Transgenic approaches hold great promise in alleviating, to a major extend such micronutrient deficiencies as exemplified by numerous reports in the literature over the past decade. However, there is a limited understanding of the regulatory mechanisms that control the accumulation of specific vitamins in plants. For this reason, I analyzed a maize population expressing combinations of the carotenogenic genes Zmpsy1, PacrtI, Gllycb, Glbch and ParacrtW in an effort to unravel as yet unknown regulatory bottlenecks.I also investigated in more detail the corn bch family. My results suggest that diverse regulatory strategies may be in operation to control the accumulation of carotenoids in endosperm tissue. I recovered multiple independent transgenic rice lines expressing Arabidopsis thaliana ρ hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD), which catalyzes the first committed step in vitamin E biosynthesis. My results revealed bottlenecks that act as metabolic tipping points in the pathway.

INTRODUCCIÓN: La señalización a través de los NOD-like receptors (NLRs), que son una familia de receptores citosólicos de reconocimiento de patrones (PRRs), da lugar al procesamiento y activación de las citoquinas pro-inflamatorias IL-1 β e IL-18 mediados por caspasa-1, así como de la inducción de una forma de muerte celular recientemente descrita llamada piroptosis. Para ello, los NLRs median la formación de plataformas multiproteicas de señalización llamadas inflamasomas, que alertan al sistema inmune de la presencia de infección o daño tisular. OBJETIVOS: (1) Establecimiento de un modelo de infección de Salmonella Typhimurium en pez cebra para estudiar la activación, el ensamblaje y el funcionamiento del inflamasoma; (2) Caracterización del papel de la flagelina de S. Typhimurium en el mecanismo de infección en pez cebra; (3) Caracterización del papel de Gbp4 de pez cebra en la activación y ensamblaje del inflamasoma, así como en la eliminación de S. Typhimurium; (4) Caracterización del papel de los neutrófilos en la eliminación de S. Typhimurium dependiente de Gbp4 en pez cebra; (5) Caracterización del papel de Gbp4 en la producción de prostaglandinas dependiente del inflamasoma, y del de las prostaglandinas en la eliminación de S. Typhimurium. METODOLOGÍA: Los métodos utilizados en la tesis doctoral son: Ensayos de infección con S. Typhimurium, ensayos de actividad caspasa-1, toma de imágenes de larvas de pez cebra, reclutamiento de neutrófilos y análisis de la muerte celular, ensayos de luminescencia, citometría de flujo, análisis de expresión génica, Western blot, ensayo de reconstitución del inflamasoma en células HEK293. RESULTADOS: Aquí demostramos que la proteína Gbp4 de pez cebra, una enzima GTPasa inducible por IFNγ que alberga un dominio C-terminal CARD, se expresa en los neutrófilos y es necesaria para la eliminación de Salmonella Typhimurium in vivo dependiente del inflamasoma. A pesar de la presencia del dominio CARD, Gbp4 requiere la presencia de la proteína adaptadora Asc para desempeñar su función antibacteriana. Además, la actividad GTPasa de Gbp4 es indispensable para la activación del inflamasoma, el reclutamiento de neutrófilos al lugar de la infección, y la eliminación de S. Typhimurium. La reconstitución de los complejos Gbp4-Asc en células embrionarias humanas de riñón (HEK293) en cultivo, nos mostró que forman complejos macromoleculares con un anillo exterior de Asc y un núcleo de Gbp4. Mecanísticamente, Gbp4 es esencial para la liberación de prostaglandinas dependiente del inflamasoma, de las cuales PGD2 se asocia con la eliminación de bacterias mediada por Gbp4. Por tanto, nuestros resultados señalan a las proteínas de unión con GTPasa como los adaptadores clave del inflamasoma necesarios para la biosíntesis de prostaglandinas y la eliminación de bacterias intracelulares por los neutrófilos in vivo. CONCLUSIONES: (1) El pez cebra es un excelente modelo para estudiar la activación y la función del inflamasoma en respuesta a una infección por S. Typhimurium; (2) El reconocimiento intracelular de S. Typhimurium en pez cebra depende altamente de la producción de flagelina; (3) La activación del inflamasoma dependiente de Gbp4 mejora la resistencia de las larvas de pez cebra e incrementa la actividad caspasa-1 después de la infección con S. Typhimurium; (4) Tanto Gbp4 mutante que carece de la actividad GTPasa, como el doble mutante al que también le falta el dominio CARD, se comportan como dominantes negativos, incrementando la susceptibilidad