La presente tesis estudia los sitios alostéricos desde una perspectiva estructural y evolutiva. La regulación alostérica es un aspecto fundamental de la vida a nivel molecular, ya que es el mecanismo más potente y frecuente en la regulación de la actividad proteica: mediante la unión de un ligando a un sitio que no es el sitio activo. Este fenómeno fue descrito por primera vez hace más de 50 años y desde entonces no ha dejado de captar la atención de la comunidad científica, llegando incluso a ser calificado como `el segundo secreto de la vida', después del código genético. Sin embargo, la comprensión cabal de los mecanismos involucrados continúa siendo un gran desafío científico. Actualmente, los sitios alostéricos han despertado un creciente interés por parte de expertos en química medicinal y compañías farmacéuticas, dado su potencial para el desarrollo de nuevos fármacos. La tesis se presenta como un `compendio de publicaciones'. El primer artículo fue publicado a principios del año 2010 y describe la primera etapa del proyecto, una serie de análisis computacionales a gran escala para caracterizar sitios de unión a ligando integrando información referente a secuencia, sitios activos y estructura para más de mil familias proteicas. Mediante la identificación de sitios de unión comunes en distintas estructuras de la misma familia proteica, se desarrolló un método para medir la conservación estructural de dichos sitios. Esta metodología permitió realizar una caracterización de sitios de unión considerando distintos aspectos, como la conservación evolutiva a nivel de secuencia, flexibilidad estructural, potencial electrostático y conservación estructural. El descubrimiento más significativo fue la inesperada falta de correlación entre las medidas de conservación de secuencia y estructura para muchos de los sitios de unión predichos. Este hallazgo es válido también para casos específicos de proteínas alostéricas, donde el sitio activo está conservado tanto a nivel de secuencia como de estructura, pero el sitio alostérico sólo presenta conservación a nivel estructural y no de secuencia. El segundo artículo fue publicado a fines del año 2012 y explora la relación entre la flexibilidad proteica y la regulación alostérica, definiendo una metodología computacional para la predicción de sitios alostéricos en estructuras proteicas. Más allá de los aspectos dinámicos que fueron estudiados mediante el análisis de modos normales, el método también incorpora la medida de conservación estructural desarrollada en el primer artículo. El sistema predictivo fue puesto a prueba utilizando un extenso conjunto de proteínas alostéricas de estructura conocida, obteniendo un valor predictivo positivo de 65%. Después de la segunda publicación, el método se ha implementado como servidor web para brindar apoyo a la investigación de la regulación alostérica, tanto para extender el conocimiento de esta forma fundamental de regulación de la actividad proteica, como para ayudar en la aplicación de dichos conocimientos al desarrollo de nuevos fármacos con objetivos terapéuticos. / This thesis studies protein allosteric sites from a structural and evolutionary perspective. Allostery is a fundamental aspect of life at the molecular level, the most common and powerful mechanism of protein activity regulation: through binding of a ligand to a site which is not the active site. This phenomenon was first described more than 50 years ago and it still captures the attention of researchers, while fully understanding its mechanisms remains a grand scientific challenge. Furthermore, allosteric sites have been increasingly calling the attention of medicinal chemists and pharmaceutical companies, given their potential for the development of novel therapeutics. The thesis is presented as a `compendium of published articles'. The first article was published at the beginning of 2010 describing the first stage of the thesis, a series of large-scale computational analyses to characterize putative small-molecule binding sites by integrating publicly available information on protein sequences, structures and active sites for more than a thousand protein families. By identifying common pockets across different structures of the same protein family a method was developed to measure the pocket's structural conservation. Characterization of putative ligand-binding sites followed using different measures such as sequence conservation, structural flexibility, electrostatic potential and structural conservation. The most relevant finding was the unexpected lack of correlation between the two conservation measures, of sequence and structure, for many of the predicted cavities. This general finding was also observed in specific cases of allosteric proteins, where the active site was conserved both in terms of structure and sequence but the allosteric site was conserved only from the structural perspective and did not show conservation at the sequence level. The second article was published at the end of 2012, it explores the relationship between protein flexibility and allosteric effects defining a computational methodology to predict the presence and location of allosteric sites on protein structures. Besides the dynamical aspects assessed through normal mode analysis, the method also incorporates the structural conservation measure defined in the first article. The predictive approach was benchmarked against a large data set of allosteric proteins of known structure obtaining 65% positive predictive value. After the second publication, the method has been implemented in the form of a freely available web-server aimed to support the work of researchers in the field of allosterism, both to improve the understanding of this fundamental form of protein function regulation and to serve applied purposes in the area of drug design and discovery.

