A oviposição é um estágio vulnerável do ciclo de vida de carrapatos. Rhipicephalus microplus, como todos Ixodidae e Argasidae, possui uma glândula especializada, o órgão de Gené, que produz uma cera que é depositada na superfície do ovo durante a oviposição. Além de restringir a perda excessiva de água, a cera atua como uma barreira contra o ataque de organismos invasores. Em R.microplus, como em outros carrapatos, há poucos estudos demonstrando atividade antimicrobiana em ovos. Ainda mais, não há na literatura relato de atividade antibiofilme em ovos de carrapatos e nem mesmo em qualquer outro artrópode. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a hipótese da existência de mecanismos de defesa em ovos de R. microplus contra biofilmes bacterianos. O extrato água/metanol da cera dos ovos apresentou atividade contra o biofilme de Pseudomonas aeruginosa sem afetar a sua viabilidade. Esse extrato também demonstrou efeito antibiótico contra Staphylococcus epidermidis. Nós identificamos a molécula com ambas atividades (antibiofilme e antibiótica) como N-(3-sulfooxy-25-cholest-5-en-26-oyl)-L-isoleucina (boophiline). Na busca por possíveis mecanismos responsáveis pelo efeito antibiofilme de boophiline contra P. aeruginosa, 14 genes foram analisados por qRT-PCR. Boophiline inibe a expressão de fliC (flagelo) e cdrA (componente estrutural da matriz), cujos produtos são necessários para a formação do biofilme de P. aeruginosa. Monosfosfato de guanosina dimérico cíclico (c-di-GMP) é um importante segundo mensageiro característico de bactérias Gram-negativas. Altos níveis intracelulares de c-di-GMP promovem o estilo de vida séssil enquanto baixos níveis induzem o comportamento móvel. De acordo com essa afirmação, nós encontramos que boophiline aumenta a motilidade swarming de P. aeruginosa. Desta forma, nos questionamos se o mecanismo de ação de boophiline estaria envolvido com c-di-GMP já que o sistema quorum sensing não foi afetado pela molécula. Interessantemente, quando os níveis de c-di-GMP foram aumentados pela superexpressão de uma diguanilato ciclase, boophiline não inibiu efetivamente a formação de biofilme. Uma explicação para esse resultado é que boophiline interfere em uma via específica regulada por c-di-GMP, o que explicaria não termos obtido um decréscimo no nível total deste segundo mensageiro. Contrariamente, boophiline foi bactericida contra S. epidermidis. Mudanças morfológicas significativas foram observadas em células tratadas com a molécula, as quais foram severamente danificadas. Boophiline levou a formação anormal de septo, rompimento da membrana bacteriana e extravasamento do material intracelular. Adicionalmente avaliamos o potencial antibiofilme e anti-protozoário de filtrados de cultura obtidos de bactérias isoladas de tecidos de R. microplus. Quatorze filtrados de cultura bacteriano apresentaram notável atividade contra o biofilme de P. aeruginosa e S. epidermidis e foram citotóxicos contra Tritrichomonas foetus. Nosso trabalho é pioneiro em demonstrar a existência de proteção contra biofilmes em ovos de carrapatos bem como de bactérias associadas a carrapatos como produtoras de moléculas bioativas. Além disso, nós demonstramos que boophiline é uma nova molécula antibiofilme, sendo a primeira vez relatado na literatura que um composto age inibindo cdrA. Os dados obtidos em nosso estudo poderiam estimular novas abordagens em áreas como fisiologia e controle de artrópodes, genética e fisiologia de microrganismos e controle de biofilmes. / The oviposition is a vulnerable stage of the tick life cycle. Rhipicephalus microplus, as all Ixodidae and Argasidae, has a specialized gland, the Gene’s organ, which produce a wax that is smeared on egg surface during oviposition. In addition to restricting excessive water loss, wax acts as a barrier to attack by invading organisms. In R. microplus, as in other ticks, there are few studies showing antimicrobial activity in eggs. Moreover, there is no report of antibiofilm activity in tick eggs nor in any other arthropod. The objective of our study was to evaluate the hypothesis of the existence of defense mechanisms against bacterial biofilms in R. microplus eggs. The eggs wax water/methanol extract showed activity against Pseudomonas aeruginosa biofilm without affecting its viability. This extract also presented an antibiotic effect against Staphylococcus epidermidis. We have identified the molecule anti-biofilm and antibiotic as N-(3-sulfooxy-25-cholest-5-en-26-oyl)-L-isoleucine (boophiline). In the search for possible mechanisms responsible by antibiofilm effect of boophiline against P. aeruginosa, 14 genes were evaluated by qRT-PCR. We showed that boophiline inhibits the expression of fliC (flagellum) and cdrA (matrix structural component), whose products are necessary for biofilm formation in P. aeruginosa. Bis-(3’–5’)-cyclic dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP) is an important second messenger, characteristic of Gram-negative bacteria. High intracellular levels of c-di-GMP promote a sessile mode of growth, while low levels promote motile behavior. In line with this, we found that boophiline increases swarming motility, which