a S. Typhimurium y, en paralelo, reduciendo la actividad caspasa-1; (5) El mutante de Gbp4 sin el dominio CARD actúa, al igual que GBP5 de mamíferos, rescatando la elevada susceptibilidad de las larvas deficientes en Gbp4, pero no aumenta la actividad caspasa-1 después de la infección con S. Typhimurium en pez cebra; (6) Gbp4 regula el reclutamiento de neutrófilos al lugar de infección y, además, la eliminación de S. Typhimurium dependiente de Gbp4 esta mediada por los neutrófilos; (7) El inflamasoma dependiente de Gbp4 activa la biosíntesis de las prostaglandinas, que a su vez fomentan la eliminación de S. Typhimurium. / NTRODUCTION: The nucleotide-binding domain leucine-rich repeats (NLRs) constitute a family of cytosolic pattern recognition receptors (PRRs), which are the responsible for the caspase-1-mediated processing and activation of pro-inflammatory cytokines, such us IL-1 β and IL-18, and the induction of a recently described form of cell death called pyroptosis. NLRs achieve these functions by forming multiprotein signaling platforms, called inflammasomes, which alert the immune system about the presence of infection or tissue damage. OBJECTIVES: Taking that into consideration, the objectives of the present work are: (1) Establishment of a zebrafish – Salmonella Typhimurium infection model to study inflammasome activation, assembly and function; (2) Characterization of the role of flagellin of S. Typhimurium in the infection mechanism in zebrafish; (3) Characterization of the role of zebrafish Gbp4 in inflammasome activation, assembly and clearance of S. Typhimurium; (4) Characterization of the role of neutrophils in the Gbp4-dependent clearance of S. Typhimurium in zebrafish; (5) Characterization of the role played by the Gbp4 inflammasome in prostaglandin production and S. Typhimurium clearance. METHODOLOGY: The following methods were used in this doctoral thesis: yolk sac or ear infection assays with S. Typhimurium, caspase-1 activity assays of infected larvae, counting of neutrophils using different zebrafish transgenic lines with fluorescent neutrophils using live imaging, neutrophil recruitment assays, cell death analysis, luminescence assays for the measurement of Il1-β contents, flow cytometry and FACS-sorting of fluorescent cells, gene expression analysis, western blot, inflammasome reconstitution assays in HEK293 cells. RESULTS: Here we report that zebrafish Gbp4, an IFNγ-inducible GTPase harboring a C-terminal CARD domain, is expressed in neutrophils and is required for the inflammasome-dependent clearance of Salmonella Typhimurium in vivo. Despite the presence of the CARD domain, Gbp4 requires the universal inflammasome adaptor protein Asc for mediating its antibacterial function. In addition, the GTPase activity of Gbp4 is indispensable for the inflammasome activation, the neutrophil recruitment and the clearance of S. Typhimurium. Reconstitution of Gbp4-Asc complexes in human embryonic kidney cells (HEK293) revealed a macromolecular complex with an outer ring of Asc and an core of Gbp4. Mechanistically, Gbp4 is essential for the inflammasome-dependent release of prostaglandins, of which PGD2 is associated with the Gbp4-mediated bacterial clearance. Our results, therefore, point to GTPase-binding proteins as the key inflammasome adaptors required for prostaglandin biosynthesis and intracellular bacterial clearance by neutrophils in vivo. CONCLUSIONS: The above results suggest that: (1) Zebrafish is an excellent model to study inflammasome activation and function upon S. Typhimurium infection; (2) Intracellular recognition of S. Typhimurium in zebrafish highly depends on flagellin production; (3) Gbp4-dependent inflammasome activation improves zebrafish larvae resistance and increases caspase-1 activity upon S. Typhimurium infection; (4) A Gbp4 mutant lacking GTPase activity, as well as a double GTPase and CARD mutant, behave as dominant negatives by increasing the susceptibility to S. Typhimurium and, in parallel, decreasing caspase-1 activity; (5) A Gbp4 mutant lacking the CARD domain acts as mammalian GBP5; that is, rescues the higher susceptibility of Gbp4-deficient larvae but fails to increase caspase-1 activity upon S. Typhimurium infection in zebrafish; (6) Gbp4 regulates neutrophil recruitment to the site of the infection. In addition, the Gbp4-dependent clearance of S. Typhimurium is mediated by neutrophils; (7) The Gbp4-dependent inflammasome activates prostaglandin biosynthesis, which in turn promotes S. Typhimurium clearance.

