Listeria monocytogenes é o agente causal da listeriose, uma doença que pode atingir mulheres grávidas (e seus fetos), crianças, idosos e indivíduos com o sistema imunológico comprometido, A listeriose representa a maioria dos casos de morte decorrente de toxinfecções alimentares. Os alimentos são reconhecidos como fontes primárias da transmissão desta bactéria para o homem e L. monocytogenes já foi isolada de uma grande variedade de alimentos. Superfícies de equipamentos utilizados na produção de alimentos também podem estar contaminadas com este patógeno. Falhas em procedimentos de higienização podem deixar resíduos nos equipamentos de processamento de alimentos e L. monocytogenes pode se aderir a superfícies abióticas e iniciar sua multiplicação, dando origem a biofilmes. A interação com bactérias de outras espécies pode influenciar na forma formação de biofilmes por L. monocytogenes, constituindo um aspecto importante de estudo para auxiliar no controle da contaminação de alimentos por esta bactéria. Leuconostoc mesenteroides é uma bactéria lática normalmente encontrada em alimentos e algumas cepas podem interferir na multiplicação de L. monocytogenes pela produção de bacteriocinas com atividade antilisterial. Os biofilmes representam uma preocupação para indústria de alimentos, pois geralmente os microorganismos aderidos apresentam maior capacidade de resistir a tratamentos antimicrobianos. Neste trabalho, foram coletadas 30 amostras de presunto cozido fatiado, 30 de mussarela fatiada e 30 de superfícies de equipamentos de fatiar alimentos, em estabelecimentos do comércio varejista de Ribeirão Preto SP. As amostras forma avaliadas quanto à presença ou ausência de L. monocytogenes e também foi estudada a capacidade dos isolados em formar biofilmes em cultura pura e em testes de co-cultura. O sanitizante ácido peracético e a bacteriocina nisina foram testados para controlar a formação de biofilme por L. monocytogenes. Os resultados obtidos mostram que os isolados de L. monocytogenes formaram biofilme em superfície de aço inoxidável quando cultivados isoladamente ou em testes de co-cultura com L.mesenteroides. O tratamento da lâmina com ácido peracético inativou todas as células presentes no biofilme. Nas condições utilizadas, nisina não apresentou atividade contra L.monocytogenes em biofilmes. / Listeria monocytogenes is the causal agent of listeriosis, an infection that targets mainly pregnant women (and their fetuses), children, the elderly and immunocompromised individuals. Listeriosis represents the majority of fatal cases of foodborne diseases. Foods are recognized as primary sources of transmission of this bacterium to man and L. monocytogenes has been isolated from of a great variety of foods. Surfaces of equipments used in the production of foods can harbour L. monocytogenes. Failures in sanitization procedures can leave food residues adhered to equipments of food processing and L. monocytogenes can attach to abiotic surfaces, multiply and form biofilms. Interactions among bacteria of diverse species may influence biofilm formation by L. monocytogenes and this is an important issue to be studied to improve food safety. Leuconostoc mesenteroides is a lactic bacterium usually found in foods and some strains can interfere with the multiplication of L. monocytogenes by production of bacteriocins with antilisterial activity. Biofilms represent a special concern to the food industry, because adhered microorganism are generally more resistant to antimicrobial treatments. In this work, we collected 30 samples of sliced cooked ham, 30 of sliced mozzarella cheese and 30 of surfaces of food processing equipments, in the retail market of the city of Ribeirão Preto - SP. The samples were studied for presence or absence of L. monocytogenes. The ability of the isolates to form biofilms was also studied, in pure and in co-culture tests. The sanitizer peracetic acid and the bacteriocin nisin were tested to control biofilm formation by L. monocytogenes. L. monocytogenes formed biofilm on stainless steel coupons when cultivated alone or in co-culture with L. mesenteroides. The treatment of stainless steel coupons with peracetic acid inactivated the cells of the biofilm. Under the experimental conditions tested nisin did not present activity against L. monocytogenes in biofilms.

O objetivo deste trabalho foi avaliar, por meio de estudo in vitro, o efeito de soluções químicas de higienização quanto à ação antimicrobiana e os efeitos sobre as propriedades da resina acrílica termicamente ativada. Para a ação antimicrobiana, corpos de prova circulares (15mm x 3mm) foram esterilizados por radiação em forno micro-ondas e contaminados com suspensão de 106 UFC/mL dos microrganismos: Candida albicans, Candida glabrata e Streptococcus mutans e incubados a 37ºC por 48hs. Em seguida, os espécimes foram imersos nas seguintes soluções: Grupo I - PBS (controle); Grupo II - Solução à base de Ricinus communis a 6,25%; Grupo III - Hipoclorito de sódio 0,20%; durante 20 minutos, e, Grupo IV - Peróxido Alcalino Efferdent® Power Clean Crystals, durante 3 minutos, e lavadas (PBS) e imersas em meio Letheen. A suspensão resultante foi diluída (100 e 10-3) em solução salina estéril e alíquotas foram semeadas em meio específico. Após incubação (37ºC por 24hs), as colônias foram contadas para o cálculo de UFC/mL. Para análise das propriedades da resina acrílica, corpos de prova circulares (15mm x 3 mm) e retangulares (65mm x 10mm x 3,3 mm) foram imersos nas soluções, simulando 05 anos de imersões curtas. Antes e após as imersões, foram submetidos a análise de cor (Colorímetro Color Guide 45/0) e NBS (NBS=&Delta;E* x 0,92); de dureza Knoop (microdurômetro Microhardness Tester Shimadzu); de rugosidade de superfície (rugosímetro Surftest SJ - 201P, Mitutoyo Corporation; microscópio confocal a laser 3D Olympus LEXT OLS4000®, Japão); de morfologia de superfície (microscópio eletrônico de varredura EVO 10 - MEV, Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemanha); e de resistência à flexão (Máquina Universal de Ensaios DL 2000, EMIC). Os dados com distribuição normal foram analisados por ANOVA, seguido pelo teste de Tukey; os dados com distribuição não-normal, foram analisados pelos testes de Kruskal-Wallis e Dunn (&alpha;=0,05). Os resultados mostraram que o hipoclorito reduziu a zero a contagem de UFC dos três micro-organismos, os grupos do Ricinus communis e do peróxido Efferdent tiveram ação moderada frente Candida glabrata (p<0,001) e S. mutans (p=0,001), respectivamente. Quanto as propriedades da resina, a solução de Ricinus communis causou leve alteração de cor (p=0,030), segundo NBS; maiores alterações de dureza (p<0,001), rugosidade superficial em rugosímetro (p=0,006) e microscópio 3D (p=0,040) e da resistência à flexão (p<0,001). A maior alteração da morfologia de superfície (MEV) foi observada no grupo do peróxido Efferdent. Pode-se concluir que a solução de hipoclorito de sódio a 0,20% foi a mais efetiva, uma vez que apresentou ação antimicrobiana frente aos três micro-organismos avaliados; as soluções de Candida glabrata e Streptococcus mutans, respectivamente. Quanto à análise das propriedades da resina acrílica, nenhuma das soluções causou alteração clinicamente significante nas propriedades avaliadas / The purpose of this in vitro study was to evaluate the antimicrobial action and adverse effects of denture cleansers on a heat-polymerized acrylic resin. The antimicrobial action was evaluated by samples fabricated on a metallic circular matrix (15mm x 3mm), which were sterilized by microwave (650W, for 6 minutes) and inoculated with a 106 CFU/ml of microorganisms´suspension: Candida albicans, Candida glabrata, and Streptococcus mutans. After contamination, the specimens were incubated at 37ºC for 48hs and then immersed on the following solutions: Group I - Saline (control); Group II - Ricinus communis 6.25% solution based; Group III - Sodium hypochlorite 0.2%; Group IV - Alkaline Peroxide Efferdent® Power Clean Crystals. The samples were then washed (PBS) and immersed in the Letheen medium. The resulting solution was diluted (100 and 10-3) in sterile saline, and aliquots were cultured in the specific medium. After incubation (37ºC for 24hs), according to with characteristic morphology, the number of colonies was measured and the number of CFU / mL calculated. For the adverse effects, circular (15 x 3 mm) and rectangular (65 x 10 x 3.3 mm) test specimens of heat-polymerized acrylic resin were immersed in the solutions, simulating 05 years of short immersions per sanitation period. Before and after the immersions, the samples were evaluated for color alteration (Color Guide Color Guide 45/0) and correlation of the data according to NBS units (NBS = &Delta;E * x 0,92); Knoop hardness (Microhardness Microhardness Tester Shimadzu). Analysis of surface roughness (Surftest SJ-201P rugosimeter, Mitutoyo Corporation; Olympus LEXT OLS4000® 3D laser confocal microscope, Japan), surface morphology (scanning electron microscope EVO 10 - MEV, Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany); and flexural strength (Universal Testing Machine DL 2000, EMIC) was done. The data that presented normal distribution were analyzed by ANOVA and post-hoc Tukey test; Data that presented non-normal distribution were analyzed by the Kruskal-Wallis and Dunn test (&alpha;= 0.05). The results showed that hypochlorite reduced the CFU of the three microorganisms to zero, the solution of Ricinus communis and Efferdent peroxide had an average action against Candida glabrata (p <0.001) and Streptococcus mutans (p = 0.001), respectively. The solution of Ricinus communis showed color changes (p = 0.030), classified as &ldquo;light&rdquo; according to NBS; (p <0.001), and higher values of surface roughness, when analyzed by the rugosimeter (p = 0.006) and 3D microscope (p = 0.040), and flexural strength (p <0.001). The major change in surface morphology (SEM) was found in the Efferdent peroxide group. It can be concluded that the 0.20% sodium hypochlorite solution was the most effective denture cleanser since it presented antimicrobial action against the three micro-organisms evaluated Candida albicans, Candida glabrata, and Streptococcus mutans, and did not cause clinically significant changes on the heat-polymerized acrylic resin

Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de revestimentos comestíveis na qualidade de mamão \'Formosa\' minimamente processado durante armazenamento a 5°C por 15 dias. Os tratamentos foram: o controle, e os seguintes revestimentos: amido de arroz 3%, alginato de sódio 0,5% e carboximetilcelulose 0,25%. O uso de revestimentos causou alterações nos parâmetros físicos, físico-químicos e microbiológicos do mamão minimamente processado, quando comparado ao controle. As alterações mais importantes foram: menor contagem de coliformes totais; menor respiração dos mamões tratados com amido de arroz e maior dos tratados com carboximetilcelulose, ao longo do tempo; menor descoloração da polpa dos frutos ao longo do armazenamento; maior manutenção da firmeza das amostras tratadas com carboximetilcelulose; e redução do teor de sólidos solúveis e aumento da acidez titulável. Os revestimentos não afetaram os atributos sensoriais. Como a maioria dos efeitos positivos das coberturas ocorreu no 12° e 15° dias e, considerando o custo da tecnologia relacionado ao preço dos revestimentos, a melhor opção, até 9 dias de armazenamento, consiste em fazer apenas uma boa sanitização dos frutos, como feito no controle. No entanto, se o interesse for preservar a vida útil dos mamões por um período maior, até 15 dias, os revestimentos testados podem ser utilizados com resultados satisfatórios. / This study aimed to evaluate the effect of edible coatings on the quality of minimally processed \'Formosa\' papaya during storage at 5°C for 15 days. The treatments were: the control, and the following coatings: rice starch 3%, sodium alginate 0.5% and carboxymethylcellulose 0.25%. The use of coatings caused changes in the physical, physicochemical and microbiological parameters of minimally processed papaya, when compared to control. The most important changes were: lower counts of total coliforms; lower respiration of papayas treated with rice starch and higher of those treated with carboxymethylcellulose over time; less fruit pulp discoloration during storage, increased firmness maintenance of samples treated with carboxymethylcellulose; and reduction of soluble solids and increased acidity. The coatings did not affect the sensory attributes. Since most of the positive effects of the coatings occurred at the 12th and 15th days, and considering the technology cost related to the price of coatings, the best option, until 9 days of storage, is just to do a good sanitization of fruits such as that of control samples. However, if the interest is to preserve the shelf life of papayas for a longer period, up to 15 days, the coatings tested could be used with satisfactory results.