raised the question whether it acts by altering c-di-GMP levels. Interestingly, when c-di-GMP levels were increased by overexpression of a diguanilate cyclase, boophiline no longer inhibited biofilm formation. One explanation for these results is that boophiline interferes with a specific c-di-GMP-regulated pathway, which would explain we have not obtained a decrease in the total level of this second messenger. Conversely, boophiline had a bactericidal effect against S. epidermidis. Significant morphological changes were observed in the boophiline-treated cells, which appeared to be severely damaged. Boophiline was found to cause abnormal septum formation, bacterial membrane disruption, and extravasation of intracellular material. Additionally, our work also aimed to evaluate the potential antibiofilm and anti-protozoa of culture filtrates obtained from bacteria isolated of R. microplus tissues. Fourteen bacterial culture filtrates showed remarkable activity against of P. aeruginosa and S. epidermidis biofilms, and were cytotoxic against Tritrichomonas foetus. Our work is pioneer in demonstrating the existence of protection mechanisms in tick eggs against biofilms, and ticks-associated bacteria as producers of bioactive molecules. Furthermore, we demonstrated that boophiline is a new antibiofilm molecule, and is the first reported in the literature that a molecule inhibits cdrA. The data obtained in our study could stimulate new approaches in areas such as the physiology and control of arthropods, the genetics and physiology of microorganisms, and biofilm control.

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2016-11-25T16:25:06Z No. of bitstreams: 2 Tese - Helder Fernandes de Oliveira - 2016.pdf: 15364016 bytes, checksum: 5f02981d26eeeb064647328615e844cc (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-11-28T17:41:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Helder Fernandes de Oliveira - 2016.pdf: 15364016 bytes, checksum: 5f02981d26eeeb064647328615e844cc (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-28T17:41:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Helder Fernandes de Oliveira - 2016.pdf: 15364016 bytes, checksum: 5f02981d26eeeb064647328615e844cc (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-11-17 / Objetive: Evaluate the antibacterial effect of reciprocating systems associated with sodium hypochlorite 2.5% and apple vinegar in infected root canals. Methods: Fifty human anterior teeth uniradicular were prepared, inoculated with E. faecalis and examined after sixty days. The teeth were randomly assigned to five groups: (1. WaveOne® 40.08; 2. Reciproc® 40.06; 3. Unicorne® 40.06; 4 and 5 positive and negative controls. For each experimental group (n = 10), five specimens were irrigated with sodium hypochlorite 2.5%, and five with apple vinegar. Bacterial growth was analyzed using turbidity of culture medium followed by UV spectrophotometry. The cleaning of dentinal walls was analyzed by scanning electronic microscopy (SEM). Results: All groups showed a significant reduction of the optimal density of the culture medium after the root canal preparation (p<0,05). No sanitizing strategy promoted the complete elimination of E. faecalis. In the analysis of cleaning the root surface, it was found that in none of the groups showed complete removal of debris, not being verified significant differences indifferent to analyzed thirds (p> 0.05). Conclusion: The reciprocating instruments (WaveOne®, Reciproc® and Unicorne®) and irrigating sodium hypochlorite solution 2.5% and apple cider vinegar have not been effective in eliminating E. faecalis complete in infected root canals. / Objetivo: Avaliar o efeito antibacteriano de sistemas reciprocantes associados ao hipoclorito de sódio 2,5% e ao vinagre de maça em canais radiculares infectados. Materiais e métodos: Cinquenta dentes humanos unirradiculares extraídos foram preparados, inoculados com Enterococcus faecalis e incubados a 37°C por sessenta dias. Os espécimes foram aleatoriamente divididos em 05 grupos sendo três experimentais e dois controles (1. WaveOne® 40.08; 2. Reciproc® 40.06; 3. Unicone® 40.06; 4. Controle positivo; Controle negativo). Para cada grupo experimental, cinco espécimes foram irrigados com hipoclorito de sódio 2,5% e cinco com vinagre de maçã. O crescimento bacteriano foi analisado pela turbidez do meio de cultura e espectrofotometria UV. A limpeza das paredes dentinárias foi analisada por microscopia eletrônica de varredura. Resultados: Todos os grupos mostraram redução significativa da densidade óptica do meio de cultura após o preparo do canal radicular (p<0,05). Nenhuma estratégia de sanificação promoveu a eliminação completa do E. faecalis. Na análise da limpeza da superfície radicular, foi verificado que, em nenhum dos grupos houve a remoção completa dos debris, não sendo verificadas diferenças significativas indiferente aos terços analisados (p>0,05). Conclusão: Os instrumentos reciprocantes (WaveOne®, Reciproc® e Unicorne®) e as soluções irrigadoras hipoclorito de sódio 2,5% e vinagre de maça não foram efetivos na completa eliminação do E. faecalis em canais radiculares infectados.