La fibrosis hepática es el resultado de un proceso inflamatorio y de reparación de tejido en respuesta a un daño hepático prolongado y se define como la acumulación de tejido conectivo en el hígado debido a un importante desequilibrio entre la producción y la degradación de matriz extracelular. Mientras que la fibrosis hepática es un proceso reversible, su estadío final, la cirrosis, está considerado como el estadío irreversible y final de la enfermedad. Cuando la cirrosis es ya severa se produce la completa desestructuración del parénquima hepático dando lugar a la aparición de insuficiencia hepática y trastornos hemodinámicos graves. Una de las primeras complicaciones hemodinámicas es la aparición de hipertensión portal que tiene lugar como consecuencia de un incremento de la resistencia intrahepática al paso de flujo sanguíneo portal así como de un aumento intrínseco del tono vascular de la microvasculatura hepática. Existe un enorme interés científico no sólo por esclarecer los mecanismos celulares implicados en el desarrollo de fibrosis y cirrosis hepática sino también por identificar nuevas estrategias terapéuticas enfocadas a revertir o prevenir la progresión de esta enfermedad hepática.Una de las posibles dianas terapéuticas la constituye la vía biosintética de la 5-LO. La 5-LO es la enzima clave responsable de la síntesis de LTs, importantes mediadores lipídicos derivados del AA. Este grupo de eicosanoides incluye al LTB4 implicado principalmente en la respuesta inflamatoria y los cisteinil-LTs (LTC4/LTD4/LTE4) que son potentes agentes vasoconstrictores capaces de incrementar la permeabilidad vascular y ejercer importantes funciones proliferativas y profibrogénicas. En el hígado y a nivel experimental, los cisteinil-LTs son capaces de modificar tanto la presión hepática de perfusión como la extravasación de fluido vascular. Además, los estudios clínicos demuestran que en los pacientes con hepatopatía existe un incremento en la producción de estos eicosanoides lo que se ha asociado con el desarrollo de un incremento en la resistencia intrahepática y la aparición de colestasis. Sin embargo y hasta la realización de este proyecto de tesis doctoral, no se conocían con exactitud los mecanismos celulares de síntesis de estos eicosanoides en el hígado así como la implicación fisiopatológica de estos compuestos en el desarrollo de la cirrosis hepática y sus complicaciones. Por todo ello, los objetivos generales de este trabajo fueron:1. Caracterizar la biosíntesis y papel funcional de los cisteinil-LTs en el sinusoide hepático.2. Investigar el papel de la célula de Kupffer y de la 5-LO en la patogénesis de la fibrosis hepática experimental.En resumen, los resultados de este trabajo indicaron que en el hígado, no sólo la célula de Kupffer contribuye a la producción endógena de cisteinil-LTs sino que los hepatocitos contribuyen de forma importante a su producción mediante metabolismo transcelular. Además, estos eicosanoides pueden ejercer acciones paracrinas sobre las células hepáticas estrelladas y contribuir así al aumento de la resistencias intrahepáticas y a la aparición de hipertensión portal. Además, los resultados proporcionan la primera evidencia de que la presencia activa de la vía metabólica de la 5-LO es crítica para la supervivencia de las células de Kupffer y demuestran que la inhibición de la vía de la 5-LO en las células de Kupffer puede reducir la progresión de la fibrosis durante el daño hepático crónico experimental.