Actualment, el cribratge virtual juga un paper central en el món del descobriment de fàrmacs. L’anàlisi in silico permet el cribatge de milions de molècules petites i la tria de les més prometedores per a les proves experimentals. Per trobar candidats que puguin esdevenir fàrmacs, és crucial reunir una sèrie d’eines computacionals individuals i complementàries. En aquesta tesi, es descriu un procediment automatitzat de cribatge virtual que combina el modelat de farmacòfors i el seu ús en cerques, mètodes d’alt rendiment d’acoblament molecular, puntuació de consens i estimació d'energia lliure d'unió mitjançant el mètode d’energia d'interacció lineal (LIE) a partir de simulacions de dinàmica molecular. Un dels objectius d'aquesta tesi ha estat el de construir una metodologia flexible i versàtil de cribratge virtual, que permeti la integració de diferents eines en les diferents etapes de l’estudi. El procediment, que es va iniciar com la combinació d'un senzill filtre per tamany, la simulació de l’acoblament molecular i una puntuació de consens, ha derivat en un procediment computacional elaborat i automatitzat amb l'addició de cerques basades en farmacòfor i l'estimació de l'energia lliure d'unió mitjançant el mètode LIE. Aquest mètode integrat té l’objectiu de compensar les debilitats individuals de les diferents tècniques usades i permet avaluar i comparar el rendiment i la l’exactitud d'aquestes tècniques. Una altra fita important ha estat l'aplicació del procediment computacional a proteïnes diana concretes per tal d’avaluar-ne la capacitat de trobar molècules que puguin ser candidats a fàrmacs. Tests experimentals realitzats per a la β-Glucosidasa àcida i la hidrolasa de Bleomicina humanes indiquen que diverses molècules petites seleccionades pel procediment computacional tenen activitat inhibitòria micromolar. El mètode LIE emprat en aquest treball es va aplicar sobre més de deu mil complexos proteïna-lligand per a tres proteïnes diana diferents, el que és, al nostre entendre, la primera aplicació del mètode LIE a aquesta escala. / Virtual screening plays a central role in the world of drug discovery today. In silico testing allows to screen millions of small molecules and to choose only the most promising ones for experimental testing. To find potential drug candidates, it is crucial to bring together individual and complementary computational tools. In this thesis, I describe an automated virtual screening procedure that combines pharmacophore modeling and searches, high-throughput molecular docking, consensus scoring and binding free energy estimation with the linear interaction energy (LIE) method through molecular dynamics simulations. One goal of this thesis was to build an evolving and versatile virtual screening methodology, which enables integration of different tools at different steps. The procedure that started as a combination of a simple size filter, molecular docking and consensus scoring, advanced into an elaborate and automated computational workflow with the addition of pharmacophore searches and binding free energy estimation with LIE. This integrated method intends to compensate for weaknesses of individual structure-based techniques and allows the evaluation and comparison of the performance and accuracy of these techniques. Another important goal was to apply the computational workflow to target proteins and find hits that could be drug candidates. Experimental testing performed for human acid β-Glucosidase and bleomycin hydrolase indicate that several small molecules selected by the computational workflow display micromolar inhibitory activity. The standard LIE method used in this work was applied to more than ten thousand ligand-protein complexes for three different targets, which is, to our knowledge, the first time application of LIE at such large scale.

La helada se caracteriza por el descenso de la temperatura del aire bajo los cero grados Celsius, es uno de los problemas más severos para la agricultura andina, siendo las regiones más afectadas del Perú, aquellas ubicadas entre los 2 500 y 3 500 metros sobre el nivel del mar (m.s.n.m.). Estudios a nivel morfológico y fisiológico indican que las papas nativas constituyen importantes fuentes de genes relacionados con la tolerancia a heladas. Sin embargo, aún son desconocidos los mecanismos moleculares de tolerancia en estas papas. La tecnología de secuenciación de RNA (RNA-seq) es una excelente herramienta para identificar cambios en el perfil de expresión de los genes. En este estudio, utilizando RNA-seq, realizamos un análisis comparativo del transcriptoma de dos variedades de Solanum tuberosum subsp. andigena con respuesta contrastante al estrés de helada. Se alinearon más de 199 millones de lecturas usando el genoma de referencia Solanum tuberosum Group Phureja, que correspondió al 82.3% de las lecturas totales obtenidas tras el secuenciamiento. Se identificaron 279 y 160 genes expresados diferencialmente en Yana Manwa (YM, variedad tolerante al estrés por helada) y Yuraq Gaspar (YG, variedad susceptible), respectivamente. En general, los genes expresados diferencialmente enriquecidos (DEGs) estuvieron implicados en la estructura de la pared celular, metabolismo de carbohidratos, enzimas con actividad antioxidante. Además, identificamos DEGs asociados a diferentes factores de transcripción. Estos resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre los sistemas de regulación de la tolerancia a la congelación de la papa y proporcionan recursos genéticos para estudios posteriores. / Tesis

Doctor en Ciencias con Mención en Biología Molecular, Celular y Neurociencias / La proteínaquinasa CK1 es una enzima altamente ubícua y conservada en todos los eucariontes estudiados y, particularmente, dentro de los vertebrados. En estos organismos, la enzima existe como una familia de siete miembros genéticamente distintos, denominados CK1#, #, #1, #2, #3, # y #. Hasta el momento se ha determinado que los mensajeros de tres de estas isoformas, #, #1 y #3, sufren procesamiento alternativo, dando lugar así a nuevas variantes. En particular, el mRNA de la isoforma a da origen a 4 subisoformas, definidas por la presencia o ausencia de 2 segmentos adicionales, llamados inserto L e inserto S. El primero se ubica en medio del dominio catalítico de la enzima, en la llamada region “bisagra” y el segundo se encuentra localizado en el extremo C-terminal. La coexistencia de algunas o todas estas variantes se ha descrito anteriormente en rata, pollo y humano y las secuencias de los insertos se encuentran altamente conservadas entre estas especies. En esta Tesis, se clonaron las cuatro variantes de procesamiento de CK1# de pez cebra ( Danio rerio ) y se expresaron tanto en células de E. coli como en células eucarióticas en cultivo. La caracterización bioquímica de las variantes recombinantes expresadas en bacterias determinaron que las que contienen el inserto L tienen una menor afinidad por ATP, al igual que por el inhibidor específico, CKI-7, que compite por el sitio de unión del nucleótido. Estas variantes, además, muestran una mayor actividad hacia #-caseína, aunque no existen diferencias en el valor de la Km aparente entre las cuatro isoformas con respecto a los sustratos proteicos y peptídicos ensayados, #-caseína, fosvitina y el péptido RRKDLHDDEEDEAM SITA, derivado del inhibidor-2 de la proteína fosfatasa 1 (PPI2). Las variantes L también exhiben una mayor termolabilidad a 