Porphyromonas gingivalis é um dos principais mircrorganismos associados à periodontite. O objetivo do presente estudo foi testar a hipótese de que a colonização por diferentes genótipos fimA de P.gingivalis resultaria em diferenças na resposta ao tratamento periodontal. Foram analisados 20 pacientes com periodontite crônica, fumantes, portadores de P.gingivalis, divididos em 2 grupos: 1 grupo recebeu tratamento periodontal mecânico (RAR) e o outro recebeu, além da RAR, antibioticoterapia (amoxicilina e metronidazol). O efeito do tratamento foi avaliado com relação a parâmetros clínicos, prevalência e níveis subgengivais de P. gingivalis e dos genótipos fimA II e fimA IV em estudo quantitativo por PCR em tempo real, antes e 180 dias após o tratamento. Os dados sugerem que RAR associado a antibiotioticoterapia sistêmica é mais eficiente na redução dos níveis de P.gingivalis do que apenas RAR. Não foram detectadas diferenças na resposta ao tratamento periodontal quanto à presença dos genótipos fimA II ou fimA IV em relação aos demais genótipos de P.gingivalis. / Porphyromonas gingivalis is one of the main mircrorganisms associate to periodontitis. The present study proposed to test the hypothesis that the colonization by different P.gingivalis genotypes fimA would lead to different results on periodontal treatment. Twenty chronic periodontitis patients, smokers, bearers of P. gingivalis was analyzed and divided in 2 groups: one group received mechanic periodontal treatment (SRP) and the other group received, besides SRP, antibiotic therapy (amoxicillin and metronidazole). The effect of treatment was appraised under clinical parameters, prevalence and subgingival levels of P. gingivalis and genotypes fimA II and fimA IV in quantitative study by Real time PCR, before and after 180 days of the treatment. Data suggest that SRP associated with systemic antibiotic administration is more efficient in reducing P. gingivalis levels than SRP only. No difference on periodontal treatment results was detected about the presence of fimA II or fimA IV genotypes related to other P.gingivalis genotypes.

O gênero Methylobacterium é composto por bactérias de coloração rósea, metilotróficas facultativas (PPFM - pink-pigmented facultative methylotrophic), que podem fixar nitrogênio, nodular a planta hospedeira, produzir o fitohormônio citocinina e as enzimas pectinase e celulase, podendo dessa forma promover o crescimento vegetal devido à disponibilidade de nitrogênio e à indução de resistência sistêmica. Methylobacterium spp. têm sido descritas como endófitos ou epífitas em diferentes plantas hospedeiras, onde a sua colonização e distribuição no hospedeiro podem ser influenciadas pelo genótipo da planta ou por interações com outros microrganismos associados ao hospedeiro. Neste contexto, poucos trabalhos têm sido desenvolvidos visando um melhor entendimento da interação Methylobacterium-planta e da diversidade deste gênero bacteriano que tem sido isolado de diferentes plantas hospedeiras, exercendo diferentes funções ainda pouco conhecidas. Portanto, este trabalho tem como objetivo estudar a diversidade genética de Methylobacterium spp., por meio do seqüenciamento parcial dos genes 16S rRNA e mxaF; analisar os genes de responsáveis pela interação da Methylobacterium com a planta hospedeira e analisar os genes envolvidos na interação Methylobacterium (endófito)- Xylella fastidiosa (patógeno). Os resultados mostraram que existe uma resposta adaptativa de Methylobacterium spp. específica para cada planta hospedeira. Da mesma forma, foi observado que esta adaptação específica da bactéria à planta, também pode levar à seleção de genótipos específicos para cada planta hospedeira, embora eventos aleatórios também possam ser responsáveis pela diversidade de Methylobacterium na planta hospedeira. Na análise de expressão gênica da interação Methylobacterium-planta, foi observado que o gene relacionado ao metabolismo do metanol (mxaF) não apresentou mudança no padrão de expressão. Genes relacionados a estresse crtI (estresse sentido pela bactéria) e acdS (estresse sentido pela planta), tiveram suas expressões reduzidas na presença da planta, mostrando que a presença de exsudados das plantas não representou um estresse ao desenvolvimento bacteriano. Os genes relacionados à patogenicidade patatin e phoU não foram alterados, confirmando que Methylobacterium é um endófito, e possuem expressão induzida de tais genes quando interagindo com a planta hospedeira. Os resultados permitem concluir que nas condições avaliadas os exsudados das plantas não causam estresse à bactéria (SR1.6/6). Por meio da análise de expressão gênica in vitro de X. fastidiosa em co-cultivo com M. mesophilicum, foi observado que este fitopatógeno vascular apresentou diminuição do crescimento e da formação de biofilme. Os resultados aqui apresentados mostram que a diversidade deste grupo de endófitos