La melanogénesis es la ruta responsable de la biosíntesis de melaninas. Tirosinasa, la enzima limitante, presenta una alta homología con otras metaloenzimas implicadas, pero capacidades catalíticas diferentes (entre ellas y entre especies). Se han estudiado las relaciones estructura-función de estas proteínas. Las conclusiones más importantes han sido:-En humanos, tirosinasa es la enzima responsable de la actividad DHICA oxidasa de la ruta, en oposición a la enzima de ratón.-Se ha caracterizado el papel de dos importantes aminoácidos del centro activo de tirosinasa de ratón: His390 como tercer ligando del cobre en una región de unión a metal e His389 como responsable de la interacción enantioespecífica enzima-difenoles, pero no con monofenoles, introduciendo relevantes aportaciones al mecanismo del ciclo catalítico de tirosinasa.-La unión del cobre es un evento posterior en la maduración post-traduccional de la enzima, que además presenta dos sitios de glicosilación cuya ocupación es dependientes de conformación. / Melanogenesis is the biochemical pathway responsible for melanin synthesis. Tyrosinase, the rate-limiting enzyme, shows high homology with other metalloenzymes involved. However, they differ in their enzymatic capabilities (also among species). In our attempt to characterize the structure-function relationships in mammalian melanogenic enzymes, we showed that:-In human, tyrosinase accounts for the DHICA oxidase activity prior to melanin formation, while the murine enzyme is unable to catalyze DHICA consumption.-Two important residues in the active site of the protein have been characterized: His390 as the third copper ligand in the metal-binding region and His389 as the amino acid responsible for the stereospecific interaction enzyme-diphenolic substrates, but not monophenols. This conclusion allowed for the modification of several aspects of the classical catalytic mechanism of the enzyme.-Neither glycosylation of all the potential sequons nor copper binding are sine qua non requirements for maturation of tyrosinase and processing beyond the endoplasmic reticulum.

En las sociedades con transmisión paterna de los apellidos, la distribución de los mismos debería seguir el mismo recorrido que los linajes del cromosoma Y. Se evalúa esta hipótesis mediante la definición de haplotipos de microsatélites del cromosoma Y en ciento setenta y cinco individuos del Noroeste Argentino, que abarcan noventa y cinco apellidos. Se compararon estas dos fuentes de información, buscando concordancias entre y dentro de apellidos, trazando redes medianas, estimando el tiempo de divergencia y comparando los resultados obtenidos con la base de datos internacional YHRD. Se establecieron dos haplotipos nodales, uno nativo americano y otro de origen europeo, rodeados por el resto de los haplotipos. En un solo caso se encontró concordancia entre apellidos y los perfiles establecidos mediante microsatélites del cromosoma Y, y también se reconocieron linajes genéticos que involucraban diferentes apellidos. A su vez, para definir si las divergencias se debían a polifiletismo o a mutaciones recientes, se estimó la distancia temporal entre las muestras del mismo apellido y haplogrupo, encontrando que en cerca de la mitad de estos casos esta profundidad temporal excedía el origen de los apellidos. Estos datos sugieren que la transmisión irregular del apellido en el Noroeste Argentino fue más elevada que aquella encontrada en otros países. Asimismo, las similitudes entre ambos tipos de linajes no debe ser dada por sentado.