40°C, comparadas con las que no contienen este inserto. Esta secuencia contiene además un sitio canónico para la fosforilación por PKA y, al ser incubadas con esta enzima, la fosforilación es estimulada en 2 veces para CK1#, 6 veces para #S, 16 veces para #L y aproximadamente 70 veces para #LS. Esto sugiere que la PKA fosforila a CK1#, en particular dentro de los insertos y especialmente el inserto L. Por otro lado, las cuatro variantes poseían actividad autofosforilativa y tirosinaquinasa. Otro aspecto abordado en esta Tesis fue la fosforilación de NFAT4 por CK1. El trabajo de Zhu y col. (1998) demuestra que este factor de transcripción es fosforilado in vivo por CK1# y que esta fosforilación previene la entrada de NFAT4 al núcleo. En esta publicación se describe un putativo sitio de acoplamiento o “docking” dentro de la secuencia donde interactúa CK1. En nuestro estudio se utilizaron péptidos sintéticos que abarcaban las regiones conservadas A y Z y la región “linker” entre ellas (L). Tanto las variantes de CK1a de pez cebra como CK1 nativa purificada de hígado de rata fosforilaban residuos no canónicos contenidos en la región A2, pero no la Z, a diferencia de lo encontrado por Zhu y col. (1998). Una extensión de residuos acídicos presentes en la región L demostró ser esencial para la fosforilación eficiente del dominio A2, como se pudo determinar por un aumento en la Km de un orden de magnitud provocada por la deleción de la región L o por la sustitución de los residuos acídicos por glicinas o alaninas. Este resultado también difiere de los de Zhu y col., que habían ubicado el sitio “docking” en la región A2. Por otro lado, al reemplazar una de las serinas del extremo N-terminal de la región A2, la Ser177, por fosfoserina, se desencadena un efecto jerárquico que provoca un aumento dramático en la eficiencia de fosforilación del péptido. Estos datos son consistentes con un mecanismo bifásico de fosforilación, en que la región L provee un sitio “docking” funcional que facilita la fosforilación no canónica de la Ser177, la que, consiguientemente, gatilla una cadena de fosforilaciones jerárquicas río debajo de este residuo. Con objeto de realizar estudios sobre el comportamiento in vivo de las variantes de CK1#, se transfectaron células Cos-7 con construcciones de CK1# y CK1#L. Mediante inmunocitoquímica, se determinó que la CK1# se localizaba en forma generalizada dentro de la célula, predominantemente en el citoplasma. CK1#L, en contraste, se localizaba en forma predominante en el núcleo, lo que sugiere que la secuencia PVGKRKR, contenida dentro del inserto L, constituiría una señal de localización nuclear funcional. La variante más larga también exhibió una vida media 4 veces menor que CK1#, siendo de 97 y 400 minutos, respectivamente, como fue determinado por experimentos de pulso y caza en células transfectadas y marcadas metabólicamente con 35 S. Mediante experimentos de RT-PCR utilizando RNA total de embriones y adultos de pez cebra, se determinó que la proporción relativa de los transcritos de las cuatro subisoformas varía a lo largo del desarrollo y en adulto, observándose un aumento relativo de #S y una caída en el nivel de #L entre los estadíos de 1 célula y larva (4-5 días). Además, por hibridación in situ utilizando una sonda general para las cuatro variantes de CK1#, se observó una expresión generalizada de los mensajeros de esta isoforma de CK1 hasta las 24 h de desarrollo y, entre los 2 y 3 días, una localización más específica en la cabeza y el primordio de la aleta pectoral. En síntesis, la presencia del inserto L confiere a la enzima algunas propiedades que la distinguen de las variantes que no contienen este inserto: Altera el sitio de unión a ATP, disminuyendo levemente la afinidad por el nucleótido, disminuye la estabilidad de la enzima, tanto in vivo como in vitro frente a una temperatura de 40°C, aumenta el nivel de fosforilación de la CK1# en presencia de PKA y concentra la enzima en el núcleo, probablemente debido a la secuencia PVGKRKR contenida en el inserto L.

TGFβ produce numerosas respuestas en células eucarióticas. Los principales mediadores de la señalización de TGFβ son las Smad. Proteínas accesorias que interaccionen con las Smads pueden ser responsables de parte de las respuestas de TGFβ. En una búsqueda de nuevas proteínas que interaccionan con Smad2, utilizando el Sistema Doble Híbrido Cyto-Trap, hemos hallado 110 proteínas diferentes. Entre ellas, encontramos Sirt1, una desacetilasa de histonas de tipo III dependiente de NAD+. Hemos realizado un estudio del papel del Sirt1 en la señalización de TGFβ. Hemos mostrado la interacción Smad2/Sirt1 in vivo e in vitro. Hemos realizado un amplio estudio molecular y funcional de la interacción Smad2/Sirt1. Determinamos que Sirt1 no desacetila a Smad2, pero está involucrada en la regulación dependiente de TGFβ de cierto grupo de genes. Finalmente, asociamos el papel de Sirt1 en la regulación de la transcripción por TGFβ a genes específicos que quedan agrupados en funciones celulares concretas. / TGFβ is able to generate a numerous responses in eukaryotic cells. The main mediators in TGFβ signalling are the Smad proteins. Accessory Smad interacting proteins could be responsible for a fraction of the TGFβ-dependent responses. In a search for new Smad2 interacting proteins by using the Cyto Trap Two Hybrid System, we have found 110 different proteins. Among them, we found Sirt1, a type III histone deacetylase dependent on NAD+. We have studied the role of Sirt1 in TGFβ signalling. We have showed that Smad2 and Sirt1 interact both in vivo and in vitro. We did a deep molecular and functional study of the Smad2/Sirt1 interaction. We have shown that Sirt1 does not deacetylase Smad2 but it is involved in TGFβ-dependent transcription of certain set of genes. Finally, we have linked Sirt1 role to TGFβ dependent regulation of genes associated to specific cell processe

INTRODUCCIÓN: La adquisición del fenotipo de resistencia a múltiples fármacos (MDR) en células tumorales las convierte en resistentes a fármacos antineoplásicos y es una de las principales causas del fracaso de la quimioterapia en algunos tumores. La expresión de glicoproteína P (MDR-1, P-gp, ABCB1) contribuye a esta resistencia expulsando los fármacos o regulando la muerte celular programada. Por otro lado, la sobreexpresión de miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 observada en tumores sanguíneos se ha asociado a la resistencia a quimioterapia en varios cánceres humanos. También es importante estudiar alteraciones en las rutas de señalización de MAPKs y la secreción de citocinas en las células con fenotipo MDR. OBJETIVOS: El propósito de este trabajo fue encontrar un estímulo capaz de inducir sensibilidad colateral en células leucémicas murinas y humanas con fenotipo MDR, y caracterizar el tipo de muerte celular inducida. El segundo propósito fue estudiar la contribución de MDR-1, caspasas, proteínas de la familia Bcl-2, MAPKs y citocinas al proceso de sensibilidad colateral. MATERIALES Y MÉTODOS: Para alcanzar nuestros objetivos, usamos células leucémicas murinas L1210 y su sublínea celular resistente L1210R, así como una línea celular procedente de la línea L1210 transfectada con un plásmido que contenía el gen MDR-1 (CBMC-6). Se realizó western-blot para estudiar la expresión de proteínas, inhibición de MAPKs y caspasas y silenciamiento de ARN de MDR-1, Bcl-xL, Bcl-2 y Bax para estudiar el