O gênero Methylobacterium é composto por bactérias de coloração rósea, metilotróficas facultativas (PPFM - pink-pigmented facultative methylotrophic), que podem fixar nitrogênio, nodular a planta hospedeira, produzir o fitohormônio citocinina e as enzimas pectinase e celulase, podendo dessa forma promover o crescimento vegetal devido à disponibilidade de nitrogênio e à indução de resistência sistêmica. Methylobacterium spp. têm sido descritas como endófitos ou epífitas em diferentes plantas hospedeiras, onde a sua colonização e distribuição no hospedeiro podem ser influenciadas pelo genótipo da planta ou por interações com outros microrganismos associados ao hospedeiro. Neste contexto, poucos trabalhos têm sido desenvolvidos visando um melhor entendimento da interação Methylobacterium-planta e da diversidade deste gênero bacteriano que tem sido isolado de diferentes plantas hospedeiras, exercendo diferentes funções ainda pouco conhecidas. Portanto, este trabalho tem como objetivo estudar a diversidade genética de Methylobacterium spp., por meio do seqüenciamento parcial dos genes 16S rRNA e mxaF; analisar os genes de responsáveis pela interação da Methylobacterium com a planta hospedeira e analisar os genes envolvidos na interação Methylobacterium (endófito)- Xylella fastidiosa (patógeno). Os resultados mostraram que existe uma resposta adaptativa de Methylobacterium spp. específica para cada planta hospedeira. Da mesma forma, foi observado que esta adaptação específica da bactéria à planta, também pode levar à seleção de genótipos específicos para cada planta hospedeira, embora eventos aleatórios também possam ser responsáveis pela diversidade de Methylobacterium na planta hospedeira. Na análise de expressão gênica da interação Methylobacterium-planta, foi observado que o gene relacionado ao metabolismo do metanol (mxaF) não apresentou mudança no padrão de expressão. Genes relacionados a estresse crtI (estresse sentido pela bactéria) e acdS (estresse sentido pela planta), tiveram suas expressões reduzidas na presença da planta, mostrando que a presença de exsudados das plantas não representou um estresse ao desenvolvimento bacteriano. Os genes relacionados à patogenicidade patatin e phoU não foram alterados, confirmando que Methylobacterium é um endófito, e possuem expressão induzida de tais genes quando interagindo com a planta hospedeira. Os resultados permitem concluir que nas condições avaliadas os exsudados das plantas não causam estresse à bactéria (SR1.6/6). Por meio da análise de expressão gênica in vitro de X. fastidiosa em co-cultivo com M. mesophilicum, foi observado que este fitopatógeno vascular apresentou diminuição do crescimento e da formação de biofilme. Os resultados aqui apresentados mostram que a diversidade deste grupo de endófitos é parcialmente determinada pela planta hospedeira, onde tais bactérias interagem tanto com a planta como com outros grupos, como fitopatógenos presentes neste nicho. / The genus Methylobacterium, constituted by PPFMs - pink-pigmented facultative methylotrophic, are able to fix nitrogen, nodule the host plant, produce cytokines and enzymes involved in induction of systemic resistance such as pectinase and cellulase, inducing plant growth. Methylobacterium sp. has been described as endophyte or epiphyte in different host plants, where the colonization and distribution on the host can be influenced by plant genotype or by interaction with other microorganisms associated to the host. In this context, few studies aims the better understanding of the diversity of this genus in different host, the interaction Methylobacterium-plant, and the interaction Methylobacterium-other bacteria. Therefore, this study aims to study the genetic diversity of Methylobacterium spp., by sequencing the 16S rRNA and mxaF gene; to analyze the genes responsible for the Methylobacterium-plant host interaction and to analyze the genes involved in Methylobacterium (endophyte) - Xylella fastidiosa (pathogen) interaction. Results show differential adaptive responses of Methylobacterium spp. in distinct plant species. However, the clustering according to the host plant was observed for a subset of isolates, suggesting that this diversity could be driven by stochastic events, although plant genotype may contribute to this diversity. Analyzing the Methylobacterium-plant interaction gene expression it was observed that genes related to metabolism of methanol (mxaF) was not amended. The genes related to stress such as crtI (stress sensed by the bacteria) and acdS (stress sensed by the plant) had its expression reduced with the plant showing that the plant exudates did not represent a stress to the bacteria development. The genes related to pathogenicity like patatin and phoU were not amended, confirming that Methylobacterium is an endophyte that do not induce when the bacteria interacts with the plant host. Using a genetic expression analyses of X. fastidiosa in vitro in co-cultive with M. mesophilicum, it was seen that this phytopathogen presented the growth and biofilm formation reduction. These results show that the diversity of this endophyte group is partially determinate by the plant host, where this bacterium interacts with the plant and with other groups, such as phytopathogen present in this niche.

