaneous saccharification and co-fermentation by S. cerevisiae, Spathaspora arborariae and the combination of these yeasts. In bioreactor cultures under oxygen limitation, S. cerevisiae was capable of metabolizing glucose from RHH, which contained small amounts of acetic acid, furfural, and hydroxymethylfurfural, achieving ethanol yields of 0.45. In the co-culture of S. cerevisiae and S. arborariae pentoses and hexoses from RHH, were converted to ethanol and xylitol, with yields of 0.48 and 0.39, and using simultaneous saccharification and co-fermentation with both yeasts produced ethanol and xylitol to final concentrations of 14.5 g L-1 and 3 g L-1, respectively. In soybean hull hydrolysate (SHH), was studied the ability of cellulase from Penicillium echinulatum S1M29, to increase the amount of sugars in the hydrolysate medium. The saccharification yield was 72 % using 15 FPU g-1 dry matter on orbital shaker at 120 rpm, 50 °C for 96 h. After saccharification, the ability of immobilized cells of S. cerevisiae, C. shehatae, S. arborariae, or a combination of C. shehatae, S. arborariae with S. cerevisiae for the conversion of sugars present in SHH as a substrate for ethanol production was studied. In shaker cultivations, the bioconversion of SHH into ethanol showed yields (YP/S) of 0.43, 0.47, and 0.38, in cultures of S. cerevisiae, C. shehatae, and S.arborariae, respectively. Co-cultures of S. cerevisiae and C. shehatae or S. cerevisiae and S. arborariae, produced YP/S of 0.48 and 0.40, respectively. S. cerevisiae and C.shehatae were immobilized in Ca-alginate and cultivated in bioreactors to analyse the possibility of scaling up this process. Immobilized-cell cultures showed yields of 0.45 and 0.38, respectively. Aiming to improve the fermentation of soybean hull hydrolysate (HCS), operational conditions and medium formulation were optimized using statistical experimental designs (Plackett-Burman and CCD). Plackett-Burman was used to analysate the effects of supplementation with four nutrients (peptone, yeast extract, corn steep liquor and Tween 80). Using factorial central composite design (CCD) with four replications at the center point and six axial points, was examined the effects of fermentation conditions (temperature, pH, and inoculum size) for ethanol production by Candida guilliermondii BL13. Results showed that C. guilliermondii was capable of growing in non-supplemented, non-detoxified hydrolysate, and the best culture conditions were determined to be 28 °C, pH 5.0, and 109 CFU mL-1 inoculum size, respectively. Ethanol productivity peaked at 1.4 g L-1 h-1 and yields of 0.41 g g-1, about 80 % of expected theoretical yields, were observed.

Orientador: Pilar Rodriguez de Massaguer / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-16T13:46:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 NolascoJunior_Jonas_D.pdf: 1793020 bytes, checksum: 50a108545c351293fc67eba7a94f669d (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Nesta pesquisa foi verificada a eficiência de tratamento térmico UHT para mostos a base de caldo de cana e melaço, otimizado para preservação máxima (> 98,7%) do conteúdo dos açúcares sacarose, glicose e frutose causando 3 reduções logarítmicas no micro-organismo alvo, os esporos de Geobacillus stearothermophilus ATCC 1518. Os mostos tratados termicamente tiveram suas características fermentativas avaliadas utilizando as linhagens industriais de leveduras LNF SA-1 e LNF BG-1, utilizadas na produção de bioetanol. A eficiência dos processos térmicos otimizados foi avaliada em unidade piloto de esterilização contínua Microthermics® com aquecimento indireto utilizando os binômios 125ºC/30s, 130ºC/11s, 130ºC/37s e 135ºC/5s, selecionados a partir de estudos cinéticos de destruição térmica dos esporos de G. stearothermophilus ATCC 1518 nas temperaturas 98º, 110ºC, 120ºC, 122,5ºC e 130ºC e dos açúcares sacarose, glicose, frutose e açúcares redutores totais, ART, nas temperaturas 110ºC, 120ºC, 130ºC e 140ºC, utilizando como meio mosto a 21,5ºBrix e pH 6. Os estudos cinéticos foram realizados em batelada com tubos TDT, 6 mm DI x 8 mm DE x 100 mm de comprimento. O protocolo de processo representado pelo binômio 135ºC/5s foi obtido por extrapolação. O processo térmico contínuo se mostrou mais eficiente que o processo predito através dos ensaios cinéticos em batelada. O número de reduções logarítmicas médio de 2,58 obtido experimentalmente, (nintegral-biológico), em cada um dos protocolos de processo utilizado, foi 7,35% maior