papel de estas proteínas. RESULTADOS: Se encontró que las células leucémicas resistentes con sobreexpresión de P-gp, pero no sus parentales sensibles, son hipersensibles a estrés hipotérmico produciéndose apoptosis a temperaturas por debajo de 4ºC. La transfección de la línea celular parental con un plásmido que contiene P-gp las convierte en sensibles a estrés hipotérmico, demostrando la asociación entre la expresión de P-gp y la muerte celular provocada por el frío. También observamos un incremento de la expresión basal y actividad del fragmento activo de caspasa 3 a temperatura fisiológica (37ºC) en las células MDR. La inhibición de caspasa 3 rescató parcialmente a las células leucémicas MDR de la apoptosis inducida por el frío, lo que sugiere que el mecanismo de muerte celular depende de caspasa 3. Esto demuestra que la expresión de P-gp juega un papel importante en la supervivencia de las células MDR y es acompañada por un proceso de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico. Se observó que la línea parental leucémica (L1210) y la línea celular CBMC-6 presentan una alta expresión de la proteína anti-apoptótica Bcl-xL, mientras que la expresión de Bcl-2 es baja. Por el contrario, en las células L1210R se observó una disminución de la expresión de Bcl-xL y un aumento de Bcl-2. La inhibición de dirigida de proteínas anti-apoptóticas confirma que la expresión de Bcl-xL es un regulador clave de la supervivencia de las células leucémicas. En contraste, el silenciamiento de Bcl-2 muestra que la supervivencia de las células L1210R no depende del nivel de expresión de Bcl-2. Así, nuestros datos demuestran que la supervivencia de la línea celular parental depende de la expresión de Bcl-xL, pero la adquisición del fenotipo MDR elimina esta dependencia y podría depender de varios miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2. Además, los resultados obtenidos en las células CBMC-6 demuestran que P-gp tiene poca influencia sobre las proteínas de la familia Bcl-2. Resultados similares se obtuvieron bajo condiciones de estrés hipotérmico y exposición al fármaco daunomicina. En relación a la ruta de señalización de MAPKs, demostramos su importancia en el desarrollo del fenotipo MDR, así como en el desarrollo de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico, demostrando que la inhibición de ERK y JNK puede proteger, parcialmente, de la muerte celular inducida por el frío en las células L1210R y CBMC-6. CONCLUSIONES: El proceso de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico está asociado al fenotipo MDR en células murinas, y ocurre a través de un proceso de apoptosis dependiente de caspasas. La expresión y funcionalidad de MDR-1 está asociada a la sensibilidad a hipotermia en células murinas. El desarrollo del fenotipo MDR está acompañado de cambios en la expresión de proteínas Bcl-2, pero éstas no influyen en la sensibilidad colateral. La señalización a través de ERK y JNK está implicada en la sensibilidad colateral observada en las células MDR. La señalización a través de citocinas podría tener un papel importante en la respuesta a estrés de las células MDR. / INTRODUCTION: The acquisition of a multidrug-resistant (MDR) phenotype by tumor cells that renders them unsusceptible to anti-neoplasic agents is one of the main causes of chemotherapy failure in human malignancies. The increased expression of P-glycoprotein (MDR1, P-gp, ABCB1) in tumor cells contributes to drug resistance by extruding chemotherapeutic agents or by regulating programmed cell death. In the other hand, over-expression of anti-apoptotic Bcl-2 family members has been reported in hematologic malignancies and has been associated with chemotherapy resistance in various human cancers. As these findings, it is important to study alterations in MDR cells on MAPKs pathway and citokines secretion. OBJECTIVES: The aim of this work was to find a stimulus able to induce collateral sensitivity in murine and human leukemic MDR cells, and to characterize the type of death induced. The second aim was to study the contribution of MDR-1, caspases, family Bcl-2 proteins, MAPKs and citokines to this collateral sensitivity process. MATERIALS AND METHODS: To reach our objectives we used L1210 murine leukemia cells and its resistant derived cell line L1210R, as well as a transfected with a plasmid containing MDR-1 cell line obtained from L1210 (CBMC-6). It was used western-blot to study proteins expression, inhibition of MAPKs and caspases and RNAm silencing of MDR-1, Bcl-xL, Bcl-2 and Bax family to study the role of this proteins. RESULTS: It was found that resistant leukemic cells with P-gp over-expression, but not their sensitive counterparts, are hypersensitive to cold-induced cell death when exposed to temperatures below 4ºC. Transfection of parental cells with a P-gp-expressing plasmid makes these cells sensitive to cold stress, demonstrating an association between P-gp expression and cell death at low temperatures. Furthermore, we observed increased basal expression and activity of effector caspase-3 at physiological temperature (37ºC) in MDR cells. Treatment with a caspase-3 inhibitor partially rescues MDR leukemic cells from cold-induced apoptosis, which suggests that the cell death mechanism may require caspase-3 activity. Taken together, these findings demonstrate that P-gp expression plays a role in MDR cell survival, and is accompanied by a collateral sensitivity to cold stress. We demonstrate that parental leukemic (L1210) and CBMC-6 cells display high constitutive expression of anti-apoptotic Bcl-xL protein, while Bcl-2 protein expression was very low. By contrast, leukemic cells L1210R display a decrease of Bcl-xL and up-regulation of Bcl-2 protein expression levels. Furthermore, targeted inhibition of individual anti-apoptotic proteins by RNA silencing confirms that Bcl-xL expression is a key regulator of leukemic cells survival. In contrast, the silencing of Bcl-2 shows that L1210R survival doesn’t depend on Bcl-2 expression level. Together, our data demonstrate that parental leukemic cells survival are largely dependent on Bcl-xL protein expression, but acquisition of MDR phenotype by such cells abrogate such survival dependence and suggests that resistant cells became probably dependent on more than one anti-apoptotic protein for survival at physiological conditions. Additionally, the results obtained with CBMC-6 cells demonstrate that P-gp exert slight influence in the expression level of Bcl-2 family members. Similar results were obtained under cold stress and drug exposure. Related to MAPKs signaling pathway, we have addressed it importance in MDR phenotype development, as well as in hypothermia collateral sensitivity, showing that ERK and JNK inhibition can protect, partially, against stress-cold induced-death in L1210R and CBMC-6 cell lines. CONCLUSIONS: Collateral sensitivity to cold stress is associated to MDR phenotype in murine cells, and it occurs by a caspase-dependent apoptosis process in murine cells. Expression and functionality of MDR-1 is strongly associated to hypothermia sensitivity in murine cells. MDR phenotype development is accompanied by changes in Bcl-2 family proteins expression, but it is not shown an association with collateral sensitivity. ERK and JNK signaling pathways are implicated in collateral sensitivity process observed in MDR cells. Citokines signaling could play an important role on MDR cells stress response.