é parcialmente determinada pela planta hospedeira, onde tais bactérias interagem tanto com a planta como com outros grupos, como fitopatógenos presentes neste nicho. / The genus Methylobacterium, constituted by PPFMs - pink-pigmented facultative methylotrophic, are able to fix nitrogen, nodule the host plant, produce cytokines and enzymes involved in induction of systemic resistance such as pectinase and cellulase, inducing plant growth. Methylobacterium sp. has been described as endophyte or epiphyte in different host plants, where the colonization and distribution on the host can be influenced by plant genotype or by interaction with other microorganisms associated to the host. In this context, few studies aims the better understanding of the diversity of this genus in different host, the interaction Methylobacterium-plant, and the interaction Methylobacterium-other bacteria. Therefore, this study aims to study the genetic diversity of Methylobacterium spp., by sequencing the 16S rRNA and mxaF gene; to analyze the genes responsible for the Methylobacterium-plant host interaction and to analyze the genes involved in Methylobacterium (endophyte) - Xylella fastidiosa (pathogen) interaction. Results show differential adaptive responses of Methylobacterium spp. in distinct plant species. However, the clustering according to the host plant was observed for a subset of isolates, suggesting that this diversity could be driven by stochastic events, although plant genotype may contribute to this diversity. Analyzing the Methylobacterium-plant interaction gene expression it was observed that genes related to metabolism of methanol (mxaF) was not amended. The genes related to stress such as crtI (stress sensed by the bacteria) and acdS (stress sensed by the plant) had its expression reduced with the plant showing that the plant exudates did not represent a stress to the bacteria development. The genes related to pathogenicity like patatin and phoU were not amended, confirming that Methylobacterium is an endophyte that do not induce when the bacteria interacts with the plant host. Using a genetic expression analyses of X. fastidiosa in vitro in co-cultive with M. mesophilicum, it was seen that this phytopathogen presented the growth and biofilm formation reduction. These results show that the diversity of this endophyte group is partially determinate by the plant host, where this bacterium interacts with the plant and with other groups, such as phytopathogen present in this niche.

Methylobacterium mesophilicum SR1.6/6 é uma bactéria endofítica isolada de ramo de citros previamente esterilizado superficialmente. Esta bactéria possui a capacidade de associar-se com uma ampla variedade de espécies e tecidos de plantas, principalmente nas raízes, mediado pela formação de biofilme e superfícies do hipocótilo de plântulas in vitro. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e a aplicação de um modelo para o estudo in vitro da associação entre esta bactéria e plântulas de soja. Metodologias de genômica e transcriptômica foram aplicadas para a obtenção do draft genômico desta bactéria e de um amplo perfil de sequências expressas, obtidas em dois tratamentos distintos; i) células de biofilme células bacterianas aderidas às raízes das plântulas removidas por sonicação, e ii) células planctônicas células bacterianas em suspensão (i.e. interagindo somente com exsudados radiculares). Os dados genômicos obtidos por 454-pirosequenciamento resultaram em uma cobertura de 37 vezes o tamanho do genoma e geraram 242 contigs. Entre estes, 187 contigs grandes representaram 96% do genoma (tamanho estimado de 6.8 Mb), com um conteúdo GC de 69.5%. Considerando a análise da expressão gênica, um procedimento para monitorar a aderência das células bacterianas às raízes das plântulas foi realizado por meio de microscopia eletrônica de varredura de amostras de raízes coletadas durante o experimento (i.e. 24, 48 e 72h após a inoculação). As células bacterianas obtidas em cada tratamento foram inicialmente submetidas à extração de RNA total, seguida de um processo de enriquecimento de mRNA e sequenciamento por meio da tecnologia de 454-pirosequenciamento (RNA-Seq). O amplo perfil de expressão gênica obtido foi mapeado no draft genômico, resultando em um total de 1.930 clusters gênicos. Posteriormente, estes clusters foram filtrados de acordo com sua abundância e ocorrência diferencial em cada tratamento, resultando em 280 genes diferencialmente expressos. Funções relacionadas ao metabolismo de etanol/metanol, divisão celular, resposta ao estresse oxidativo, produção de sideróforos, biossíntese de peptidoglicanos e hopanóides foram induzidas nas células bacterianas aderidas às raízes das plântulas, enquanto que genes relacionados ao metabolismo essencial das células foram observados principalmente nos tratamentos controle e planctônico. Estes dados fornecem uma