Información extraída del <a href="http://www.cindefi.org.ar/?page_id=61&language=es">sitio web del CINDEFI</a>

l cultivar de tomate MT presenta una serie de características fenotípicas, como un corto ciclo biológico (inferior a 3 meses) y pequeño tamaño (menos de 20 cm), que hacen que sea más adecuado para estudios en laboratorio que otros cultivares de tomate. El objetivo general planteado al iniciar este trabajo fue determinar el comportamiento in vitro del cv. MT, así como llevar a cabo un estudio de los perfiles de metabolitos secundarios y de los patrones de expresión proteica en suspensiones celulares sometidas a la elicitación con MJ, en presencia y en ausencia de dos tipos de β-CDs: metiladas al azar (CDsM) o hidroxipropiladas al azar (CDsH). El fin último es explorar el potencial de las suspensiones celulares derivadas del cv. MT para utilizar este sistema en la producción de metabolitos con alto valor añadido. Para abordar este objetivo se han utilizado diversas técnicas de análisis cromatográfico (HPLC-MS y GC-MS), electroforético (SDS-PAGE e IEF), citológico (TTC y FDA) y espectrofotométrico (determinaciones de metabolitos y de diversas actividades enzimáticas); también se ha llevado a cabo la microsecuenciación de fragmentos peptídicos por nanoLC ESI MS/MS y se han utilizado las herramientas bioinformáticas correspondientes para el análisis de los resultados. Las suspensiones celulares presentaron una acumulación de compuestos fenólicos y triterpenos máxima durante la fase de crecimiento exponencial. La elicitación de las suspensiones celulares con MJ y CDsM o CDsH, separadamente o en combinación, dio lugar a un aumento de los niveles de isofucosterol,sitosterol y taraxasterol, si bien los mayores cambios se registraron en los tratamientos con CDsM. Sin embargo, los mayores niveles de fenoles solubles totales se obtuvieron en los tratamientos combinados, sobre todo en el tratamiento CDsM+MJ. Además, ambos elicitores (CDs+MJ) actuaron de forma sinérgica en la producción de ácido cafeico en el medio intracelular, indicando que la naturaleza fisicoquímica de las CDs influyó en su capacidad para estimular la producción de metabolitos y para actuar como agentes secuestrantes. Por otra parte, en los tratamientos de elicitación se observó, en general, una diminución de las actividades enzimáticas peroxidasa, PAL, endoquitinasa y 1,3-glucanasa en presencia de CDsM y un aumento de dichas actividades enzimáticas en presencia de CDsH, en los tratamientos con MJ y, sobre todo, en los combinados (CDs+MJ), lo que indica que las CDs y el MJ son capaces de regular diferencialmente la actividad de estas enzimas. El análisis del proteoma extracelular de las suspensiones celulares mediante separación monodimensional en geles de poliacrilamida y microsecuenciación en las suspensiones elicitadas con CDsM+MJ permitió la identificación de diez fragmentos trípticos cuyas secuencias de aminoácidos mostraron homología con varías proteínas PR de S. lycopersicum, quitinasas, una proteína asociada a la muerte celular biótica y una peroxidasa catiónica. Estas proteínas podrían formar parte de las respuestas de defensa en suspensiones celulares de tomate MT. Además de las proteínas inducidas en el tratamiento de elicitación, se identificaron una serie de proteínas constitutivas, como proteínas PR del tipo PR-1 y PR-5, endoquitinasas, quitinasas, peroxidasas, una proteína inhibidora de endoglucanasas fúngicas específicas de xiloglucano (XEGIP) y otras enzimas hidrolíticas implicadas en la ruptura de xilanos y arabinoxilanos como la LeXYL2 y la α-L-Arabinofuranosidasa, que pueden estar implicadas en la modificación de la arquitectura de la pared celular durante el crecimiento del cultivo. / ABSTRACT The tomato cultivar Micro-Tom displays several phenotypic characteristics such as small size (less than 20 cm) and a reduced life cycle (less than three months), which make it more suitable for laboratory experiments than standard cultivars. The overall objective proposed in this research is to know the in vitro behavior of Micro-Tom as well as analyzing the response of MT cell cultures to elicitation with methyl jasmonate (MJ) and two cyclodextrins (randomly methylated cyclodextrins, CDsM, and randomly hydroxypropyl -cyclodextrins, CDsH), alone or in combination, exploring the changes on both secondary metabolite and protein expression patterns that occur in these cell cultures in the presence of these elicitors. To address this objective, a variety of different techniques including: chromatographic (HPLC-MS and GC-MS), electrophoretic (SDS-PAGE and IEF), cytological (TTC and FDA) and spectrophotometric (for the determination of metabolites