Tesis por compendio de publicaciones / Objetivos: el objetivo fundamental de esta Memoria consiste en profundizar en el mecanismo de acción de la tirosinasa. Se centra la atención de este estudio sobre la actividad monofenolasa y se profundiza en el proceso de inactivación suicida. Se investiga la aportación de cada una de las actividades monofenolasa y difenolasa en dicho proceso. Se aborda la caracterización cinética de monofenoles de interés fisiológico. Metodología: 1. Profundizar en el mecanismo cinético de actuación de la enzima en sus actividades monofenolasa y difenolasa. 2. Estudiar la hidroxilación de umbeliferona a esculetina en la ruta de biosíntesis de cumarinas. 3. Establecer una metodología para investigar si un monofenol es inhibidor o sustrato alternativo de la enzima con la ayuda del peróxido de hidrógeno. 4. Diferenciar las actividades monofenolasa y difenolasa en su implicación en el proceso de inactivación suicida. 5. Profundizar en el estudio del mecanismo de inactivación suicida de la enzima en su acción sobre o-difenoles mediante la determinación del efecto isotópico generado en un medio deuterado. 6. Estudiar y analizar los procesos de catálisis e inactivación en la acción de tirosinasa sobre tres tipos de sustratos: o-difenoles, o-aminofenoles y o-fenilendiaminas. 7. Estudiar la acción de tirosinasa sobre hidroxihidroquinona en los procesos de catálisis e inactivación. 8. Estudiar la reacción de tirosinasa con hidroquinona, un monofenol, utilizado como despigmentante. 9. Caracterizar cinéticamente a hidroquinona como un sustrato de tirosinasa con la ayuda del peróxido de hidrógeno. 10. Estudiar la influencia de ácido ascórbico sobre el proceso de hidroxilación de hidroquinona por tirosinasa. 10. Caracterizar cinéticamente a hidroquinona como un sustrato de tirosinasa con la ayuda de cantidades catalíticas de o-difenol y ácido ascórbico. Resultados: 1. Se ha demostrado que tirosinasa podría participar en la ruta de biosíntesis de cumarinas hidroxilando umbeliferona a esculetina. 2. Peróxido de hidrógeno ayuda a demostrar si un monofenol es sustrato o inhibidor de tirosinasa actuando sobre la forma (metatirosinasa) y transformándola en la forma (oxitirosinasa). 3. Los estudios cinéticos con TBF/TBC demuestran que la enzima se inactiva únicamente al actuar sobre o-difenoles. 4. Un conjunto de estudios de efecto isotópico con D2O han puesto de manifiesto que existe una etapa muy lenta en la que se transfiere un protón. Esta etapa podría ser previa a la inactivación suicida. 5. La catálisis de la oxidación de o-difenoles, o-aminofenoles y o-fenilendiaminas, sigue un mecanismo similar: oxidación/ reducción simultánea sobre los dos átomos de cobre. 6. El proceso de inactivación suicida en la acción de la enzima sobre estos sustratos parece seguir un mismo mecanismo, que podría ser la oxidación/ reducción de uno de los átomos de cobre. 7. Los efectos electrónicos de los sustituyentes de C-4 de o-difenoles, o-aminofenoles y o-fenilendiaminas en las etapas de catálisis e inactivación son más importantes en los o-difenoles y o-aminofenles. 8. El producto de hidroxilación de hidroquinona, la hidroxihidroquinona, es un sustrato suicida de la enzima. 9. Se ha puesto de manifiesto que hidroquinona, un agente despigmentante, es un sustrato de tirosinasa. 10. Se ha demostrado que tirosinasa actúa sobre hidroquinona en presencia de oxígeno molecular y peróxido de hidrógeno, ya que este último pasa metatirosinasa (inactiva sobre hidroquinona) a oxitirosinasa (activa sobre hidroquinona). 11. También se ha puesto de manifiesto que tirosinasa actúa sobre hidroquinona en presencia de oxígeno y ácido ascórbico a altas concentraciones, por el paso de metatirosinasa a desoxitirosinasa. Del mismo modo, cantidades catalíticas de tert-butilcatecol y ácido ascórbico en concentraciones de orden micromolar consiguen la acción de tirosinasa sobre hidroquinona a través del paso de metatirosinasa a desoxitirosinasa. / Objectives: The main objective of this report is to deepen the mechanism of action of tyrosinase. The focus of this study is on the monophenolase activity and deepened in the process of suicide inactivation. The contribution of each of the monophenolase and diphenolase activities in this process is investigated. In this regard, the kinetic characterization of monophenols with physiological interest is studied. 1. Deepen in the kinetic mechanism of tyrosinase in their monophenolase and diphenolase activities. 2. Study the hydroxilation of umbelliferone to scueltin in the cumarin biosynthesis pathway. 3. Establish a methodology to investigate if one monophenol is inhibitor or alternative substrate of tyrosinase with the aid of hydrogen peroxide. 4. Discriminate between the monophenolase and diphenolase activities in its involvement on the suicide inactivation process. 5. Deepen the study of suicide inactivation process of tyrosinase in its action on o-diphenols through the determination of isotopic effect generated in a deuterated medium. 6. Study and analyse the catalysis and inactivation processes in the action of tyrosinase on tree types of substrates: o-diphenols, o-aminophenols and o-phenylendiamines. 7. Study the tyrosinase action on hydroxyhydroquinone in the catalysis and inactivation processes. 8. Investigate the action of tyrosinase on a monophenol, hydroquinone, used as lightening. 9. Kinetically characterize to hydroquinone as a substrate of tyrosinase with the aid of hydrogen peroxide. 