base para estudos relacionados a mecanismos moduladores da interação bactériaplanta, distinguindo significativamente os tratamentos biofilme e planctônico, mostrando assim que o contato físico é essencial para o sucesso da interação em estudo. Por fim, estas análises permitiram uma ampla visualização de perfis de expressão gênica desta bactéria, utilizando o draft genômico primeiramente obtido como base para o estudo desta interação com a planta hospedeira. Estudos futuros podem ser desenvolvidos visando caracterizar os mecanismos adaptativos desta bactéria, como seu metabolismo metilotrófico e outros metabolismos específicos, os quais podem dar suporte ao comportamento endofítico deste organismo. / Methylobacterium mesophilicum strain SR1.6/6 is an endophytic bacterium, which has originally been isolated from surface-sterilized healthy citrus branch. This bacterium is able to associate with a range of plant species, rather in the roots, mediated by a biofilm structure, and in hypocotyl surfaces of in vitro seedlings. The aim of the present study was the development and application of a model to study in vitro the association between this bacterium and soybean seedlings. Genomic and transcriptomic approaches were applied resulting a draft of this bacterium genome and a broad profile of mapped mRNA sequences obtained in two different treatments; i) biofilm cells root adhered bacterial cells were removed by sonication, and ii) planktonic cells bacteria cells in suspension (i.e. interacting only with root exudates). Genomic data, obtained by 454-pyrosequencing have had an average depth of 37-fold coverage of the genome and yielded 242 contigs. Among these, 187 large contigs represented 96% of the genome sequence (estimate size of 6.8 Mb) with a GC content of 69.5%. Concerning the gene expression survey, the process to monitor the adherence of bacteria cells to the roots was performed by scanning electron microscopy of roots collected along the experiment (i.e. 24, 48 and 72 hours after inoculation). Bacterial cells obtained in each treatment were firstly submitted to RNA extraction, followed by mRNA enrichment and RNA-Seq using 454-pyrosequencing technology. The broad gene expression profile obtained was mapped into the drafted genome, resulting in a total of 1.930 gene clusters. After that, these clusters were filtered according to their abundance and differential occurrence in each treatment resulting in 280 differential expressed genes. Functions related to methanol/etanol metabolism, cell division, oxidative stress response, siderophore production, peptidoglycan and hopanoid biosynthesis were induced in bacterial cells adhered to plant roots, while genes related to essential cell metabolism were observed mostly in control and planktonic treatment. Also, these data provide insights into the mechanisms modulating plant microbe-interaction, significantly distinguishing biofilm and planktonic treatment, showing that the physical contact is a crucial step on plant-microbe interactions. In conclusion, results allowed a strongly supported analysis of gene expression, based on the genome draft of an endophytic bacterium interacting with the host plant. Further studies should focus on the adaptive mechanisms present in this bacterium, like the methylotrophic lifestyle and other specific metabolisms which might support its behavior as an endophytic bacterium.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans produz fatores de virulência que induzem destruição periodontal, porém a sua regulação é pouco conhecida. O sistema de dois componentes ArcAB é um regulador da transcrição gênica que percebe concentrações de oxigênio no ambiente. Este estudo tem como objetivo construir uma amostra de A. actinomycetemcomitans arcB deficiente e comparar características fenotípicas e de transcrição gênica em relação à amostra selvagem. As curvas de crescimento em condições de microaerofilia e anaerobiose foram similares. Foram observadas diferenças nas capacidades de adesão e invasão às células epiteliais, de formação de biofilme, de adesão à hidroxiapatita recoberta por saliva e na hidrofobicidade entre as amostras. A análise de transcrição gênica por RT-PCR em tempo real mostrou expressão diferenciada de apaH, vppA, vapA e omp29. Os dados indicam que em A. actinomycetemcomitans, ArcB é capaz de detectar condições redox, sendo associado a expressão de fatores de colonização da cavidade oral, regulando a transcrição de genes associados à virulência. / Aggregatibacter actinomycetemcomitans produces several virulence factors which induce periodontal destruction, but little is known about their regulation. The two components system ArcAB is a genetic transcription regulator that senses oxygen concentrations in the environment. This study aimed to construct an A. actinomycetemcomitans arcB deficient mutant and to compare phenotypic carachteristics and gene transcription with the wild type. The growth curves under microaerophilic and anaerobic conditions were similar. There were differences in abilities to adhere and invade epithelial cells, to form biofilm, to adhere to saliva-coated hydroxyapatite and in hydrophobicity between the strains. Gene transcription analysis by real time PCR showed differential expression of apaH, vppA, vapA and omp29. These data indicate that in A. actinomycetemcomitans, ArcB is able to detect redox conditions and is associated with colonization factors of the oral cavity, by regulating transcription of genes associated with virulence.