and enzymatic activities) methods were used. Moreover, tryptic fragments of SDS-PAGE bands of interest were analyzed by nanoLC ESI MS/MS and the LC-ESI-MS/MS spectra submitted to the database-mining tool for protein identification. An accumulation of both phenolic and triterpenoids compounds was seen during the exponential phase of non-elicited cell suspension cultures. Under elicitation conditions, an increase in the levels of isofucosterol, -sitosterol and taraxasterol was observed, although the highest levels of these compounds were found in CDsM-treated cells. In contrast, the highest levels of phenolic compounds were detected in the presence of both elicitors, especially in CDsM+MJ-treated cells. Moreover, both elicitors act synergistically to stimulate the production of caffeic acid in the intercellular medium, suggesting that the physicochemical properties of CDs have a great influence in their ability to induce the production of secondary metabolites and in their metabolite-sequestering properties. On the other hand, a decrease in the enzymatic activities of peroxidase, PAL, endochitinase and -1,3-glucanase was observed in CDsM-treated cells whereas an increase of these enzymatic activities occurred in the presence of CDsH, MJ, and in the combined treatments, indicating that both elicitors are able to differentially regulate the activity of these enzymes. Analysis of the extracellular proteome showed the presence of amino acid sequences homologous to several pathogenesis-related (PR) proteins, a cationic peroxidase, and a biotic cell death-associated protein, which suggests that MJ and CDs could play a role in mediating defense-related gene product expression in MT. Moreover, several constitutive proteins were also identified such as PR 1 and 5 proteins, endochitinases, chitinases, peroxidases, an inhibitor protein of xyloglucan-specific fungal endoglucanase (XEGIP), and other hydrolytic enzymes like LeXYL2 and L-arabinofuranosidase, which are cell wall-degrading enzymes involved in the breakdown of xylans and arabinoxylans, suggesting their involvement in the modification of the cell wall architecture during cell culture growth.

Esta Tesis Doctoral recoge el trabajo de investigación que se ha realizado en dos líneas desarrolladas de forma paralela sobre Escherichia coli. Por un lado, la optimización de un proceso de biotransformación para mejorar la síntesis de L( )-carnitina mediante técnicas de ingeniería metabólica. Y por otro, la determinación de los principales efectos que provoca la exposición prolongada a altas concentraciones de sal y su respuesta de adaptación, principalmente cuando las fuentes de carbono pueden contener altas concentraciones de sal y tanto el sustrato como el producto son osmoprotectores. Para ello, se han aplicado técnicas utilizadas por la biología de sistemas y la ingeniería metabólica. La importancia de L( )-carnitina viene determinada por el papel que desempeña en el metabolismo energético, de hecho su deficiencia está asociada a diversas patologías. Varios trabajos centrados en la aplicación terapéutica de L( )-carnitina han demostrado que su administración puede ayudar a suplir dicha carencia. A partir de este punto, comienza una creciente actividad investigadora centrada en la producción de L( )-carnitina. Este trabajo presenta un método alternativo basado en la utilización de E. coli para llevar a cabo la biotransformación de compuestos de bajo valor añadido como puede ser D(+)-carnitina y/o crotonobetaína en L( )-carnitina. Por medio de técnicas de biología molecular se ha modificado genéticamente una cepa de E. coli, consiguiendo la sobreexpresión de caiC y mejorando el rendimiento de la cepa silvestre. Además, para optimizar la producción de L( )-carnitina se han estudiado aspectos relacionados con el metabolismo de carnitina como la disponibilidad de coenzima A o la inhibición de una ruta metabólica que favorezca la transformación del sustrato en L( )-carnitina. Posteriormente, se obtuvo una cepa modificada más estable y con una alta capacidad para la producción de L( )-carnitina, para ello se han implementado diversas estrategias de ingeniería metabólica. Las mutaciones implicadas en la mejora de esta cepa fueron: a) la deleción del gen aceK para incrementar el flujo hacia el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, b) la deleción del gen caiA para impedir la síntesis de γ-butyrobetaína (productos del metabolismo de carnitina), y c) la sustitución del promotor natural altamente regulado del operón cai por un promotor artificial constitutivo. Con dichas mutaciones implementadas en una misma cepa, no sólo se consiguió aproximadamente un 100 % de