que os valores calculados de 2,41, (nintegral-calculado), utilizando os perfis de temperatura obtidos em cada uma das secções da unidade piloto de esterilização, estimados com a velocidade média de escoamento. A preservação da sacarose foi maior que 99,20% enquanto que a preservação dos açúcares redutores totais foi superior a 99,52%. Nos dois processos térmicos com os binômios 130ºC/37s os valores de nintegral-biológico foram maiores que 5,87 e 7,47 e preservação dos açúcares mínima de 99.45%. Teoricamente qualquer dos protocolos de processos térmicos é capaz de causar 108 reduções logarítmicas nos Lactobacillus sp, contaminante comumente encontrados nos mostos durante fermentação. Com relação às características fermentativas dos mostos tratados termicamente, as velocidades específicas máximas de crescimento diminuíram com o aumento da temperatura de tratamento térmico dos mostos de 0,42 h-1 para 0,19 h-1 para LNF SA-1 e de 0,57 h-1 para 0,09 h-1 para LNF BG-1. Os tempos de adaptação obtidos para a linhagem LNF SA-1 variaram de 3,10 h a 4,97 h, mas, em mostos tratados na temperatura mais elevada de 135ºC por 5s, foi de 11,17 h. Para a linhagem LNF BG-1 os tempos de adaptação obtidos variaram de 5,92 h para 6,65 h para os binômios 125ºC/30s, 130ºC/11s e 130ºC/37s, mas no tratamento com o binômio 135ºC/5s foi obtido 10,88 h. A produtividade das leveduras ficou entre 0,24-0,34 g etanol/g de célula/h enquanto que o rendimento em etanol variou de 87,56% a 89,73%, valores dentro dos padrões industriais. Máximo rendimento foi obtido quando foi utilizado mosto tratado a 130ºC/37s em que foi obtido valor de nintegral-biológico maior que 5,87, indicando que os protocolos de tratamento térmicos podem ter exercido diferentes efeitos sobre a disponibilidade de macro e micro nutrientes essenciais para as leveduras / Abstract: In this research is verified the efficiency of a UHT heat treatment process for musts based on sugar cane juice and molasses optimized for maximum preservation of the content in the sugars sucrose, glucose and fructose, using as target the heat resistant spores of Geobacillus stearothermophilus ATCC 1518. Heat treated musts had their fermentative characteristics evaluated using the industrial yeast strains LNF SA-1 and LNF BG-1 for the production of bioethanol in Brazil. The efficiency of the thermal graphically optimized processes was assessed in continuous sterilization Microthermics® pilot plant with indirect heating following the binomials 125ºC/30s, 130ºC/11s, 130ºC/37s and 135ºC/5s, selected from thermal destruction kinetic studies of G. stearothermophilus spores at the temperatures 98ºC, 110ºC, 120ºC, 122.5ºC, 125ºC and 130ºC, and of the sugars sucrose, glucose, fructose and total reducing sugars, TRS, at the temperatures 110ºC, 120ºC, 130ºC and 140ºC, in must media, 21.5ºBrix and pH 6.4. Kinetic studies were carried out in batch, using TDT tubes 6 mm DI x 8 mm DE x 100 mm length. The process condition of the binomial 135ºC/5s was obtained by extrapolation. The continuous heat process was more efficient than the predicted from the batch kinetic tests. The mean number, 2.58, of integral log reduction experimentally obtained for the target microorganism, (nintegral-biological), was 7.35% higher than the mean number, 2.41, of integral calculated values, (nintegral-calculated), using the temperature profile estimated for each of section of the pilot unit with the mean flow velocity. It was found that sugar retention in the musts thermally processed was higher than 99.2% and 99.52% for sucrose and total reducing sugar, respectively. The two thermal processes that followed the binomial 130ºC/37s resulted in nintegral-biological greater than 5.87 and 7.47 with minimal preservation of sugars of 99.45%. Theoretically any of these processes is capable of causing 108 decimal reductions on Lactobacillus sp, typical contaminant found in musts and fermentation. Fermentation characteristics of heat-treated musts were assessed and the kinetic responses of the yeasts in terms of their maximum specific growth rates, in the heat treated musts, decreased with increase in heat treatment temperature of the musts from 0.42 h-1 to 0.19 h-1 for LNF SA-1 and from 0.57 h-1 to 0.09 h-1 for LNF BG-1. The adaptation times obtained for strain LNF SA-1 varied from 3.10 h to 4.97 h, but in musts treated with the highest temperature, 135ºC for 5s, the value was 11.17 h. For the strain LNF BG-1 the adaptation times varied from 5.92 h to 6.65 h, but in musts treated with