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2018-09-04T11:52:25Z No. of bitstreams: 1 annelisafarahsilvapaesleme.pdf: 3714457 bytes, checksum: 04f67b418a9032046d649343f4ef5330 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-09-04T13:18:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 annelisafarahsilvapaesleme.pdf: 3714457 bytes, checksum: 04f67b418a9032046d649343f4ef5330 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-04T13:18:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 annelisafarahsilvapaesleme.pdf: 3714457 bytes, checksum: 04f67b418a9032046d649343f4ef5330 (MD5) Previous issue date: 2014-02-14 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Biofilmes associados a dispositivos médicos são responsáveis por 85% das infecções de corrente sanguínea relacionadas a catéteres (ICSRC). O objetivo deste trabalho foi testar duas formulações, como revestimento para catéteres venosos centrais (CVC), as quais tiveram a eficácia antimicrobiana e antiaderente avaliadas in vitro e a eficácia e biocompatibilidade, in vivo. A atividade antimicrobiana foi determinada por método turbidimétrico e a concentração inibitória mínima (CIM) foi estabelecida. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) avaliou a propriedade antiaderente dos CVC revestidos com a formulação 1 (CVC-R1) e formulação 2 (CVC-R2), comparados aos não revestidos (CVC-NR). Implantes subcutâneos foram inseridos na área dorsal de ratos. O primeiro ensaio compreendeu análises hematológicas e microbiológicas (hemocultura e colonização das superfícies de CVC), a fim de avaliar a eficácia dos revestimentos. A biocompatibilidade foi avaliada no segundo ensaio pela observação das reações inflamatórias após 7 e 21 dias. Ambas formulações apresentaram atividade antimicrobiana frente a todas as cepas testadas. A desagregação do biofilme, com redução significativa da aderência microbiana, foi observada em ambos CVC revestidos. In vivo, foi observada maior eficácia antibiofilme de CVC-R2, com redução da colonização por Staphylococcus aureus ATCC 25923. As reações teciduais provocadas por CVC-R1 e CVC-R2 foram mais pronunciadas inicialmente, contudo, ao longo do experimento, se tornaram estatisticamente semelhantes às do CVC-NR. Ambas as formulações foram biocompatíveis, com maior velocidade de reparo tecidual no grupo CVC-R2. O uso de CVC- R1 e, especialmente de CVC-R2, pode diminuir a incidência de ICSRC. Acredita-se que CVC-R2 apresenta potencial para ser testado clinicamente. / Device-associated biofilms are responsible for 85% of catheter-related bloodstream infections (CRBSI). The aim of this study was investigate two formulations, as central venous catheters (CVC) coating, which were submitted to in vitro evaluation of antimicrobial and anti-adherent efficacy and in vivo evaluation of efficacy and biocompatibility. The antimicrobial activity was assessed by turbidimetric method and the minimum inhibitory concentration (MIC) was determined. The scanning electron microscopy (SEM) was used to assess the anti-adherent property of CVC coated with formulation 1 (CVC-R1) and formulation 2 (CVC-R2), in comparison to uncoated CVC fragments (CVC-NR). Subcutaneous implants were inserted into the dorsal area of rats. The first assay consisted in hematological and microbiological analysis (hemoculture and CVC surfaces colonization) in order to evaluate the coatings effectiveness. The second assay evaluated the biocompatibility by the observation of inflammatory reactions after 7 and 21 days. Both formulations showed antimicrobial activity against all tested strains. The biofilm disaggregation, with reduction in microbial adherence, was noted in coated catheters. In vivo results showed greater antibiofilm efficacy of CVC-R2 since a reduction of Staphylococcus aureus ATCC 25923 colonization was observed. The tissue reactions of CVC-R1 and CVC-R2 groups were initially more pronounced, however, throughout the experiment, the histological parameters have become statistically similar those found in CVC-NR group. Both formulations were biocompatible and a higher speed of tissue repair in CVC-R2 group was noted. The use of CVC- R1, and especially of CVC-R2, may reduce the development of CRBSI, and thereby, CVC-R2 have potential to be clinically tested.

