Nos últimos anos, os metabólitos isolados de fungos marinhos vêm ganhando considerável atenção em razão de possuírem estruturas químicas únicas com diversas atividades biológicas já descritas, incentivando novas pesquisas na área. A tricomoníase é a doença sexualmente transmissível (DST) de origem não viral mais comum no mundo, estando associada a sérias consequências à saúde, sendo relatado um aumento no número de isolados clínicos resistentes ao tratamento de escolha. Infecções causadas por bactérias com diferentes mecanismos de resistência, representam um grande desafio para a saúde pública atual, acarretando em altas taxas de mortalidade e morbidade. As bactérias patogênicas dispõem de fatores de virulência, como a formação de biofilme, que agravam infecções tornando-as persistentes. Devido ao potencial biológico dos produtos de origem marinha e a importância dessas infecções, o objetivo deste estudo foi avaliar a atividade anti-T. vaginalis, antimicrobiana e antibiofilme de moléculas obtidas da fermentação de fungos associados a organismos marinhos. As 14 cepas fúngicas foram isoladas de esponjas e corais marinhos, obtidos da costa do estado de Alagoas, Brasil. Após produção do metabólito, o micélio foi separado do meio. O micélio foi extraído com metanol e o meio com acetato de etila. As frações foram submetidas aos ensaios de atividade anti-T.vaginalis, antimicrobiana e antibiofilme (inibição da formação e erradicação). As frações que demonstraram atividade foram submetidas ao ensaio de hemólise, avaliação da citotoxicidade (HMVII e Vero) e toxicidade em modelo de Galleria mellonella. A fração que demonstrou os melhores resultados nos ensaios de atividade foi submetida ao fracionamento bioguiado. As frações orgânicas dos fungos Aspergillus niger (FMPV 03) e complexo Trichoderma harzianum/Hypocrea lixii (FMPV 09) foram ativas frente ao T. vaginalis ATCC 30236, com valores de MIC de 2 mg/mL e 1 mg/mL, respectivamente. Quando investigadas, essas frações mantiveram a atividade frente ao isolado clínico resistente ao metronidazol (TV-LACM2R), apresentado os mesmo valores de MIC encontrados para o isolado ATCC. Para a atividade antimicrobiana, as frações orgânicas do Aspergillus niger (FMPV 03), Aspergillus tubingensis (FMPV 06), complexo Trichoderma harzianu/Hypocrea lixii (FMPV 09) e Aspergillus sydowii (FMPV 10) foram ativas contra S. epidermidis ATCC 35984. Ainda, frente a P. aeruginosa ATCC 27853 somente as frações orgânicas do Aspergillus niger (FMPV 03) e Aspergillus tubingensis (FMPV 06) demonstraram atividade. Neste ensaio, para ambas as bactérias, os valores de MIC não ultrapassaram 1,5 mg/mL. A atividade destas frações também foi observada frente às mesmas bactérias no ensaio de antiformação de biofilme, já que ocorreu a morte das células. A habilidade de erradicar biofilmes foi detectada somente para a fração orgânica do fungo Aspergillus flavus (FMPV 01), o qual foi capaz de remover 52% do biofilme já formado de S. epidermidis ATCC 35984. A ausência de hemólise dos eritrócitos foi observada em todas as frações ativas estudadas. Na avaliação da citotoxicidade in vitro frente às linhagens celulares HMVII e Vero, apenas a fração orgânica do Aspergillus niger (FMPV 03), não apresentou efeito citotóxico. No entanto, no ensaio de avaliação da toxicidade in vivo, nenhuma das amostras testadas causou redução na sobrevivência das larvas de Galleria mellonella. Então, a fração orgânica do fungo Aspergillus niger (FMPV 03) foi submetida ao fracionamento bioguiado utilizando coluna RP-18. Sete frações foram obtidas, sendo que a primeira (100% água), foi ativa contra T. vaginalis, S. epidermidis e P. aeruginosa. Quando submetida à Cromatografia em Camada Delgada (CCD), demonstrou quatro bandas que foram coradas com anisaldeído-ácido sulfúrico e ninhidrina. Além disso, a fração 100% água não demonstrou redução da sobrevivência das larvas de Galleria mellonella, nas três concentrações testadas. Portanto, a gama de atividades relatadas corrobora o potencial dos fungos marinhos na produção de moléculas bioativas. / In recent years, the isolated metabolites from marine fungi have been attracted considerable attention due to unique chemical structures with diverse biological activities, encouraging further research in the area. Trichomoniasis is the most prevalent non-viral sexually transmitted disease (STD) worldwide. This has been linked to serious health consequences and an increase in the number of clinical isolates resistant to the treatment of choice has been reported. Infections caused by bacteria with different resistance mechanisms represent a major challenge to the current public health, resulting in high rates of mortality and morbidity. Pathogenic bacteria present virulence factors, such as biofilm formation, which migth enhance the persistence of infections. Due to the biological potential of marine products and the importance of these infections, the aim of this study was to evaluate the anti-T. vaginalis, antimicrobial and antibiofilm activities of the obtained molecule from the fermentation of fungi associated with marine organism. The 14 fungal strains were isolated from sponges and corals marine obtained from the coast of Alagoas, Brazil. After production of the metabolite the mycelium was separated from the medium. The mycelium was extracted with methanol and the medium with ethyl acetate. The fractions were subjected to the assays anti-T. vaginalis, antimicrobial and antibiofilm (inhibition of the formation and eradication) activities. The fractions that showed activity were subjected to the assays of hemolysis, cytotoxicity evaluation (HMVII and Vero) and toxicity Galleria mellonella model. The fraction which showed the best results in activity assays was subjected to fractionation bioguided. The organic fraction of Aspergillus niger (FMPV 03) and Trichoderma harzianum/Hypocrea lixii complex (FMPV 09) were active against T. vaginalis ATCC 30236 with MIC values of 2 mg/mL and 1 mg/mL, respectively. When investigated, these fractions maintained activity against resistant clinical isolate to metronidazole (TV-LACM2R), presented the same MIC values found to isolate ATCC. For the antimicrobial activity, the organic fractions of Aspergillus niger (FMPV 03), Aspergillus tubingensis (FMPV 06), Trichoderma harzianum/Hypocrea lixii complex (FMPV 09) and Aspergillus sydowii (FMPV 10) were active against S. epidermidis ATCC 35984. Even, against P. aeruginosa ATCC 27853 only the organic fractions of Aspergillus niger (FMPV 03) and Aspergillus tubingensis (FMPV 06) demonstrated activity. In this test, for both bacteria, MIC values did not exceed 1.5 mg/mL. The activity of these fractions was also observed across the same bacteria in the antibiofilm formation assay, since cell death occurred. The ability to eradicate biofilms was detected only for the organic fraction of the fungus Aspergillus flavus (FMPV 01) which