conversión de crotonobetaína en L( )-carnitina en las condiciones de ensayo, sino que también la limitación impuesta por la presencia de oxígeno fue superada por este mutante, lo que indica la importancia de la ingeniería metabólica en la mejora de procesos biotecnológicos. L(-)-carnitina o compuestos similares son utilizados como osmoprotectores, acumulándolos en el interior celular, para evitar la deshidratación cuando la osmolaridad del medio se incrementa. Ante estas situaciones, los microorganismos pueden adaptarse y dar una respuesta pasajera, o realizar un proceso de adaptación para mantener su supervivencia mientras el estrés está presente. En este trabajo, se observó la evolución y la respuesta generada de una cepa de E. coli cultivada en un reactor continuo y sometida a tres concentraciones crecientes de sal (moderada, alta y muy alta). La medida de las actividades enzimáticas de las principales rutas metabólicas, así como la determinación de los metabolitos fermentativos producidos, resaltaron el importante papel ejercido por el metabolismo central en la adaptación y en la supervivencia celular tras una larga exposición a estrés salino, así como la necesidad de disponer de precursores biosintéticos y de energía en forma de ATP. Además, se profundizó en el estudio del comportamiento celular realizando una aproximación desde la biología de sistemas, integrando los niveles metabolómico, flujómico y transcriptómico. Se debe destacar que se observaron dos conjuntos de respuestas consecuencia de la concentración de sal presente en el medio. Uno dirigido a mantener unos niveles energéticos umbrales en la célula, basado tanto en el incremento de los flujos metabólicos hacia rutas que permitían la generación de energía, como en la reducción de procesos no esenciales para la supervivencia. Y otro, una respuesta característica en las células expuestas a alta o a muy alta concentración de sal, que estuvo caracterizada no sólo por cambios en los patrones de fermentación metabólica sino también por una alteración significativa del estado redox celular. Así, con el uso de técnicas apropiadas se han podido detectar un gran número de cambios en la fisiología y el metabolismo de E. coli. Además, la aproximación de la biología de sistemas ofrece una forma de obtener e integrar gran cantidad de información, que de otra forma se perdería por la cantidad de información que se obtiene. Finalmente, la ingeniería metabólica y la biología de sistemas han aportado una excelente manera de mejorar y conocer las características de los microorganismos involucrados en los procesos biotecnológicos relacionados con la producción de L( )-carnitina. / Two parallel research aims addressed on Escherichia coli are shown in this PhD thesis. On one hand, the optimization of a biotransformation process in order to improve L( )-carnitine synthesis by using metabolic engineering techniques is explained within the first chapters. On the other hand, in the following chapters, the main effects provoked by long-term high salt concentrations and the adaptative response to osmotic stress were determined using different techniques related to systems biology. L( )-carnitine is an important trimethylammonium compound because of its role in the energetic metabolism, in humans, several pathologies are related with deficiencies of carnitine level. Several works focused on the therapeutic application of L( )-carnitine, showed that administration of this compound could be a solution as opposed to its absence. Once different carnitine production ways were revised, this work shows an alternative method using Escherichia coli to carry out the biotransformation from D(+)-carnitine and/or crotonobetaine into L( )-carnitine. By using molecular biology techniques a strain of E. coli was engineered, obtaining caiC overexpression and enhancing the production yield respect to the wild type strain. Moreover, several aspects related with carnitine metabolism, such as coenzyme A availability and the inhibition of specific metabolic pathways were studied to optimize the carnitine production. Afterwards, various metabolic engineering strategies were implemented, obtaining a stable engineered strain with high capacity to produce L( )-carnitine. The modifications carried out were: a) deletion of the aceK gene (encoding a bifunctional protein phosphatase/kinase which performs post-translational control of isocitrate dehydrogenase) in order to increase the metabolic flux towards TCA cycle, b) deletion of the caiA gene (encoding the crotonobetainyl-CoA reductase) to avoid synthesis of γ-butyrobetaine (byproduct of the carnitine metabolism), and c) replacement of the highly regulated