Pseudomonas aeruginosa é uma proteobactéria do grupo gama, que pode se comportar como um patógeno oportunista. A linhagem PA14 apresenta duas ilhas de patogenicidade. A maior delas, PAPI-1, contém dois grupos de genes envolvidos com virulência, transcritos de maneira oposta e que estão entre duas seqüências repetidas diretas. O primeiro grupo compreende quatro genes dispostos em dois operons, que codificam para proteínas de sistemas de dois componentes (PvrS, PvrR, RcsC e RcsB). PvrS e RcsC são proteínas sensoras híbridas, que apresentam domínios de histidina-quinase e de reguladores de resposta. PvrR é um regulador de resposta com um domínio EAL com atividade de fosfodiesterase de diGMP cíclico e RcsB apresenta um domínio de ligação a DNA, além de um domínio fosfoaceptor. O outro grupo é composto de cinco genes, cupD1 a cupD5, que codificam para uma fímbria do tipo chaperone-usher e que apresenta alta similaridade com cupA, envolvido na formação de biofilme em outras linhagens de P. aeruginosa. Trabalhos anteriores mostraram que pvrS, pvrR, rcsC, rcsB e cupD2 estão relacionados com a virulência de PA14. Como estes grupos de genes parecem ter sido inseridos na ilha em um único evento de recombinação, este trabalho investigou se os sistemas de dois componentes estão relacionados com a regulação da expressão de cupD. Foi observado que a expressão de cupD é maior a 28ºC do que que a 37ºC e é influenciada positivamente pelo regulador global de expressão, MvaT, uma proteína tipo H-NS. Ensaios de &#946;-galactosidase a partir de uma fusão de transcrição mostraram que a atividade promotora de cupD é cerca de 50% menor numa linhagem com deleção em rcsB em relação à linhagem selvagem. Nenhuma diferença consistente foi observada entre as linhagens com deleções em pvrS, pvrR, rcsC e rcsB e PA14 em relação a motilidade dos tipos swarming, swimming ou twitching ou à formação de biofilme. A linhagem de P. aeruginosa PA14 superexpressando RcsB mostrou níveis exacerbados de mRNA de cupD1, sendo a atuação de RcsB específica em cupD, já que os outros grupos de genes cup presentes em PA14 não mostraram a mesma variação na expressão, conforme analisado por RT-PCR quantitativo. Essa linhagem mostrou também um aumento na formação de biofilme, sem que a motilidade fosse alterada. Ainda visando elucidar os mecanismos de regulação de cupD, linhagens que superexpressam pvrR também foram analisadas quanto a estes fenótipos. Nesse caso, a superexpressão de pvrR diminuiu a formação de biofilme, conforme esperado, aumentou a motilidade do tipo swarming, porém não alterou a expressão de cupD. Os dados do presente trabalho demonstraram que a cupD é regulado pelos genes do sistemas de dois componentes adjacentes a ele e que o ativador de transcrição RcsB está relacionado com a formação de biofilme em tubos de vidro, provavelmente via a fímbria CupD. / Pseudomonas aeruginosa is a &#947;-proteobacteria that can behave as an opportunistic pathogen. The strain PA14 carries two pathogenicity islands, the largest of them, PAPI-1, contains two gene clusters between two direct repeat sequences that are transcribed in opposite directions and are involved in virulence. The first group consists of four genes arranged in two operons encoding two-component system proteins (PvrS, PvrR, RcsC and RcsB). PvrS and RcsC are hybrid sensor proteins, which contain domains of histidine kinase and response regulator domains. PvrR is a response regulator with a phosphodiesterase EAL domain and RcsB presents a C- terminal HTH DNA biding domain, in addition to a phosphoaceptor domain. The other group is composed of five genes, cupD1-5, that encodes components and assembly factors of a putative fimbrial CupD, which has high similarity with CupA, involved in the biofilm formation in other P. aeruginosa strains. Earlier work showed that pvrS, pvrR, rcsC, rcsB and cupD2 are related to the virulence of PA14. As these groups of genes appear to have been inserted on the island in a single event of recombination, this study investigated whether the two-component systems are related to the regulation of cupD expression. It was observed that cupD promoter activity is higher at 28oC than at 37oC and it is positively influenced by the global regulator, MvaT, a H-NS like protein. A lacZ transcriptional fusion showed about 50% less promoter activity of cupD from a strain with deletion in rcsB as compared to PA14. No consistent differences were found among the strains with deletions in pvrS, pvrR, rcsC and rcsB and PA14 on swarming, swimming and twitching motilities or biofilmsformation. A strain overexpressing overexpression showed heigher levels of cupD1mRNA of, and the role of RcsB as an activator is specific to cupD, as the other groups of cup genes present in PA14 did not show the same variation in the expression, as analyzed by quantitative RT-PCR. This strain also showed an increase in biofilm formation. In further assays aiming to elucidate the mechanisms of regulation of cupD, a strains overexpressing pvrR was also analyzed. Overexpression of pvrR decreased the formation of biofilm, as expected, and increased swarming motility, but did not alter the expression of cupD. The data from this study demonstrated that cupD is regulated by RcsB, and that this transcriptional activator is involved in the formation of biofilm in glass tubes, probably via CupD fimbriae.