was able to remove 52% of the already formed biofilm of S. epidermidis ATCC 35984. The absence of hemolysis of red cells was observed in all active fractions studied. In the assessment of cytotoxicity in vitro against the cell lines HMVII and Vero, only the organic fraction of Aspergillus niger (FMPV 03), showed no cytotoxic effect. However, in the test evaluation of in vivo toxicity, none of the samples tested caused a reduction in the survival of the larvae of Galleria mellonella. Then, the organic fraction of the fungus Aspergillus niger (FMPV 03) was submitted to bioguided fractionation using RP-18 column. Seven fractions were obtained, of which the first (100% water), was active against T. vaginalis, S. epidermidis e P. aruginosa. When subjected to thin layer chromatography (TLC) showed four bands were stained with ninhydrin and anisaldehyde-sulfuric acid. In addition, 100% water fraction showed no reduction of the survival of larvae of Galleria mellonella at the three concentrations tested. Therefore, the range of activities reported corroborates the potential of marine fungi to produce bioactive molecules.

Nos últimos anos, várias espécies de fungos, até então conhecidos como saprófitas do ambiente, têm emergido como importantes patógenos na prática clínica, associados muitas vezes com a resistência aos antimicrobianos disponíveis comercialmente. Dessa forma, o conhecimento de aspectos relacionados à patogenicidade desses micro-organismos, como a formação de biofilme, assim como o perfil de susceptibilidade aos antifúngicos e a novas alternativas terapêuticas faz-se necessário. Uma importante tecnologia neste contexto é a utilização de sistemas nanoestruturados a partir de polímeros biodegradáveis para a veiculação de fármacos. Este trabalho visa verificar em isolados fúngicos emergentes a expressão fenotípica de biofilme através do teste em microplaca de poliestireno e o perfil de susceptibilidade frente a antifúngicos na forma livre e incorporados em sistemas nanoestruturados, através da técnica de microdiluição em caldo. Foram selecionados para o estudo 82 isolados fúngicos potencialmente patogênicos, sendo 26 oriundos do ambiente e 56 procedentes de espécimes clínicos. Quanto à capacidade de formação de biofilme verificou-se que 68 (82,9%) isolados produziram biofilme pelo teste da microplaca, sendo 38 classificados como fortes, 17 como moderados e 13 como fracos produtores. Além disso, observou-se que os isolados clínicos apresentaram maior capacidade de formação de biofilme do que os isolados ambientais. Não houve correlação entre a produção de biofilme e a susceptibilidade aos antifúngicos testados nas células planctônicas. De um modo geral, os fungos foram sensíveis à maioria dos antifúngicos testados neste trabalho. Entretanto, o fluconazol apresentou baixa atividade (CIM≥64μg/mL) para 45% dos isolados avaliados. Com o intuito de investigar o efeito de cetoconazol e de fluconazol associados a nanoestruturas sobre os diferentes fungos apresentados no estudo, também foram desenvolvidas nanocápsulas de poli-ɛ-caprolactona contendo estes fármacos. Análises físico-químicas das nanoestruturas revelaram tamanho médio de partícula variando de 206 nm para as nanocápsulas de cetoconazol (CN) e de 211 nm para as nanocápsulas de fluconazol (FN). Ambas as formulações apresentaram características homogêneas e demonstraram estruturas monodispersas. A eficiência de encapsulação do cetoconazol e do fluconazol nas formulações foi de 86,35 e de 80,5%, respectivamente. Os diversos gêneros investigados parecem se comportar de maneira diferente quando expostos às nanoestruturas dos dois fármacos em estudo, sugerindo que as espécies de Candida poderiam apresentar uma maior susceptibilidade in vitro frente a estas nanoestruturas quando comparadas à forma livre dos antifúngicos em questão. Os resultados obtidos demonstram a potencialidade destas formulações para a veiculação de cetoconazol e fluconazol. Como perspectivas, sugere-se a realização de estudos adicionais para evidenciar o efeito in vitro das nanopartículas sobre os diferentes fungos de importância clínica e ambiental. / In recent years, several fungal species known as environmental saprophytes have emerged as important pathogens in clinical practice, often associated with antimicrobial resistance commercially available. Thus, the knowledge of aspects related to these pathogenic micro-organisms, such as biofilm formation, as well as the profile of susceptibility to antifungal agents and new therapeutic options is necessary. An important technology in this context is the use of nanostructured materials from biodegradable polymers for the placement of drugs. This work aims to examine the emerging fungal isolates in the phenotypic expression of biofilm through the test on polystyrene microplate and the susceptibility profile to antifungals front in the free trade and in the nanostructured systems by the broth microdilution method. In this study, 82 potentially pathogenic fungal isolates were selected, being the 26 from environment originating and the 56 from the clinical specimens. Regarding the ability of biofilm formation was found that 68 (82,9%) isolates produced biofilm by the microplate assay. The isolates were classified as 38 strong, 17 moderate and 13 weak biofilm producers. Moreover, it was noted that clinical isolates showed greater capability for the biofilm formation than the environmental isolates. There was no correlation between the biofilm production and the susceptibility to antifungal agents tested in planktonic cells. In general, the fungi were susceptible of the majority of the antifungal agents tested in this study. However, the fluconazole showed low activity (MIC≥64μg/mL) for 45% of the isolates. In order to investigate the effect of the ketoconazole and the fluconazole associated with nanostructures against different fungi contained in the study, polymeric nanocapsules have also been developed containing these drugs. Physicochemical analyzes showed an average size of nanostructures ranging from 206 nm for the nanocapsules of ketoconazole (CN), and 211 nm for the fluconazole (FN). The formulations showed homogeneous characteristics and demonstrated monodisperse structures. The encapsulation efficiency of ketoconazole and fluconazole in the formulations was 86,35 and 80,5%, respectively. The diverse genera investigated appear to behave differently when exposed to the nanostructures of the two drugs have being studied, suggesting that Candida species could exhibit a greater sensitivity to these nanostructures compared to the free form of antifungal concerned. The results demonstrate the potential of the formulations for the delivery of fluconazole and ketoconazole. As perspectives, we suggest further studies to demonstrate the in vitro effect of the nanoparticles against different fungi from the clinical and the environmental importance.