10. Study the ascorbic acid influence on the hydroquinone hydroxylation process by tyrosinase. 11. Kinetically characterize to hydroquinone as a substrate of tyrosinase with the help of catalytic amounts of o-diphenol and ascorbic acid. Results: 1. It has been shown that tyrosinase could be involved in the biosynthesis pathway of the coumarins by the hydroxylation of umbelliferone to esculetin. 2. Hydrogen peroxide helps to demonstrate whether a monophenol is a substrate or an inhibitor of tyrosinase acting on the form (metatyrosinase) and converting it into the form (oxytyrosinase). 3. The kinetic studies with TBF / TBC show that the enzyme is only inactivated when it acts on o-diphenols. 4. A set of studies of the isotopic effect in D2O have shown that there is a very slow step in which a proton is transferred. It could be considered as a previous step of the suicide inactivation. 5. The catalysis of the oxidation of o-diphenols, aminophenols and o-phenylenediamines occurs through a similar mechanism: simultaneous oxidation / reduction of the two copper atoms. 6. The process of suicide inactivation in the action of the enzyme on these substrates seems to follow the same mechanism which could suppose the oxidation / reduction of one of the copper atoms. 7. The electronic effects of the substituents on the carbon atom C-4 of o-diphenols, o-aminophenols and o-phenylenediamines during the catalytic and inactivation steps are more significant in the case of the o-diphenols and o-aminophenols. 8. The product of the hydroxylation of hydroquinone, hydroxyhydroquinone, is a suicide substrate of the enzyme. 9. It has been shown that hydroquinone, a depigmenting agent, is a substrate of tyrosinase. 10. It has been shown that tyrosinase acts on hydroquinone in the presence of molecular oxygen and hydrogen peroxide because the latter converts metatyrosinase (inactive on hydroquinone) to oxytyrosinase (active on hydroquinone). 11. It has also been found that tyrosinase acts on hydroquinone in the presence of molecular oxygen and ascorbic acid at high concentrations, by transforming metatyrosinase to desoxytyrosinase. Similarly, catalytic amounts of tert-butylcatechol and ascorbic acid at micromolar concentrations induce the action of tyrosinase on hydroquinone by the conversion of metatyrosinase to desoxytyrosinase step.

El treball presentat en aquesta memòria es centra en l'estudi dels mecanismes pels quals el quimioteràpic metotrexat (MTX) desenvolupa resistència en cèl·lules canceroses. Dins d'aquest objectiu es creen dues línies d'estudi que són, trobar nous mecanismes d'inhibició de la dihidrofolat reductasa (DHFR), principal causant de la resistència al MTX, i la troballa de nous gens que puguin estar implicats en aquest procés de resistència.En el present estudi, hem analitzat la resistència al MTX en cèl·lules de càncer de mama. S'han realitzat microarrays d'expressió amb dues línies cel·lulars sensibles i resistents al MTX, els quals han originat com a únic gen en comú entre les cèl·lules resistents d'ambdues línies la família de les UDP-glucuronosil transferases (UGT1A). Hem estudiat aquesta família de gens, i s'ha identificat la UGT1A6 com la principal responsable de la sobrexpressió de les UGTs a les cèl·lules resistents. En aquest treball s'ha analitzat la implicació de la UGT1A6 en la resistència al MTX. També hem analitzat la inducció transcripcional del MTX sobre la UGT1A6, així com els factors transcripcionals involucrats en aquest procés. A més, s'han estudiat les repercussions terapèutiques que pot tenir la sobrexpressió de la UGT1A6 quan es dóna MTX en combinació amb altres fàrmacs glucuronidables.Dins de la recerca de nous mètodes per inhibir la DHFR diferents als quimioteràpics clàssics com el MTX, trobem els basats en teràpia gènica. En treballs anteriors del nostre grup s'havien desenvolupat diversos tipus de molècules per disminuir l'expressió de la dhfr, tal com oligonucleòtids antisentit (aODNs), siRNAs i Triplex forming oligonucleotides (TFOs).En aquest treball hem desenvolupat Template-PPRHs i Coding-PPRHs, hairpins destinats a unir-se a la cadena motlle o codificant del DNA i mRNA, respectivament. Hem estudiat la capacitat citotòxica que tenen els PPRHs en cèl·lules de càncer de mama utilitzant com a model el gen dhfr humà, així com el mecanisme d'acció pel qual aquestes molècules inhibeixen la DHFR. També hem analitzat la capacitat in vitro dels hairpins d'unir-se a la seva seqüència diana i la influència que té la presència d'interrupcions de purines en la cadena de polipirimidines i la forma de minimitzar els seus efectes. Així mateix, hem estudiat l'estabilitat d'aquestes molècules, la seva especificitat i l'activació de la resposta immune. S'ha analitzat l'aplicació terapèutica a partir de l'utilització de PPRHs contra la dhfr en cèl·lules de càncer de mama resistents al MTX, així com el disseny de diferents PPRHs dirigits contra gens amb importància terapèutica en càncer. / The main objective of this work is the study of the mechanisms that lead to resistance to the chemotherapeutic methotrexate (MTX) in cancerous cells. To study this phenomenon there have been two approaches: the search of new strategies to inhibit the expression of the dihydrofolate reductase (DHFR), the main responsible for MTX resistance; and the study of new genes that could be involved in MTX resistance.A microarrays analysis between two breast cancer cell lines sensitive and methotrexate resistant pointed out the UDP-glucuronosyltransferase 1A (UGT1A) family as a common deregulated node