Um método baseado na extração de rRNA, seguido de RT-PCR rRNA 16S, clonagem e ARDRA foi otimizado e validado para a identificação das bactérias ativas em biofilmes. O método foi analisado primeiro com consórcios artificiais de três organismos. As etapas de clonagem e RT não causaram variações importantes na composição destes consórcios, do contrário da etapa de PCR, onde foi necessária a redução de 30 para 10 ciclos para limitar a distorção da proporção de templates. A análise de biofilmes reais indicou que clones dominantes podem ser identificados com o critério de ocorrência de >2% na biblioteca, mas que a reprodutibilidade de análises ainda é insatisfatória, possivelmente devido a fatores como a micro heterogeneidade espacial do biofilme, viés na reação de PCR e formação de mais de um clone de ARDRA por organismo. O armazenamento do biofilme a -20 °C por 2 meses não levou à alterações expressivas em sua composição. O perfil de clones detectado com o kit (Mo Bio) de extração de RNA foi muito diferente do perfil detectado com o método otimizado neste trabalho. / A method based on extraction of rRNA, followed by RT-PCR of 16S rRNA, cloning and ARDRA was optimized and validated for identification of bacteria active in biofilms. The method was first tested with artificial three-membered consortia. Cloning and RT did not lead to significant changes in the composition of the artificial consortia, but a reduction in cycle number in the PCR reaction from 30 to 10 was necessary for limiting the distortion in the proportion of amplicons relative to that of the templates. Analysis of real biofilms revealed that clones from active organisms occurred in frequencies >2% in the clone library, but reproducibility of analysis was unsatisfactory, probably due to factors such as the spatial heterogeneity of colonization of biofilms by microbes, PCR bias and more than one ARDRA clone per organism. Storage of biofilm samples at -20 °C for 2 months did not lead to important changes in composition. Very different clone profiles were obtained in the analysis of the same biofilm sample with the optimized method and with a kit (Mo Bio) for extraction of RNA.

Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de revestimentos comestíveis na qualidade de mamão \'Formosa\' minimamente processado durante armazenamento a 5°C por 15 dias. Os tratamentos foram: o controle, e os seguintes revestimentos: amido de arroz 3%, alginato de sódio 0,5% e carboximetilcelulose 0,25%. O uso de revestimentos causou alterações nos parâmetros físicos, físico-químicos e microbiológicos do mamão minimamente processado, quando comparado ao controle. As alterações mais importantes foram: menor contagem de coliformes totais; menor respiração dos mamões tratados com amido de arroz e maior dos tratados com carboximetilcelulose, ao longo do tempo; menor descoloração da polpa dos frutos ao longo do armazenamento; maior manutenção da firmeza das amostras tratadas com carboximetilcelulose; e redução do teor de sólidos solúveis e aumento da acidez titulável. Os revestimentos não afetaram os atributos sensoriais. Como a maioria dos efeitos positivos das coberturas ocorreu no 12° e 15° dias e, considerando o custo da tecnologia relacionado ao preço dos revestimentos, a melhor opção, até 9 dias de armazenamento, consiste em fazer apenas uma boa sanitização dos frutos, como feito no controle. No entanto, se o interesse for preservar a vida útil dos mamões por um período maior, até 15 dias, os revestimentos testados podem ser utilizados com resultados satisfatórios. / This study aimed to evaluate the effect of edible coatings on the quality of minimally processed \'Formosa\' papaya during storage at 5°C for 15 days. The treatments were: the control, and the following coatings: rice starch 3%, sodium alginate 0.5% and carboxymethylcellulose 0.25%. The use of coatings caused changes in the physical, physicochemical and microbiological parameters of minimally processed papaya, when compared to control. The most important changes were: lower counts of total coliforms; lower respiration of papayas treated with rice starch and higher of those treated with carboxymethylcellulose over time; less fruit pulp discoloration during storage, increased firmness maintenance of samples treated with carboxymethylcellulose; and reduction of soluble solids and increased acidity. The coatings did not affect the sensory attributes. Since most of the positive effects of the coatings occurred at the 12th and 15th days, and considering the technology cost related to the price of coatings, the best option, until 9 days of storage, is just to do a good sanitization of fruits such as that of control samples. However, if the interest is to preserve the shelf life of papayas for a longer period, up to 15 days, the coatings tested could be used with satisfactory results.