Os cimentos de ionômero de vidro são biomateriais constituídos de polímeros ácidos, vidro básico (ionizável) e água, sendo usados amplamente no campo odontológico, como materiais restauradores ou ainda como cimentadores de bandas ortodônticas. Estes compostos podem ser suscetíveis a formação de biofilmes por espécies de Candida na sua superfície em função da rugosidade associada a colonização fúngica do meio bucal. Pesquisas na área de desenvolvimento de biomateriais funcionais tem buscado desenvolver compostos de alta eficácia e baixa toxicidade que sejam capazes de inibir a formação de biofilmes sobre superfícies biológicas. Considerando a busca por novos biomateriais, foi desenvolvido um estudo ex vivo com o objetivo de modificar a estrutura de um cimento de ionômero de vidro comercialmente disponível (Ketac® Cem Easymix 3M) através da inserção do sal imidazólico cloreto de 1-nhexadecil- 3-metilimidazol comparado ao cloreto de cetilpiridínio para compor um novo composto com atividade antibiofilme. O sal imidazólico e o cloreto de cetilpiridínio foram acrescentados diretamente ao pó do ionômero de vidro na proporção de 10 ppm p/p. A partir desta adição inicial, foi realizada a reação de polimerização do ionômero, obtendo corpos de prova (CP) medindo 5 mm Ø × 3 mm h, os quais foram divididos em 03 grupos: CP1, constituído do ionômero na formulação original (controle de crescimento de biofilme); CP2, constituído do ionômero acrescido com o cloreto de cetilpiridínio (referência) e CP3, constituído do ionômero acrescido do sal imidazólico. Foram testadas nove cepas de Candida não albicans resistentes ao antifúngicos usuais, sendo três cepas de C. glabrata (RL22, RL24 e RL25), três cepas de C. tropicalis (57A, 72A e 72P) e três cepas de C. parapsilosis (RL11, RL20 e RL32), todas depositadas no Laboratório de Micologia da UFRGS. Avaliou-se a resistência a deformação plástica pelo teste de microdureza; a atividade antibiofilme pela avaliação de inibição de crescimento na superfície dos CP por microscopia eletrônica de varredura e avaliação de hipoalerginicidade pelo teste da membrana cório-alantoide. O teste de microdureza não apresentou diferença significativa (p>0,05) entre os três grupos, com valor médio de 44.2 HV para o CP1, 43.5 HV para o CP2 e 43,1 HV para o CP3. A avaliação da superfície dos CP através da análise de microscopia eletrônica demonstrou haver inibição completa da formação do biofilme de todas as cepas testadas. O teste da membrana cório-alantoide indicou que o ionômero de vidro na sua composição original, bem como acrescido dos dois compostos testados, demonstrou ser hipoalergênico. Considerando os dados apresentados, podemos concluir que a adição do sal imidazólico na formulação do ionômero de vidro promoveu a ação antibiofilme contra cepas multirresistente sem perda nas características de microdureza e hipoalergenicidade. / Glass ionomer cements are biomaterials composed of acid polymers, basic glass (ionizable) and water, being widely used in dentistry, as restorative materials or as orthodontic bands. These compounds may be susceptible to biofilm formation on their surface by Candida species because of the roughness associated with fungal colonization of the oral cavity. Research on antifungal drugs development has focused on the synthesis of new compounds, that present effective action and low toxicity that are able to inhibit the formation of biofilms on biological surfaces. Considering the demand for biomaterials with antibiofilm activity, an ex vivo study was developed with the objective of modifying the structure of a commercially available glass ionomer cement (Ketac® Cem Easymix 3M) by insertion of the imidazole salt 1-n-hexadecyl-3- methylimidazole chloride compared to the cetylpyridinium chloride to make a novel compound with antibiofilm activity. The imidazole salt and cetylpyridinium chloride were added directly to the glass ionomer powder at a ratio of 10 ppm w/w. From this initial addition, the ionomer polymerization reaction was performed, obtaining test specimens (TS) measuring 5 mm Ø × 3 mm h, divided into three groups; i) TS1, composed only of GIC (growth control reference); ii) TS2, glass ionomer and cetylpyridinium chloride added directly to the powder (drug reference); and iii) TS3, glass ionomer and imidazolium salt using the same procedure. Nine strains of nonalbicans Candida, resistant to usual antifungals, were used; three C. glabrata strains (RL22, RL24 and RL25), three C. tropicalis strains (57A, 72A and 72P) and three C. Parapsilosis strains (RL11, RL20 and RL32), all the strains are deposited in the Mycology Collection at UFRGS. The plastic deformation was evaluated by the microhardness test; the antibiofilm activity by the evaluation of inhibition of growth on the surface of the specimens by scanning electron microscopy and evaluation of hypoallerginicity by the test of the chorioallantoic membrane. The plastic deformation evaluation showed no significant difference among the three groups, with a mean value of 44.2 HV for TS1, 43.5 HV for TS2 and 43,1 HV for TS3. Evaluating the biofilm formation on TSs, all the isolates form biofilm on TS1 (reference). On the other hand, both TS2 and TS3 were able to inhibit surface biofilm growth. The allergenicity evaluation of the three TSs showed no evidence of tissue alteration, considering that the eggs’ chorioallantoic membrane remained intact. Considering the presented data, we can conclude that the addition of the imidazole salt in the glass ionomer formulation promoted the antibiofilm action against multiresistant strains without loss in the characteristics of microhardness and hypoallergenicity.