Methylobacterium mesophilicum SR1.6/6 é uma bactéria endofítica isolada de ramo de citros previamente esterilizado superficialmente. Esta bactéria possui a capacidade de associar-se com uma ampla variedade de espécies e tecidos de plantas, principalmente nas raízes, mediado pela formação de biofilme e superfícies do hipocótilo de plântulas in vitro. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e a aplicação de um modelo para o estudo in vitro da associação entre esta bactéria e plântulas de soja. Metodologias de genômica e transcriptômica foram aplicadas para a obtenção do draft genômico desta bactéria e de um amplo perfil de sequências expressas, obtidas em dois tratamentos distintos; i) células de biofilme células bacterianas aderidas às raízes das plântulas removidas por sonicação, e ii) células planctônicas células bacterianas em suspensão (i.e. interagindo somente com exsudados radiculares). Os dados genômicos obtidos por 454-pirosequenciamento resultaram em uma cobertura de 37 vezes o tamanho do genoma e geraram 242 contigs. Entre estes, 187 contigs grandes representaram 96% do genoma (tamanho estimado de 6.8 Mb), com um conteúdo GC de 69.5%. Considerando a análise da expressão gênica, um procedimento para monitorar a aderência das células bacterianas às raízes das plântulas foi realizado por meio de microscopia eletrônica de varredura de amostras de raízes coletadas durante o experimento (i.e. 24, 48 e 72h após a inoculação). As células bacterianas obtidas em cada tratamento foram inicialmente submetidas à extração de RNA total, seguida de um processo de enriquecimento de mRNA e sequenciamento por meio da tecnologia de 454-pirosequenciamento (RNA-Seq). O amplo perfil de expressão gênica obtido foi mapeado no draft genômico, resultando em um total de 1.930 clusters gênicos. Posteriormente, estes clusters foram filtrados de acordo com sua abundância e ocorrência diferencial em cada tratamento, resultando em 280 genes diferencialmente expressos. Funções relacionadas ao metabolismo de etanol/metanol, divisão celular, resposta ao estresse oxidativo, produção de sideróforos, biossíntese de peptidoglicanos e hopanóides foram induzidas nas células bacterianas aderidas às raízes das plântulas, enquanto que genes relacionados ao metabolismo essencial das células foram observados principalmente nos tratamentos controle e planctônico. Estes dados fornecem uma base para estudos relacionados a mecanismos moduladores da interação bactériaplanta, distinguindo significativamente os tratamentos biofilme e planctônico, mostrando assim que o contato físico é essencial para o sucesso da interação em estudo. Por fim, estas análises permitiram uma ampla visualização de perfis de expressão gênica desta bactéria, utilizando o draft genômico primeiramente obtido como base para o estudo desta interação com a planta hospedeira. Estudos futuros podem ser desenvolvidos visando caracterizar os mecanismos adaptativos desta bactéria, como seu metabolismo metilotrófico e outros metabolismos específicos, os quais podem dar suporte ao comportamento endofítico deste organismo. / Methylobacterium mesophilicum strain SR1.6/6 is an endophytic bacterium, which has originally been isolated from surface-sterilized healthy citrus branch. This bacterium is able to associate with a range of plant species, rather in the roots, mediated by a biofilm structure, and in hypocotyl surfaces of in vitro seedlings. The aim of the present study was the development and application of a model to study in vitro the association between this bacterium and soybean seedlings. Genomic and transcriptomic approaches were applied resulting a draft of this bacterium genome and a broad profile of mapped mRNA sequences obtained in two different treatments; i) biofilm cells root adhered bacterial cells were removed by sonication, and ii) planktonic cells bacteria cells in suspension (i.e. interacting only with root exudates). Genomic data, obtained by 454-pyrosequencing have had an average depth of 37-fold coverage of the genome and yielded 242 contigs. Among these, 187 large contigs represented 96% of the genome sequence (estimate size of 6.8 Mb) with a GC content of 69.5%. Concerning the gene expression survey, the process to monitor the adherence of bacteria cells to the roots was performed by scanning electron microscopy of roots collected along the experiment (i.e. 24, 48 and 72 hours after inoculation). Bacterial cells obtained in each treatment were firstly submitted to RNA extraction, followed by mRNA enrichment and RNA-Seq using 454-pyrosequencing technology. The broad gene expression profile obtained was mapped into the drafted genome, resulting in a total of 1.930 gene clusters. After that, these clusters were filtered according to their abundance and differential occurrence in each treatment resulting in 280 differential expressed genes. Functions related to methanol/etanol metabolism, cell division, oxidative stress response, siderophore production, peptidoglycan and hopanoid biosynthesis were induced in bacterial cells adhered to plant roots, while genes related to essential cell metabolism were observed mostly in control and planktonic treatment. Also, these data provide insights into the mechanisms modulating plant microbe-interaction, significantly distinguishing biofilm and planktonic treatment, showing that the physical contact is a crucial step on plant-microbe interactions. In conclusion, results allowed a strongly supported analysis of gene expression, based on the genome draft of an endophytic bacterium interacting with the host plant. Further studies should focus on the adaptive mechanisms present in this bacterium, like the methylotrophic lifestyle and other specific metabolisms which might support its behavior as an endophytic bacterium.