the highest temperature, 135ºC for 5s, the value was 10.88 h. Cell productivity was in the range of 0.24-0.34 g ethanol/g of cell/h and the yield was in the range 87.56 - 89.73%. Maximum fermentation yield was obtained using musts treated with the binomial 130ºC/37s, for which integral biological n-values found was greater than 5.87, suggesting that the thermal treatment protocols may have exerted different effects on availability of macro and micro essential nutrients for yeasts / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Submitted by Rosangela Silva (rosangela.silva3@unioeste.br) on 2018-05-25T11:53:11Z No. of bitstreams: 2 Indianara Kawana Bueno.pdf: 2050489 bytes, checksum: 3865a86596759f1ff761267b04d8a615 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-25T11:53:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Indianara Kawana Bueno.pdf: 2050489 bytes, checksum: 3865a86596759f1ff761267b04d8a615 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-03-09 / The research for renewable energy sources became even more essential due the imminent depletion of the fossil fuel sources. In this context Brazil has a prominent position on the world stage, since it has already used ethanol from sugar cane for some decades. The second generation ethanol (2G) is produced from the lignocellulosic biomass of the vegetable, which is composed by cellulose, hemicellulose and lignin. The hydrolysis of these compounds requires a specific and high cost enzymatic cocktail. On this scenario, the Trichoderma reesei fungus gains spotlight, since it is one the microorganisms with the highest potential to produce hydroliytic enzymes. Therefore, the attempt to increase the cellulases production of this fungus is an important for the production of biofuels more attractive to the market. The aim of this work is to confirm the deletion of the sequence which codifies the zinc finger motif of the transcription factor ACE1 for cellulose repression from the T. reesei RUT-C30 strain and to characterize the enzymatic production of these mutant strains named T. reesei RUT-C30Δzface1. The enzymatic quantification was carried using the substrates carboxymethyl cellulose, microcrystalline cellulose and Whatman paper filter. The deletion confirmation occurred by the absence of the amplification gene ace1 on the mutants and the amplification of a 429 pb fragment of the RUT-C30 parental strain when the same primers and PCR conditions where used. These results suggest that the deletion of the zinc finger motif of the from ACE1 transcription factor is a prominent way to achieve an economically viable production of bioethanol. / Com a depleção eminente das fontes de combustíveis fósseis, torna-se cada vez mais imprescindível a busca por fontes renováveis de energia. Neste âmbito, o Brasil tem destaque no cenário mundial, pois já utiliza o etanol a partir da cana-de-açúcar há algumas décadas. O etanol de segunda geração (2G) é produzido a partir da massa lignocelulolítica do vegetal, que é composta de celulose, hemicelulose e lignina. A hidrólise desses compostos necessita de um coquetel enzimático específico e de alto custo. Neste cenário, o fungo Trichoderma reesei ganha destaque, pois é um dos microrganismos com maior potencial para produção de enzimas hidrolíticas. Desta forma, as tentativas de aumentar a produção de celulases desse fungo, torna a produção do bioetanol uma alternativa mais atrativa ao mercado. Este trabalho teve como objetivos confirmar a deleção da sequência que codifica o dedo de zinco do fator de transcrição do repressor de celulase ACE1 da linhagem T. reesei RUT-C30 e caracterizar a produção enzimática dessas linhagens mutantes denominadas T. reesei RUT-C30Δzface1. A confirmação de deleção ocorreu pela ausência de amplificação do gene ace1 nos mutantes e amplificação de um fragmento de 479 pb na linhagem parental RUT-C30, quando utilizados os mesmos primers e condições de reação de PCR. A dosagem enzimática com os substratos carboximetilcelulose (CMC), celulose microcristalina (Avicel®) e papel de filtro Whatman (PF), mostraram que o RUT-C30Δzface1 tem a atividade celulolítica aumentada em até 3,2 vezes em Avicel e 2,1 vezes em CMC e PF em comparação à linhagem parental RUT-C30. Em 24 horas de hidrólise os mutantes apresentaram liberação de açúcar 1,4 vezes maior em relação ao RUT-C30. Estes resultados sugerem que a deleção parcial do fator de transcrição ACE1 é um proeminente caminho para a conquista de uma produção de bioetanol economicamente viável.