O presente trabalho teve por objetivo avaliar ex vivo a atividade antimicrobiana hipoclorito de sódio (NaOCl) 2,5% e 5,25%, clorexidina (CHX) gel e líquida 2% e MTAD em biofilme de Enterococcus faecalis, sobre matriz dentinária humana. 118 incisivos inferiores humanos, com canal único, foram instrumentados e seccionados transversal e longitudinalmente. Os fragmentos radiculares obtidos foram imersos em caldo TSB e autoclavados e em seguida foram inoculados com suspensão de E. faecalis e incubados em estufa a 37C, por 72 horas, para permitir a formação do biofilme. As amostras foram randomicamente divididas em 5 grupos experimentais, com 40 amostras para cada grupo, e dois grupos controle, com 3 amostras cada. O biofilme formado sobre a matriz dentinária foi submetido à ação das soluções antimicrobianas pelos tempos 1, 5, 15 e 30 minutos. A atividade antimicrobiana foi avaliada por meio da contagem de UFCs. Após a ação das soluções antimicrobianas, os fragmentos foram imersos em meio seletivo para enterococos, incubados em estufa a 37 C por 72 horas e avaliados quanto à turbidez do meio. A avaliação do percentual de redução bacteriana em função do tempo e da solução demonstrou não haver diferença estatística entre CHX gel, NaOCl 2,5% e NaOCl 5,25% (p>0,05). Entretanto a CHX líquida e o MTAD foram menos efetivos que NaOCl 2,5% e NaOCl 5,25% (p<0,05) e semelhantes a CHX gel. O tempo de ação de 1 minuto foi o menos efetivo na eliminação bacteriana. Apenas a CHX líquida e o MTAD apresentaram diferenças na eficácia em função do tempo. A CHX foi menos efetiva em 1 e 5 minutos (p<0,05) e o MTAD, em 1 minuto de ação. Ao analisar a viabilidade bacteriana intra-dentinária, o NaOCl 5,25% e o MTAD foram superiores a CHX gel, CHX líquida e NaOCl 2,5%; e o tempo de 30 minutos foi estatisticamente significativo em relação aos demais (p<0,05). Baseado nos resultados obtidos parece-nos lícito concluir que o NaOCl 2,5% e 5,25% e a CHX gel 2% foram mais eficazes na eliminação de E. faecalis em todos os tempos testados. O MTAD apresentou efetiva ação antimicrobiana a partir de 5 minutos de ação. Porém quando foi avaliada a atividade antimicrobiana no interior da dentina, o NaOCl 5,25% e o MTAD foram mais efetivos, sendo necessário tempo mínimo de 30 minutos para ampla eliminação bacteriana no interior dos túbulos dentinários. / The present study aimed to evaluate ex vivo the antimicrobial activity of sodium hypochlorite (NaOCl) 2.5% and 5.25%, chlorhexidine (CHX) liquid and gel 2% and MTAD in Enterococcus faecalis biofilms, on human dentin matrix. 118 mandibular human incisors, single rooted, were instrumented and sectioned transversal and longitudinally. The root sections obtained were immersed in TSB broth and autoclaved, thereafter, they were inoculated with suspensions of E. faecalis and incubated at 37C, for 72h to allow biofilm formation. Samples were randomly divided in 5 experimental groups, with 40 samples per group, and 2 control groups, with 3 samples each. The biofilm developed over the dentin matrix was placed under the action the antimicrobial solutions for 1, 5, 15 e 30 minutes. The antimicrobial activity was assessed through CFU counts. After the action of the antimicrobial solutions, the root fragments were immersed in an Enterococci selective broth, incubated at 37 C for 72 hours, and evaluated for broth turbidity. The analysis of the percentage of bacterial reduction depending on the time and on the solution demonstrated no statistic difference among the CHX gel, NaOCl 2.5% and 5.25%(p>0.05). However, the CHX liquid and MTAD were less effective than NaOCl 2,5% and NaOCl 5,25% (p<0.05) and similar to CHX gel. Only CHX liquid and MTAD had statistical differences in its efficacy depending on the time. CHX was less effective in 1 and 5 minutes (p<0.05) and MTAD in 1 minute. When analyzing the bacterial viability in the dentin, NaOCl 5.25% and MTAD were superior to CHX gel, CHX liquid and NaOCl 2,5%; and the time of 30 minutes was statistically different than the others (p<0.05). Based on the results obtained it seems licit to conclude that NaOCl 2,5% and 5,25% and CHX gel 2% were the most effective in the elimination of E. faecalis at all times tested. MTAD presented effective antimicrobial action after 5 minutes of action. However, when the bacterial survival in the dentin was assessed, NaOCl 5.25% and MTAD were the most effective, and the minimum time for wide bacterial elimination in the dentinal tubules was 30 minutes.