A persistência bacteriana correlacionada à formação de biofilmes bacterianos é, há algum tempo, fonte de grande preocupação médica em virtude de sua ampla associação com a dificuldade de tratamento de infecções crônicas. Por outro lado, as perspectivas de utilização de biofilmes bacterianos em novas aplicações biotecnológicas e até mesmo para fins terapêuticos são promissoras. Há, portanto, grande interesse em compreender os mecanismos que levam as células bacterianas a deixar o estado planctônico, de vida livre, e associarem-se nesses conglomerados celulares altamente complexos. Ao longo das últimas décadas, o segundo mensageiro c-di-GMP &ndash; em conjunto com as moléculas que catalisam sua síntese (diguanilato ciclases) e sua degradação (fosfodiesterases) e seus receptores &ndash; estabeleceu-se como um elemento central de regulação de uma série de respostas celulares que determinam a formação ou a dispersão de biofilmes. Curiosamente, as proteínas que participam do metabolismo deste segundo mensageiro estão, frequentemente, codificadas múltiplas vezes em um mesmo genoma bacteriano. Em vista dessa observação, estudos mais recentes apontam que, para reger paralelamente uma variedade tão ampla de fenótipos, este sistema opera em modo de alta especificidade de sinalização e que, portanto, o sinal metabolizado por determinados conjuntos de diguanilato ciclases e fosfodiesterases tem alvos celulares específicos. Evidências robustas, porém isoladas até o momento, apontaram que um dos meios pelo qual ocorre a segregação entre sinal produzido e alvo específico é a interação direta entre as proteínas componentes das vias de sinalização. Mais, demonstrou-se que, em algumas vias, a transmissão de sinal ocorre exclusivamente via interação proteica, dispensando a intermediação do sinalizador em si. Para avaliar a validade e relevância global deste mecanismo, propôs-se, neste estudo, a investigação da rede total de interações entre as proteínas tipicamente associadas às vias de sinalização por c-di-GMP em Pseudomonas aeruginosa, utilizando ensaios de duplo-hibrido bacteriano. Para tanto, foram construídas duas bibliotecas de DNA direcionadas e foram feitos testes de interação de forma estratégica para possibilitar o esgotamento e averiguação de todas as possíveis interações entre as proteínas alvo identificadas. O resultado obtido, um mapa inicial, porém abrangente, da rede de interações proteicas em P. aeruginosa, indica uma grande probabilidade de que os mecanismos previamente descritos sejam realmente recorrentes e relevantes para o intermédio da sinalização nesse organismo. Algumas das interações mais robustas encontradas são bastante interessantes e serão, em estudos futuros, mais extensivamente estudadas. / Persister bacteria are correlated to biofilm formation and have been a source of great medical concern due to its close association with the impairment of traditional treatment in combating chronic infections. On the other hand, using bacterial biofilms to create original biotechnological applications or even as a means of therapeutic treatment in medical settings constitutes a promising prospect. There is, therefore, a great interest in understanding the mechanisms that allow bacteria to leave the free-living planktonic lifestyle and associate in these highly complex cellular aggregates. Over the last decades, the second messenger c-di-GMP &ndash; and also the molecules involved in its synthesis (diguanylate ciclases) and degradation (phosphodiesterases) along with its receptors &ndash; has been established as a key element implicated in regulation of a series of cellular responses that determine biofilm formation or dispersion. Curiously, the proteins that play a part in the metabolism of this second messenger are frequently coded multiple times in single bacterial genomes. Taking this into account, recent studies indicate that, in order to control such a wide range of phenotypes, this system operates via high specificity of signaling &ndash; which means that the signal metabolized by a certain set of diguanylate ciclases and phosphodiesterases has specific cellular targets. Robust but yet isolated evidence indicate that a means by which a signal is segregated with its correlated phenotypic response is through direct protein-protein interaction involving the components of these signaling pathways. Even more, there has been strikingly evidence that, in some of these pathways, signal transduction occurs exclusively through protein-protein interaction, entirely dismissing any mediation by the signal molecule. In order to validate and evaluate the global relevance of this type of mechanism, this study proposed the investigation of the entire network of interactions between proteins typically associated with c-di-GMP signaling pathways of Pseudomonas aeruginosa by employing bacterial two-hybrid system assays. To make that possible, two DNA libraries were constructed and interaction essays were performed in a strategic way so that all possibilities of interaction between target proteins were explored. The results obtained from these experiments allowed the construction of a broad map of interactions that, although still primitive, indicates that, chances are, the mechanisms previously described are both recurrent and relevant to signaling regulation in this organism. Some of the interaction partners found are particularly interesting and will be further investigated in future studies.

Pseudomonas aeruginosa é uma proteobactéria do grupo gama, que pode se comportar como um patógeno oportunista. A linhagem PA14 apresenta duas ilhas de patogenicidade. A maior delas, PAPI-1, contém dois grupos de genes envolvidos com virulência, transcritos de maneira oposta e que estão entre duas seqüências repetidas diretas. O primeiro grupo compreende quatro genes dispostos em dois operons, que codificam para proteínas de sistemas de dois componentes (PvrS, PvrR, RcsC e RcsB). PvrS e RcsC são proteínas sensoras híbridas, que apresentam domínios de histidina-quinase e de reguladores de resposta. PvrR é um regulador de resposta com um domínio EAL com atividade de fosfodiesterase de diGMP cíclico e RcsB apresenta um domínio de ligação a DNA, além de um domínio fosfoaceptor. O outro grupo é composto de cinco genes, cupD1 a cupD5, que codificam para uma fímbria do tipo chaperone-usher e que apresenta alta similaridade com cupA, envolvido na formação de biofilme em outras linhagens de P. aeruginosa. Trabalhos anteriores mostraram que pvrS, pvrR, rcsC, rcsB e cupD2 estão relacionados com a virulência de PA14. Como estes grupos de genes parecem ter sido inseridos na ilha em um único evento de recombinação, este trabalho investigou se os sistemas de dois componentes estão relacionados com a regulação da expressão de cupD. Foi observado que a expressão de cupD é maior a 28ºC do que que a 37ºC e é influenciada positivamente pelo regulador global de expressão, MvaT, uma proteína tipo H-NS. Ensaios de &#946;-galactosidase a partir de uma fusão de transcrição mostraram que a atividade promotora de cupD é cerca de 50% menor numa linhagem com deleção em rcsB em relação à linhagem selvagem. Nenhuma