in both cell lines. UGT1A6 was the main isoform responsible for UGT1A family overexpression in these cells and this overexpression was not due to gene amplification. The importance of UGT1A6 overexppression in MTX resistance was studied as well as the induction of UGT1A6 mRNA levels and enzymatic activity carried out by MTX through the transcription factors ARNT (HIF-1) and AhR/ARNT. Cells incubated with anticancer drugs susceptible to glucuronidation together with MTX, showed a lesser degree of cytotoxicity, due to UGT1A6 induction. The pharmacological effect of this induction should be taken into account when combining MTX with other drugs that are glucuronidated.Polypurine Reverse-Hoogsteen hairpins, PPRHs, are dsDNA molecules formed by two polypurine stretches linked by a pentathymidine loop. These two polypurine domains are bound by intramolecular Reverse-Hoogsteen bonds, allowing the formation of a hairpin structure. PPRHs bind to their targets by Watson-Crick, forming triplex structures. We designed two types of PPRHS: Template-PPRHs and Coding-PPRHs. Template-PPRHs are designed to bind the template DNA strand, whereas Coding-PPRHs target the mRNA and the coding DNA strand. The dhfr gene was selected as a target in breast cancer therapy. Both PPRHs caused a high degree of cytotoxicity and a decrease in DHFR mRNA and protein levels, but through different mechanisms of action. Template-PPRHs decrease mRNA levels since they interfere with the transcription process. Coding-PPRHs interfere with the splicing process by competing with U2AF65 for binding to the polypyrimidine target sequence, leading to a lower amount of mature mRNA. PPRHs can be considered as new molecules to decrease gene expression.

El treball realitzat en aquesta tesi doctoral constitueix un estudi farmacogenòmic de la resistència al metotrexat (MTX) en cèl·lules de càncer humà, mitjançant experiments amb microarrays per tal de comparar l'expressió gènica diferencial entre cèl·lules sensibles i resistents al MTX.En un primer estudi, vam utilizar com a model la línia cel·lular HT29 de càncer de colon, i vam identificar AKR1C1 com un gen sobreexpressat a les cèl·lules resistents al quimioteràpic. Vam analizar la regulació transcripcional d'aquest gen, mitjançada principalment per Sp1, vam determinar la seva relació amb el cicle cel·lular i amb l'apoptosi i vam establir un paper per AKR1C1 en la resistència al MTX.En un estudi posterior amb microarrays representatius del genoma humà complet, vam identificar un conjunt de gens sobreexpressats i amplificats a les cèl·lules HT29 resistents, amb una localització cromosòmica propera al gen dihidrofolat reductasa.L'anàlisi detallada dels gens diferencialment expressats CAV1, E-Cadherina, PKCi ENO2, ens va permetre determinar per a tots ells un paper en la resistència al MTX, essent els dos primers dianes potencials per al disseny d'una teràpia coadjuvant amb MTX.També vam estudiar la resposta gènica associada a la resistència al MTX en altres línies cel·lulars, representatives de càncer de colon, càncer de mama, càncer de pàncrees, leucèmia eritroblàstica i osteosacoma. Vam realitzar experiments de microarrays per a totes elles i vam obtenir llistes de gens diferencialment expressats. A partir d'aquestes dades, vam construir xarxes d'associació biològica de gens comuns diferencialment expressats en càncer de colon, en càncer de mama o entre les altres tres línies cel·lulars estudiades. Així, vam identificar gens que representaven un node de la xarxa (DKK1), o una xarxa sencera (formada per alguns membres de la família gènica UGT1A) o un gen comú deregulat en càncer de pàncrees, leucèmia eritroblàstica i osteosarcoma (EEF1A1). Validacions funcionals d'aquests gens van mostrar una sensibilització de les cèl·lules vers el MTX. / This thesis represents a pharmacogenomic study on methotrexate (MTX) resistance in human cancer cells. Whole human genome microarrays allowed us to compare the gene expression patterns between cell lines sensitive or resistant to MTX.In a first approach, we used HT29 colon cancer cells as a model, and we identified AKR1C1 as a gene overexpressed in the resistant cells. We analyzed its transcriptional regulation, mainly mediated by Sp1, we determined its relationship with cell cycle and with apoptosis, and established a role for AKR1C1 on MTX resistance.In a second study, we identified a set of genes, located flanking the "dhfr locus", which were overexpressed and amplified in the resistant HT29 cells. Detailed analyses on CAV1, E-Cadherin, PKCand ENO2, four differentially expressed genes, allowed us to establish a role for all of them in MTX resistance, and to hypothesize that CAV1 and E-Cadherin may constitute potential targets for coadjuvant therapy.We also studied the gene expression profiles of MTX resistance in other cell lines, representative of colon cancer, breast cancer, pancreatic cancer, erythroblastic leukemia and osteosarcoma. We performed microarray experiments for all of them and obtained lists of genes differentially expressed. We generated biological association networks with genes in common between both colon cancer cell lines, between both breast cancer cell lines or among the other three cell lines studied. We identified a highly interconnected node in a network (DKK1), a network formed by some members of UGT1A family, and a gene deregulated in pancreatic cancer, erythroblastic leukemia and osteosarcoma (EEF1A1). Functional validations of these three genes showed a sensitization toward MTX.