Em consultórios odontológicos são utilizadas canetas rotatórias que durante seu uso entram em contato com a microbiota oral, podendo trazer conseqüências para o próprio paciente ou para outros que utilizarem o mesmo equipamento, se não houver um tratamento apropriado para sua reutilização. Para avaliar a eficiência de diferentes tratamentos utilizados rotineiramente na limpeza e desinfecção de equipamentos odontológicos, este trabalho descreve a produção de biofime in vitro em superfície de canetas odontológicas e a eficiência dos biocidas glutaraldeído, ácido peracético e álcool 70%, do detergente enzimático e da lavagem ultra-sônica para remoção do biofilme induzido, utilizando amostras de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus. Para a padronização dos métodos, além de curvas de crescimento de ambos os micro-organismos, foram realizados testes de adesão em cupons obtidos pelo corte das canetas. Foram testados diferentes tempos de incubação para a produção do biofilme, cujo valor máximo foi obtido em 14 dias. A avaliação da formação de biofilme foi realizada pelo método de contagem de bactérias viáveis (CBV), por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e pelo método Cristal Violeta. A eficiência dos tratamentos na remoção do biofilme foi determinada pela diferença entre o número de células aderidas aos cupons submetidos ao tratamento e os cupons não submetidos. Maior remoção foi observada nos cupons tratados com ácido peracético, glutaraldeído e álcool 70% comparados aqueles tratados com detergente enzimático, lavagem ultra-sônica e solução salina. Os três primeiros tiveram eficiências similares, demonstradas pelos métodos CBV e MEV. O efeito dos tratamentos em S.aureus foi semelhante ao observado em P. aeruginosa, exceto a lavagem ultra-sônica que em S.aureus demonstrou melhor desempenho. Os tratamentos utilizados neste trabalho reduziram o biofilme em cupons de canetas odontológicas, mas não o removeram completamente, comprometendo a biossegurança na reutilização das canetas. / Rotating pens during its use in dental offices come into contact with the oral microbiota and may bring consequences to the patient or to others who use the same equipment, if there is not a clean suitable for reuse. To evaluate the efficiency of different treatments utilized routinely for cleaning dental equipments, this study describes the in vitro biofilm production on surfaces of dental pens and the efficiency of the biocides glutaraldehyde, peracetic acid, alcohol 70%, detergent enzyme and ultrasound rinsing for biofilm removal, using Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus strains. For the standardization of methods, and growth curves of both microorganisms, adhesion tests were performed on coupons obtained by cutting the pens. We tested different incubation times for the production of biofilm, whose maximum value was obtained in 14 days. Evaluation of biofilm formation was performed by the method of counting viable bacteria (CBV) and scanning electron microscopy (SEM) and Crystal Violet method.The efficiency of treatments on biofilm removal was determined by the difference between the number of cells attached to coupons submitted and not submitted to treatment. Higher removal was observed on the coupons treated with peracetic acid, glutaraldehyde and 70% alcohol than in those treated with enzyme detergent, ultrasonic washing and saline. The first three had similar efficiencies, as demonstrated by CBV and SEM. The effect of treatment on S. aureus was similar to that observed in P. aeruginosa, except for ultrasonic washing in S. aureus that showed better performance. Therefore, the treatments used in this work reduced but not completely removed the biofilm in dental coupons pens, which can compromise the biological safety when they are reused.

Orientador: Fernando Antônio de Ávila / Banca: José Moacir Marim / Banca: Patricia Amoroso / Banca: Simone Barone Salgado Marques / Banca: Tammy Priscilla Chioda Delfino / Resumo: Foram estudadas 180 amostras de água de 45 consultórios odontológicos da cidade de Barretos-SP, com o objetivo de isolar, identificar, determinar a contagem de isolados de Pseudomonas aeruginosa UFC/mL, determinar o perfil clonal e avaliar a diversidade genômica dos isolados e a suscetibilidade das mesmas frente a diferentes antibióticos. As amostras de água foram filtradas em filtro Millipore® e a membrana colocada sobre o centro de uma placa de Petri contendo agar cetrimida, As colônias típicas de bactérias do gênero Pseudomonas foram identificadas pelo método de Gram, inoculação em TSI agar (Triple Sugar Iron), crescimento a 42ºC, produção de pigmento, produção de alginato, oxidase, motilidade e alcalinização da acetamida. O teste utilizado para análise genômica foi o ERIC-PCR. Dos 76 (42,2%) isolados de Pseudomonas aeruginosa, 15 eram provenientes das amostras de torneira de lavagem das mãos, 18 de reservatório de garrafa pet, 23 de seringa tríplice e 20 do motor de alta rotação. Todos os isolados de Pseudomonas aeruginosa foram submetidos ao teste de suscetibilidade segundo a técnica de Kirby- Bauer. Dos antibióticos testados o que apresentou melhor resultado quanto à sensibilidade (65,8%) foi a ciprofloxacina. Quanto à similaridade genética dos isolados dos diferentes pontos analisados, foram encontrados nove "clusters" de 100% de similaridade. / Abstract: The biofilm found in water supplies and lines of hospitals and dental units is extremely important because it presents a