diferença consistente foi observada entre as linhagens com deleções em pvrS, pvrR, rcsC e rcsB e PA14 em relação a motilidade dos tipos swarming, swimming ou twitching ou à formação de biofilme. A linhagem de P. aeruginosa PA14 superexpressando RcsB mostrou níveis exacerbados de mRNA de cupD1, sendo a atuação de RcsB específica em cupD, já que os outros grupos de genes cup presentes em PA14 não mostraram a mesma variação na expressão, conforme analisado por RT-PCR quantitativo. Essa linhagem mostrou também um aumento na formação de biofilme, sem que a motilidade fosse alterada. Ainda visando elucidar os mecanismos de regulação de cupD, linhagens que superexpressam pvrR também foram analisadas quanto a estes fenótipos. Nesse caso, a superexpressão de pvrR diminuiu a formação de biofilme, conforme esperado, aumentou a motilidade do tipo swarming, porém não alterou a expressão de cupD. Os dados do presente trabalho demonstraram que a cupD é regulado pelos genes do sistemas de dois componentes adjacentes a ele e que o ativador de transcrição RcsB está relacionado com a formação de biofilme em tubos de vidro, provavelmente via a fímbria CupD. / Pseudomonas aeruginosa is a &#947;-proteobacteria that can behave as an opportunistic pathogen. The strain PA14 carries two pathogenicity islands, the largest of them, PAPI-1, contains two gene clusters between two direct repeat sequences that are transcribed in opposite directions and are involved in virulence. The first group consists of four genes arranged in two operons encoding two-component system proteins (PvrS, PvrR, RcsC and RcsB). PvrS and RcsC are hybrid sensor proteins, which contain domains of histidine kinase and response regulator domains. PvrR is a response regulator with a phosphodiesterase EAL domain and RcsB presents a C- terminal HTH DNA biding domain, in addition to a phosphoaceptor domain. The other group is composed of five genes, cupD1-5, that encodes components and assembly factors of a putative fimbrial CupD, which has high similarity with CupA, involved in the biofilm formation in other P. aeruginosa strains. Earlier work showed that pvrS, pvrR, rcsC, rcsB and cupD2 are related to the virulence of PA14. As these groups of genes appear to have been inserted on the island in a single event of recombination, this study investigated whether the two-component systems are related to the regulation of cupD expression. It was observed that cupD promoter activity is higher at 28oC than at 37oC and it is positively influenced by the global regulator, MvaT, a H-NS like protein. A lacZ transcriptional fusion showed about 50% less promoter activity of cupD from a strain with deletion in rcsB as compared to PA14. No consistent differences were found among the strains with deletions in pvrS, pvrR, rcsC and rcsB and PA14 on swarming, swimming and twitching motilities or biofilmsformation. A strain overexpressing overexpression showed heigher levels of cupD1mRNA of, and the role of RcsB as an activator is specific to cupD, as the other groups of cup genes present in PA14 did not show the same variation in the expression, as analyzed by quantitative RT-PCR. This strain also showed an increase in biofilm formation. In further assays aiming to elucidate the mechanisms of regulation of cupD, a strains overexpressing pvrR was also analyzed. Overexpression of pvrR decreased the formation of biofilm, as expected, and increased swarming motility, but did not alter the expression of cupD. The data from this study demonstrated that cupD is regulated by RcsB, and that this transcriptional activator is involved in the formation of biofilm in glass tubes, probably via CupD fimbriae.

A assistência em Unidade de Terapia Intensiva (UTI) é constantemente desafiada por infecções, que resultam no aumento da morbimortalidade, no tempo de internação e nos custos. Objetivos: avaliar os paciente críticos com tubo endotraqueal submetidos à ventilação mecânica na perspectiva clínica e microbiológica com a finalidade de determinar a dispersão de Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulase-negativa e Pseudomonas aeruginosa na assistência respiratória destes pacientes. Assim, analisou aspectos quantitativos, perfil de sensibilidade aos antibióticos, similaridade genética e formação de biofilme em tubo traqueal considerando a presença ou não de PAVM. Trata-se de um estudo observacional prospectivo realizado na UTI de um hospital de emergência no interior do Estado de São Paulo. A coleta de dados clínicos envolveu pacientes adultos com período 48 horas de intubação endotraqueal em ventilação mecânica mediante consentimento do responsável. As amostras foram procedentes da saliva, secreção traqueal e tubo traqueal dos referidos pacientes; e da luvas utilizadas na aspiração do tubo endotraqueal. Utilizou-se no processamento das amostras recursos clássicos e avançados da microbiologia como Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Sequence (ERIC-PCR), Eletroforese em Campo Pulsado e a microscopia eletrônica de varredura. A análise estatística pelo SPSS foi subsidiada em medidas de tendência central, tabelas de contingências, regressão múltipla e kappa, p<0,05. Na avaliação clínica dos 44 pacientes críticos, 34 (77,32%) eram masculinos, idade média de 39,9, e o motivo de hospitalização 19 (43,2%) foi devido à traumas. O período de hospitalização foi em média 10,9 dias (DP 9,3) e de permanência do tubo endotraqueal de 6,6 dias (DP 3,3). A ocorrência de infecção hospitalar foi de 31,2%, sendo que 15 (34,1%) eram PAVM; e 34,5% representaram o percentual de óbito. O período de permanência do tubo endotraqueal 8 dias foi fator de risco para PAVM (RR 4,00, p < 0,001) e regressão múltipla. Na análise microbiológica verificou-se que a presença das cepas foi variável em termos quantitativos segundo sua procedência. Houve predominância de contaminação nas luvas direitas com as cepas de Staphylococcus coagulase-negativa. A prevalência de resistência a oxacilina foi de 16,1% para Staphylococcus aureus e 22,6% Staphylococcus coagulasenegativa. Em termos de similaridade genética observou-se apenas um caso de Pseudomonas aeruginosa isoladas da saliva e tubo traqueal de um mesmo paciente. E, em 12 cepas evidenciou-se uma forte relação genética procedentes da saliva, do tubo traqueal. Dos Staphylococcus aureus e Staphylococcus coagulase-negativa ambos resistente a oxacilina foram similares as cepas procedentes da saliva e secreção traqueal. O biofilme presente nos 30 tubos apresentou estruturas celulares e microbianas específicas como: hemácias, rede de fibrina, leucócitos, além de cocos, bacilos, filamentos e leveduras, dentre outras. Embora com número reduzido de amostras os resultados sinalizaram para a possibilidade de dispersão microbiana endógena tendo a cavidade orofaríngea como o principal reservatório. Outras investigações em diferentes UTIs, em termos de microbiota, condições clínicas e institucionais são promissoras para que se possa de fato ampliar as evidências em torno do risco de infecção respiratória do paciente crítico em ventilação mecânica. / Care in Intensive Care Units (ICU) is constantly challenged by infections, which