Recientemente se han demostrado los efectos beneficiosos de los ácidos grasos omega-3 en un gran número de patologías. Entre los mecanismos responsables de estos efectos protectores, destacan dos nuevas familias de mediadores lipídicos bioactivos derivados de estos ácidos grasos, denominadas resolvinas y protectinas, con importantes efectos protectores y antiinflamatorios en varios modelos de daño experimental.Tanto la enfermedad hepática crónica, como la obesidad y sus complicaciones hepáticas presentan un componente inflamatorio clave para su desarrollo, de manera que los ácidos grasos omega-3 podrían tener efectos protectores en estas patologías. Los objetivos del trabajo fueron investigar los efectos de los omega-3: i-) en la inflamación hepáticaii-) sobre el tejido adiposo y las complicaciones hepáticas asociadas a la obesidad.Para nuestro primer objetivo investigamos los efectos hepatoprotectores de los omega-3 sobre el daño genotóxico y el estrés oxidativo, sobre la necroinflamación hepática inducida por CCl4 en ratón, la generación hepática de mediadores lipídicos bioactivos derivados de los omega-3 y, por último, los efectos biológicos de los mediadores lipídicos bioactivos derivados de los omega-3 en eventos clave de la necroinflamación hepática.Los resultados del primer estudio indican que la administración de una dieta enriquecida con omega-3 induce la formación hepática de 17-HDHA y PD1, que reducen el daño genotóxico y el estrés oxidativo en lo hepatocitos, así como marcadores clave de inflamación en los macrófagos.Para el segundo objetivo investigamos los efectos de los omega-3 sobre la esteatosis hepática, sus efectos sensibilizadores a la insulina y sobre la expresión de adipoquinas, el perfil de eicosanoides y derivados bioactivos de los omega-3 en el tejido adiposo, y la contribución de RvE1 y PD1 en los efectos de los omega-3 sobre la esteatosis hepática y la resistencia a la insulina.Los resultados del segundo estudio indican que los omega-3 atenúan la esteatosis hepática, mejoran la tolerancia a la insulina, inducen genes sensibilizadores a la insulina en tejido adiposo e hígado, aumentan la expresión de adiponectina, activan AMPK e incrementan la formación de resolvinas y protectinas en el tejido adiposo. Además, RvE1 y PD1 reproducen los efectos beneficiosos de sus precursores omega-3 sobre la esteatosis hepática y la resistencia a la insulina.Las conclusiones de esta tesis son las siguientes:Los omega-3 protegen a los hepatocitos del daño genotóxico y del estrés oxidativo; disminuyen la necroinflamación y la degeneración hidrópica de los hepatocitos inducidas por CCl4; inhiben la expresión de COX-2 y 5-LO, así como la formación de PGE2; atenúan la esteatosis hepática en ratones obesos; mejoran la tolerancia a la insulina e inducen genes sensibilizadores a la insulina en el tejido adiposo y el hígado de ratones obesos; inducen la expresión génica y proteica de la adiponectina, sin modular las adipoquinas proinflamatorias resistina, MCP-1, TNF- e IL-6; activan AMPK en tejido adiposo y músculo en ratones obesos; son transformados a los mediadores lipídicos bioactivos 17-HDHA y PD1 en el hígado, y 17-HDHA, RvD1 y PD1 en el tejido adiposo de ratón.El 17-HDHA protege a los hepatocitos del daño genotóxico, del estrés oxidativo, reduce la liberación de TNF- en macrófagos y activa PPAR.RvE1 reduce la esteatosis hepática y los macrófagos en el hígado y aumenta la expresión génica de adiponectina y otros factores sensibilizadores a la insulina en el tejido adiposo de ratones obesos.PD1 induce la expresión de adiponectina en explantes de tejido adiposo de ratón obeso a niveles similares a los de la rosiglitazona.Estos resultados indican que los ácidos grasos omega-3 ejercen efectos protectores en la inflamación hepática y las complicaciones asociadas a la obesidad. Estos efectos beneficiosos están mediados, en parte, por la síntesis de resolvinas y protectinas. / Recently, omega-3 PUFA beneficial effects have been well-established in a number of pathologies. Among the mechanisms responsible for those protective effects, two novel families of bioactive lipid mediators termed resolvins and protectins, are thought to play a key role.Inflammation is a key factor for chronic liver disease, as well as obesity and obesity-induced alterations development. Thus, omega-3 PUFA might display important protective actions on these pathologies. The aim of the current study was to investigate omega-3 PUFA effects on: i-) hepatic inflammation.ii-) adipose tissue and obesity-induced alterations.First, we examined hepatoprotective actions of omega-3 PUFA on genotoxic damage and oxidative stress, CCl4-induced hepatic necroinflammation in mice, hepatic generation of omega-3 PUFA-derived bioactive lipid mediators, and their biological effects in key events for the pathophysiology of hepatic necroinflammation. The results of our first study indicate that an omega-3 PUFA-enriched diet induces 17-HDHA and PD1 hepatic formation, which are able to reduce genotoxic damage and oxidative stress in hepatocytes, as well as key inflammatory markers in macrophages.Second, we examined omega-3 PUFA actions on hepatic steatosis, insulin sensitivity and adipokines expression, eicosanoid and omega-3 PUFA-derived bioactive lipid mediators profile in adipose tissue, as well as RvE1 and PD1 contribution to omega-3 PUFA actions on hepatic steatosis and insulin resistance. The results of our second study indicate that omega-3 PUFA ameliorate hepatic steatosis and insulin tolerance, induce insulin-sensitizing genes in adipose and liver tissue, increase adiponectin expression, activate AMPK and induce resolvins and protectins formation in adipose tissue. Moreover, RvE1 y PD1 reproduce omega-3 PUFA beneficial effects on hepatic steatosis and insulin resistance. Taken together, these results indicate that omega-3 PUFA display potent protective actions on hepatic inflamation and obesity-induced alterations. These beneficial effects are mediated, at least in part, by resolvins and protectins synthesis from their omega-3 PUFA precursors.