large number of bacteria, leading to risk of infection in immunocompromised patients vulnerable to opportunistic pathogens such as the Pseudomonas aeruginosa. One hundred eighty water samples from dental units of the city of Barretos-SP were evaluated. The water samples filtered in Millipore® filter were incubated in plates containing Cetrimide ágar. The bacteria colonies were identified through the gram-staining test, inoculation in agar T.S.I (triple sugar Iron), growth at 42 ° C, pigment production, production of alginate, oxidase acetamide alkalization and motility observation. All Pseudomonas aeruginosa bacteria were submitted to the susceptibility test according to the Kirby-Bauer technique. The test used for genomic analysis was the ERIC-PCR. From the total microorganisms studied, 76 (42,2%) were positive for Pseudomonas aeruginosa, isolates from 180 water samples, where 15 strains were from hand washing incoming local water supplies, 18 from PET bottled water, 23 from 3-in-1 syringes and 20 from the high speed handpiece. In relation to the antibiotics tested, the one presenting the best result with regard to sensibility was ciprofloxacin with 65.8%. The genetic similarity of isolates from different points analyzed, there were nine clusters of 100% similarity. / Doutor

Streptococcus mutans é considerado um agente etiológico primário da cárie dentária e um importante agente etiológico da endocardite infecciosa. O microrganismo pode ser classificado em quatro sorotipos (c, e, f e k), sendo o sorotipo c o mais comumente prevalente na população. S. mutans também pode acessar a corrente sanguínea e colonizar células endoteliais das artérias coronárias, através de sua ligação e posterior invasão. O gene cnm, codificador de uma proteína de ligação ao colágeno encontrado em algumas cepas de S. mutans pode ser relacionado com sua virulência. Objetivos: (1) formação de biofilmes em superfícies tratadas com colagénio e a expressão de genes a formação de biofilme chave spaP e brpA, (2) aderência (30 min e 2 h) , invasão (5h) e persistência (24h) em células endoteliais e (3) desmineralização da dentina. Tanto os experimentos de formação de biofilme dependente de colágeno quanto os de aderência, invasão e persistência em células primárias Human Coronary Artery Endothelial Cells foram realizadas utilizando cepas de S. mutans UA159 (sorotipo c), B14 (sorotipo e), OM50E (sorotipo e), LM7 (sorotipo e), OMZ175 (sorotipo f), NCTC 11060 (sorotipo f) e os isolados clínicos deste estudo 7,1 (sorotipo c), C2A4 (sorotipo e) e 61 (sorotipo k). Mutantes deletérios do gene cnm foram construídas em todas as cepas cnm positivas, exceto para C2A4. Cepas OMZ175 e 61 e seus respectivos mutantes também foram empregados para avaliar a expressão de genes spaP e brpA por PCR em Tempo Real e a desmineralização da dentina através de Tomografia de Coerência Óptica (OCT). Os dados mostraram que o gene cnm é significativo para a formação de biofilme em superfícies tratadas com colágeno e invasão de células endoteliais, mas não apresenta influência na adesão celular. A maior parte das cepas cnm positivas foram capazes de persistir intra-celular 24h. O modelo de cárie experimental não foi capaz de demonstrar a importância do gene cnm na desmineralização da dentina. O gene cnm foi necessário para o desenvolvimento de biofilme de e invasão do microrganismo à células endoteliais, mas não para a adesão às HCAEC. / Streptococcus mutans is considered a primary etiological agent of dental caries and an important etiological agent of infectious endocarditis. It can be classified into four serotypes (c, e, f and k), which serotype c is the most commonly prevalent in the population. The recent breakthrough that the cnm gene, which encodes a collagen binding protein found in some S. mutans strains, has set off new studies on this species, such as biofilm formation and bacteria-cell interactions. Aims: (1) biofilm formation on collagen-treated surfaces and the expression of biofilm formation key genes spaP and brpA; (2) adhesion (30 min and 2h), invasion (5h) and persistence (24h) in endothelial cells and (3) dentin demineralization. Experiments on collagen-dependent biofilm formation, and adhesion, invasion and persistence in HCAEC cells (primary Human Coronary Artery Endothelial Cells) were performed using S. mutans strains UA159 (serotype c), B14 (serotype e), OM50E (serotype e), LM7 (serotype e), OMZ175 (serotype f), NCTC 11060 (serotype f) and the clinical isolates of this study 7.1 (serotype c), C2A4 (serotype e) and 61 (serotype k). Mutants cnm were constructed in all strains presenting the gene, except for C2A4. Strains OMZ175 and 61 and their respective mutants were also employed to evaluate both the expression of spaP and brpA genes by PCR Real Time and the dentin demineralization through Optical Coherence Tomography (OCT). One hundred forty four clinical isolates of S. mutans were collected from 47 patients. Our data have shown that the cnm gene is significant for both biofilm formation on collagen-treated surfaces and invasion of endothelial cells, but it has no influence in cell adhesion. In addition, most of the cnm positive strains were able to persist up to 24h intracellularly. Likewise, the model of experimental caries was not able to demonstrate the importance of cnm in dentin demineralization. Thus, gene cnm is required for S. mutans on collagen-dependent biofilm formation and invasion of endothelial cells, but it was not required for adhesion to HCAEC.