result in the increase of morbimortality, hospitalization length of stay and costs. Objectives: to assess critical patients with endotracheal tube on mechanical ventilation in the clinical and microbiological perspective, aiming to determine the diffusion of Staphylococcus aureus, coagulase-negative Staphylococcus and Pseudomonas aeruginosa in respiratory care to these patients. Quantitative aspects, sensitivity profile to antibiotics, genetic similarity and biofilm formation in tracheal tube considering the presence of mechanical ventilator-associated pneumonia (MVAP) were analyzed. It is an observational and prospective study carried out in the ICU of an emergency hospital in the interior of the state of São Paulo. Collection of clinical data involved adult patients in a period 48 hours of endotracheal intubation in mechanical ventilation, with the consent of the responsible person. Samples were collected from saliva, tracheal secretion and tracheal tube of the mentioned patients; and from the gloves used in aspiration of the endotracheal tube. Classic and advanced microbiological resources such as Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Sequence (ERIC-PCR), Pulsed-Field Electrophoresis and electron scanning microscopy were used to analyze samples. Statistical analysis was done using SPSS and was supported by central tendency measures, contingency tables, multiple regression and kappa, p<0.05. The clinical evaluation showed that, of the 44 critical patients, 34 (77.32%) were male, with average age of 39.9 years. Trauma was the reason for hospitalization of 19 (43.2%) patients. The average period of hospitalization was 10.9 days (SD 9.3) and the period with endotracheal was 6.6 days (SD 3.3). The occurrence of cross infection was 31.2%, of which 15 (34.1%) were MVAP; and 34.5% represented the percentage of deaths. Length of stay of endotracheal tube 8 days was risk factor for MVAP (RR 4.00, p < 0.001) and multiple regression. Microbiological analysis showed that the presence of strains varied in quantitative terms according to their origin. There was predominance of contamination in right gloves with strains of coagulase-negative Staphylococcus. The prevalence of oxacillin resistance was 16.1% for Staphylococcus aureus and 22.6% for coagulase-negative Staphylococcus. As to the genetic similarity, it was observed only one case of Pseudomonas aeruginosa isolated from the saliva and tracheal tube of a same patient. In 12 strains, strong genetic relation from saliva and tracheal tube was evidenced. Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus, both oxacillin resistant, were similar to strains from saliva and tracheal secretion. Biofilm present in 30 tubes presented specific cellular and microbial structures, such as: red cells, fibrin network, leukocytes, besides cocci, rods, threads and yeasts, among others. Although with a reduced number of samples, results show the possibility of endogenous microbial diffusion, with the oropharynx cavity as the main reservoir. Further research in different ICUs, in terms of microbiota, clinical and institutional conditions, can broaden evidences regarding the risk of respiratory infection of critical patients on mechanical ventilation.

A manutenção das próteses implantossuportadas e da saúde dos tecidos peri-implantares está diretamente relacionada ao sucesso do tratamento reabilitador. O objetivo deste trabalho foi avaliar, por meio de estudo clínico randomizado, a eficácia de um método experimental (escovação associada à irrigação oral), na manutenção dos tecidos peri-implantares e overdentures. Foram analisadas capacidade de remoção de biofilme e manutenção da saúde dos tecidos orais, ação antimicrobiana e satisfação do paciente. Foram selecionados 38 pacientes usuários de prótese total superior convencional e overdenture inferior, retida por implantes ou mini-implantes e sistema de encaixe tipo o\'ring. Os pacientes utilizaram os seguintes métodos: ES (Controle): método mecânico da escovação - escova específica para próteses totais, escova dental de cerdas macias e dentifrício e WP (Experimental): associação da escovação com a irrigação oral (Waterpik). Os pacientes foram orientados a higienizar suas próteses e tecidos peri-implantares, por meio do método da escovação, por 2 minutos, 3 vezes ao dia, sendo que no método experimental, os pacientes utilizaram a irrigação oral, uma vez ao dia, após a escovação, direcionando o jato de água à margem gengival e região dos componentes protéticos das overdentures. Todos os pacientes utilizaram os dois métodos de higiene, em uma sequência aleatória, por um período de 14 dias, com um período intercalado de 7 dias de wash out. As avaliações foram realizadas antes (baseline) e após a utilização de cada método. A capacidade de remoção de biofilme e a manutenção da saúde oral dos tecidos foram avaliadas por meio do Índice de Placa Modificado (IP), Índice Gengival (IG), Profundidade de Sondagem (PS) e Índice de Sangramento à Sondagem (SS). Para a análise da ação antimicrobiana, o biofilme subgengival foi coletado por meio de cones de papel e biofilme presente nos componentes das overdentures por meio de microbrush, e as amostras coletadas foram processadas pela técnica de hibridização DNA Checkerboard (39 espécies microbianas avaliadas). Os pacientes responderam a um questionário específico por meio de Escala Visual Analógica (EVA) de 100,0 mm, após o uso de cada método. Os dados relacionados aos parâmetros clínicos e à ação antimicrobiana foram analisados por meio do teste de Friedman (&alpha;=0,05), seguido de comparações realizadas por meio do teste de Wilcoxon; as comparações entre implantes convencionais e mini-implantes foram realizadas por meio do teste de Mann-Whitney (&alpha;=0,05). A análise das respostas ao questionário de satisfação foi realizada por meio do teste de Wilcoxon (&alpha;=0,05). Os resultados mostraram que, quanto aos parâmetros clínicos, houve diferença estatisticamente significante entre os valores obtidos no baseline e os valores após os métodos avaliados (p<0,001); entre os métodos ES e WP, não houve diferença significante (IP, IG e PS: p=1,000; SS: p=0,828); houve diferença estatisticamente significante entre os diferentes tipos de implantes apenas do IP após ES (p<0,05). Houve diferença estatisticamente significante entre os métodos (p<0,05), quando comparados os valores da quantidade total de células microbianas presentes no biofilme subgengival, sendo WP mais efetivo que ES (p<0,05), porém não houve diferença entre baseline e WP (p>0,05); considerando os micro-organismos avaliados, WP promoveu redução mais efetiva que ES apenas da espécie C. rectus (p=0,001). A quantidade total de células microbianas presentes nos componentes das overdentures nas avaliações foi semelhante (p=0,607) e a microbiota identificada apresentou-se qualitativamente semelhante após cada um dos métodos. Não houve diferença estatisticamente significante entre os diferentes tipos de implantes quanto ao total de células microbianas presentes no sulco peri-implantar e nos componentes das overdentures, identificadas em cada uma das avaliações (p>0,05). As