Sistemas de membranas filtrantes, principalmente os de osmose reversa, estão sendo cada vez mais utilizados em diversos seguimentos de empresas (farmacêutica, tratamento de água, alimentícia e química), devido à diminuição do preço dos elementos filtrantes e da alta qualidade do produto obtido. Apesar do preço dos elementos de osmose reversa terem caído nos últimos tempos, a substituição destes continua sendo o fator mais dispendioso de um sistema de osmose reversa. A autópsia de membranas é uma técnica utilizada para investigar a causa que levou à colmatação de um elemento, contribuindo no melhoramento do pré-tratamento da água de alimentação e consequentemente aumentando a vida útil dos elementos. O presente trabalho teve como objetivo incrementar a técnica de autópsia de membranas de osmose reversa através da análise da volatilização dos principais compostos inorgânicos presentes nestas membranas, modificação na metodologia de quantificação de açúcares e proteínas, comparação de diferentes técnicas de remoção do material depositado sobre as membranas e análise da distribuição de biofilmes sobre elementos colmatados de osmose reversa. A análise dos resultados mostrou que dentre os inorgânicos, ocorreu volatilização completa do cloreto de amônio e pequena variação no composto cloreto férrico; a quantificação de proteínas e açúcares, através da fortificação das amostras, apresentou valores diferentes quando comparados com os valores obtidos diretamente da curva padrão, devido à diferença de inclinação entre as retas de fortificação e padrão; os resultados também mostraram que a trituração foi mais eficiente na remoção do material aderido quando comparado com a raspagem e a sonicação e a distribuição de biofilmes se mostrou uniforme nos dois elementos analisados. / Filter membrane systems, especially reverse osmosis, are being increasingly used in various business segments (pharmaceutical, water treatment, food and chemical) due to decrease in the price of the filter elements and high quality product. Although the price of reverse osmosis elements have fallen in recent times, the replacement of the part remains more expensive a reverse osmosis system. The autopsy of membranes is a technique used to investigate the cause that led to clogging of one factor contributing to the improvement of pre-treatment of water feeding and consequently increasing the life of the elements. This study aimed to improve the technique of autopsy reverse osmosis membranes by examining the volatilization of major inorganic compounds present in these membranes, modification the methodology for quantification of sugars and proteins, comparison of different techniques for removal of material deposited on the membranes and distribution analysis of biofilms on elements obscured reverse osmosis. The results showed that among the Inorganic volatilization was full of ammonium chloride and small variation in the compound ferric chloride, the quantification of proteins and sugars, by fortifying the samples showed different values when compared with values obtained directly the standard curve due to the difference in slope between the lines of and fortification standard, the results also showed that the blending was more efficient in removing adhered material when compared with the scraping and sonication and distribution of biofilms showed uniform the two elements analyzed.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-14Bitstream added on 2014-06-13T20:35:32Z : No. of bitstreams: 1 santos_ss_me_jabo.pdf: 560994 bytes, checksum: b6007a23b1c54664298b50a409bb2bc6 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O leite é um alimento altamente nutritivo e excelente substrato para a multiplicação de microrganismos. Os estafilococos estão entre os principais contaminantes do leite, seja em decorrência da mastite ou de falhas de higienização. A contaminação do leite pode favorecer a adesão bacteriana sobre superfícies com a formação de biofilmes, cujos fragmentos podem se desprender e contaminar o produto durante o processo de beneficiamento, o que representa um risco à saúde do consumidor. Tendo isto em foco, objetivou-se o presente estudo, em uma micro-usina do Estado de São Paulo, a fim de investigar a presença e formação de biofilme por Staphylococcus spp, antes e após o processo de higienização. Colheu-se o total de 60 amostras por meio de suabes, antes e após o processo de higienização, das superfícies do tanque de recepção, do tanque de estocagem de leite cru, da tubulação de saída do pasteurizador, do tanque de estocagem de leite pasteurizado, e da tubulação da máquina de envase. Foram colhidas, ainda, amostras de leite no tanque de recepção, no tanque de estocagem de leite cru, na tubulação de saída do pasteurizador e amostras de leite envasado, assim como das embalagens plásticas vedadas e vazias, utilizadas para o envase do leite pasteurizado. Dentre 41 estirpes de Staphylococcus spp isoladas, 16 (39,0%) mostraram-se positivas na prova da coagulase, enquanto que 25 (61,0%) foram negativas. Por meio de análise genotípica, com a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), pode-se observar que, dentre as 16 estirpes coagulase positivas, quatro (25%) apresentavam o gene icaA e 16 (100%) possuíam o gene icaD. Dentre as 25 estirpes coagulase negativas, 11 (44%) possuíam o gene icaA e 25 (100%) possuíam o gene icaD. Visualizou-se, por meio da microscopia eletrônica de varredura... / Milk is a highly nutritious food and excellent substrate for the multiplication of microorganisms. Staphylococci are one of the major contaminants of milk whether due to mastitis or hygiene failures in cleaning. Milk contamination may encourage bacterial adherence on surfaces with the formation of biofilms, whose fragments can detach and contaminate the product during beneficial processing, which represents a health risk to the consumers. With this in focus as the objective of this present study, to investigate the presence and formation of biofilm of Staphylococcus spp before and after the cleaning process in a micro-dairy plant in São Paulo State. A total of 60 swab samples were collected before and after the cleaning process from the reception tank surfaces, the raw milk storage tank storage, the pasteurizer outlet pipe, the pasteurized milk storage tank, and the filling machine. Further samples were collected of the milk in the receiving tank, the raw milk storage tank, from the pasteurizer outlet pipe, and packaged milk, as well as the empty sealed plastic packaging used for packaging the pasteurized milk. Of the 41 strains of isolated Staphylococcus spp, 16 (39.0%) indicated positive in the coagulase test, while 25 (61.0%) were negative. Through genetic analysis, using the Polymerase Chain Reaction (PCR) technique, it was observed that within the 16 strains of coagulase-positive, four (25%) presented the gene icaA and 16 (100%) had the gene icaD. Of the 25 strains of coagulase-negative, 11 (44%) had the gene icaA and 25 (100%) had the gene icaD. It was seen using a scanning electron microscope the start of bacteria adhesion and the formation of biofilm for all the isolated strains. From the obtained results it was possible to see evidence to the potential risk to the health of the consumer represented... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-03-06T13:18:25Z No. of bitstreams: 1 arquivo total.pdf: 1622677 bytes, checksum: 4910b306e46e741a75cc3d2047affa2c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-06T13:18:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivo total.pdf: 1622677 bytes, checksum: 4910b306e46e741a75cc3d2047affa2c (MD5) Previous issue date: 2015-08-17 / Introduction: Faced with limitations to the use of sodium hypochlorite in the disinfection of dental prostheses and the need to control fungal proliferation in these sites, it is necessary to study new substances for this purpose. Objectives: To evaluate the antifungal activity, mechanism of action, cytotoxicity and antibiofilm action of chloramine T (CAT) on Candida spp. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the substance on Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei and Candida glabrata was determined by the microdilution technique and the minimum fungicidal concentration (CFM) was calculated through the subculture in Sabouraud Dextrose Agar (ASD) . The growth inhibition kinetics of C. albicans were evaluated by the method of counting colony forming units (CFU) at different times and concentrations. A microculture of C. albicans was performed on fowl agar plus tween 80 to evaluate the possible alteration of micromorphology against different concentrations of the substance. The possible mechanism of action on wall and fungal cell membrane was verified by the determination of MIC in the presence of sorbitol and ergosterol respectively. The inhibition of the initial adherence of fungal cells, formation and reduction of C. albicans biofilm were evaluated after short (1 min) and prolonged (8 h) contact with the substance and formation of the biofilm was measured by absorbance at 600 nm, Transformed into scores referring to the percentage of inhibition obtained based on the values ​​of the control group. The cytotoxicity of the substance was evaluated by the hemolysis method. Nystatin and sodium hypochlorite were used as positive controls. A descriptive and inferential analysis was performed considering α = 5%. Results: The CIM75% found for CAT was 781.3 μg / mL and the CFM / MIC ratio suggests a fungicidal activity against most of the strains tested, with probable action on cell wall and membrane. The substance showed immediate and prolonged action on the kinetic test and caused reduction of the filamentous form and inhibition of chlamydoconidia. In the biofilm assay, it presented similar results to sodium hypochlorite for inhibition of initial adherence and formation of mature biofilm (p> 0.05) and was more effective in reducing mature biofilm in the short contact groups at MIC concentration x2 (24 H) and CIM x 4 (48 h) (p <0.05). Conclusion: CAT shows antifungal activity on Candida spp. And shows fungicidal action on most of the strains tested. Its action is immediate and prolonged in the inhibition of C. albicans growth and probably occurs both in the wall and in the cell membrane. CAT causes alterations in the micromorphology of C. albicans and has antibiofilm activity, being effective in inhibiting the initial adherence of fungal cells, as well as in the formation and reduction of biofilm. / Introducao: Diante das limitacoes para o uso do hipoclorito de sodio na desinfeccao de proteses dentarias e da necessidade do controle da proliferacao fungica nestes sitios, faz-se necessario o estudo de novas substancias para este fim. Objetivos: Avaliar a atividade antifungica, mecanismo de acao, citotoxicidade e acao antibiofilme da cloramina T (CAT) sobre Candida spp. Materiais e Metodos: Foi determinada a concentracao inibitoria minima (CIM) da substancia sobre Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei e Candida glabrata pela tecnica da microdiluicao e calculada a concentracao fungicida minima (CFM) atraves do subcultivo em Agar Sabouraud Dextrose (ASD). Foi avaliada a cinetica de inibicao do crescimento de C. albicans pelo metodo de contagem de unidades formadoras de colonias (UFC) em diferentes tempos e concentracoes. Foi realizado microcultivo de C. albicans em agar fuba acrescido de tween 80 para avaliacao da possivel alteracao da micromorfologia frente a diferentes concentracoes da substancia. O possivel mecanismo de acao sobre parede e membrana celular fungica foi verificado atraves da determinacao da CIM na presenca, respectivamente, de sorbitol e ergosterol. A inibicao da aderencia inicial de celulas fungicas, formacao e reducao do biofilme de C. albicans foram avaliados apos contato curto (1 min) e prolongado (8 h) com a substancia e a formacao do biofilme foi mensurada atraves de absorbancia a 600 nm, transformada em escores referentes a porcentagem de inibicao obtida com base nos valores do grupo controle. A citotoxicidade da substancia foi avaliada pelo metodo da hemolise. Nistatina e hipoclorito de sodio foram utilizados como controles positivos. Foi realizada analise estatistica descritiva e inferencial, considerando α=5%. Resultados: A CIM75% encontrada para a CAT foi de 781,3 µg/mL e a relacao CFM/CIM sugere uma atividade fungicida frente a maioria das cepas testadas, com provavel acao em parede e membrana celulares. A substancia mostrou acao imediata e prolongada no teste de cinetica e provocou reducao da forma filamentosa e inibicao de clamidoconidios. No ensaio do biofilme, apresentou resultados semelhantes ao hipoclorito de sodio para inibicao da aderencia inicial e formacao do biofilme maduro (p>0,05) e foi mais efetiva na reducao do biofilme maduro nos grupos de contato curto na concentracao CIM x 2 (24 h) e CIM x 4 (48 h) (p < 0,05). Conclusao: A CAT apresenta atividade antifungica sobre Candida spp. e apresenta acao fungicida sobre a maioria das cepas testadas. Sua acao e imediata e prolongada na inibicao do crescimento de C. albicans e provavelmente ocorre tanto em parede quanto em membrana celular. A CAT causa alteracoes na micromorfologia de C. albicans e possui atividade antibiofilme, sendo efetiva na inibicao da aderencia inicial das celulas fungicas, bem como na formacao e reducao do biofilme.