médias das respostas ao questionário de satisfação após ambos os métodos foram altas (acima de 80,0 mm) para todas as questões, porém não houve diferença estatisticamente significante entre as respostas dadas após o uso de ES e WP (p>0,05). Concluiu-se que o método experimental foi eficaz na redução dos parâmetros clínicos avaliados; apresentou ação antimicrobiana mais efetiva na redução da quantidade total de micro-organismos presentes no biofilme subgengival; porém, não apresentou ação antimicrobiana frente aos micro-organismos presentes nos componentes protéticos das overdentures; e proporcionou alto nível de satisfação do paciente. / The maintenance of implant-supported prostheses and peri-implant health is directly related to the success of rehabilitation treatment. The aim of this study was to evaluate, through randomized clinical trial, the efficacy of an experimental method (brushing associated with oral irrigation) in the maintenance of the peri-implant tissues and overdentures. Biofilm removal capacity and oral tissues health maintenance, antimicrobial action and patient satisfaction were analyzed. Thirty-eight patients, users of conventional maxillary complete denture and mandibular overdenture retained by implants or mini-implants and o\'ring-retained system, were selected. The patients utilized the following methods: MB (Control): mechanical brushing method specific brush for dentures, soft bristle toothbrush and dentifrice, and WP (Experimental): association of mechanical brushing with oral irrigation (Waterpik). Patients were instructed to clean their dentures and peri-implant tissues, by means of brushing method for 2 minutes, 3 times a day, and in the experimental group, patients used the oral irrigation, once a day, after brushing, directing the water jet to the gingival margin and the region of the prosthetic components of the overdentures. All patients used both hygiene methods in a random sequence for a period of 14 days, with a 7-day wash-out interposed period. The evaluations were performed before (baseline) and after using each method. Biofilm removal capacity and oral tissues health maintenance were evaluated through Modified Plaque Index (PI), Gingival Index (GI), Probing Depth (PD), and Bleeding on Probing Index (BP). For the antimicrobial action analysis, the subgingival biofilm was collected by means of sterile paper cones and the biofilm present on the overdentures components by microbrush, and the collected samples were processed by the Checkerboard DNA hybridization technique (39 microbial species evaluated). Patients answered to a specific questionnaire using the Visual Analogue Scale (VAS) of 100.0 mm, after application of each method. The data related to clinical parameters and antimicrobial activity were analyzed using the Friedman test (&alpha;=0.05), followed by comparisons using the Wilcoxon test; comparisons between conventional implants and mini-implants were performed using the Mann-Whitney test (&alpha;=0.05). The analysis of the satisfaction questionnaire responses was performed using the Wilcoxon test (&alpha;=0.05). The results showed that, regarding clinical parameters, there was a statistically significant difference between the values obtained at baseline and the values after the evaluated methods (p<0.001); between the MB and WP methods there was no significant difference (PI, GI and PD: p=1.000; BP: p=0.828); there was a statistically significant difference between the different types of implants only of PI after MB (p<0.05). There was a statistically significant difference between the methods (p<0.05) when comparing the values of the total amount of microbial cells in the subgingival biofilm, WP being more effective than MB (p<0.05), but there was no difference between baseline and WP (p>0.05); considering the evaluated microorganisms, WP promoted a more effective reduction than MB only of the C. rectus species (p=0.001). The total amount of microbial cells present in the components of overdentures in the evaluations was similar (p=0.607) and the identified microbiota appeared qualitatively similar after each method. There was no statistically significant difference between the different types of implants for the total microbial cells in the peri-implant sulcus and in the overdentures components identified in each of the evaluations (p>0.05). The means of the satisfaction questionnaire responses after both methods were high (above 80.0 mm) for all the questions, but there was no statistically significant difference between the answers given after the use of ES and WP (p>0.05). It was concluded that the experimental method was effective in reducing the clinical parameters evaluated; presented more effective antimicrobial action in reducing the total amount of microorganisms present in the subgingival biofilm; however, showed no antimicrobial action against microorganisms present in the prosthetic components of the overdentures; and provided high level of patient satisfaction.

Um método baseado na extração de rRNA, seguido de RT-PCR rRNA 16S, clonagem e ARDRA foi otimizado e validado para a identificação das bactérias ativas em biofilmes. O método foi analisado primeiro com consórcios artificiais de três organismos. As etapas de clonagem e RT não causaram variações importantes na composição destes consórcios, do contrário da etapa de PCR, onde foi necessária a redução de 30 para 10 ciclos para limitar a distorção da proporção de templates. A análise de biofilmes reais indicou que clones dominantes podem ser identificados com o critério de ocorrência de >2% na biblioteca, mas que a reprodutibilidade de análises ainda é insatisfatória, possivelmente devido a fatores como a micro heterogeneidade espacial do biofilme, viés na reação de PCR e formação de mais de um clone de ARDRA por organismo. O armazenamento do biofilme a -20 °C por 2 meses não levou à alterações expressivas em sua composição. O perfil de clones detectado com o kit (Mo Bio) de extração de RNA foi muito diferente do perfil detectado com o método otimizado neste trabalho. / A method based on extraction of rRNA, followed by RT-PCR of 16S rRNA, cloning and ARDRA was optimized and validated for identification of bacteria active in biofilms. The method was first tested with artificial three-membered consortia. Cloning and RT did not lead to significant changes in the composition of the artificial consortia, but a reduction in cycle number in the PCR reaction from 30 to 10 was necessary for limiting the distortion in the proportion of amplicons relative to that of the templates. Analysis of real biofilms revealed that clones from active organisms occurred in frequencies >2% in the clone library, but reproducibility of analysis was unsatisfactory, probably due to factors such as the spatial heterogeneity of colonization of biofilms by microbes, PCR bias and more than one ARDRA clone per organism. Storage of biofilm samples at -20 °C for 2 months did not lead to important changes in composition. Very different clone profiles were obtained in the analysis of the same biofilm sample with the optimized method and with a kit (Mo Bio) for extraction of RNA.