natural promoter of the cai operon by a constitutive promoter. These mutations implemented in the same strain led to obtaining almost 100% conversion from crotonobetaine to L( )-carnitine in the assay conditions. Moreover, the main restrictions impossed to the aerobic expression of the carnitine metabolism were eliminated producing L( ) carnitine in the presence of oxygen. Therefore, this work emphasizes the important role of metabolic engineering to improve any biotechnological process. On the other hand, L( )-carnitine and similar compounds are used as osmoprotectors, which are accumulated in high concentrations, either through the uptake from the medium or through de novo synthesis inside the cells, to avoid dehydratation when the osmolarity of the culture medium increases. Under these conditions, microorganisms have different response to an environmental stress, short-term or shock and long-term adaptation. In this work, evolution and response to long-term adaptation were analyzed in a E. coli strain growing in continuous reactors supplemented with a gradually increasing concentration of NaCl (moderate, high and very high). Enzyme activities from the main metabolic pathways and fermentative metabolites were analyzed, highlighting important role of central metabolism on adaptation and cellular survival after salt stress exposition. Furthermore, the need of biosynthetic precursors and energy as ATP were shown. In addition, a systems biology approach was conducted to study cellular behavior. In order to estimate the critical modifications undergone to overcome stress and to develop tolerance to salt, the metabolism was examined at several levels using different techniques (metabolomics, fluxomics and transcriptomics). Under salt stress conditions two set of responses were shown. One of them was focused to maintain the energetic threshold in cells, thus, either an increment of the metabolic pathways which could produce energy or a decrease of no-essential processes to survive were shown. On the other hand, cells under high or very high salt concentrations showed another similar response characterized by both changing on pattern of fermentative pathways and redox state. Therefore, using suitable techniques many changes in the physiology and metabolism of the E. coli strain in use were detected. Moreover, the systems biology approach offered a way to obtain and integrate a large amount of information, preventing some of the information being overlooked by the massive amount of data. Both the metabolic engineering and systems biology approaches have provided excellent ways to improve and know features of microorganisms involved in biotechnological processes related with the L( )-carnitine production.

El cáncer de mama es la principal causa de mortalidad por cáncer en las mujeres en todo el mundo, con una estimación de 1,68 millones de nuevos casos y más de 521.000 muertes sólo en 2012. Las mujeres con una historia familiar de cáncer de mama tienen de 1,5 a 3,9 veces más probabilidades de desarrollar cáncer de mama que las mujeres sin antecedentes familiares, en función del número y grado de parentesco de los miembros de la familia afectados. Aunque esta asociación podría surgir a causa del entorno compartido y estilo de vida, también puede ser debido a la susceptibilidad genética heredada. Los genes con mayor penetrancia y prevalencia en el Síndrome de Cáncer de Mama y Ovario Hereditario (CMOH) son BRCA1 y BRCA2, los cuales explican el 20% de este síndrome. Se ha realizado una caracterización molecular y un análisis de prevalencia de las variantes encontradas de BRCA1 y BRCA2 en 396 familias de riesgo de CMOH de la Región de Murcia. Para la secuenciación de exones y zonas colindantes de BRCA1 y BRCA2 hemos empleado el método de modificación de Sanger por secuenciación automática de electroforesis capilar y la pirosecuenciación (Gs Junior 454, Roche Diagnostics). El screening de los reordenamientos genéticos se realizó por tecnología MLPA. Para la comprobación de los reordenamientos detectados utilizamos la tecnología de PCR a tiempo real y para demostrar el efecto fundador de las variantes patogénicas de nueva descripción con más de una familia no relacionada se realizó análisis de microsatélites. El 17,7% de las familias es portadora de alguna variante patogénica en BRCA1/2 y el 11,49% fueron variantes de significado clínico desconocido. Siete variantes patogénicas fueron de nueva descripción, de las cuales c.1918C>T (BRCA1) proviene de un ancestro común en nuestra Región. Se han identificado variantes de efecto clínico desconocido de mayor probabilidad patógena según estudios in silico. Las variantes de efecto clínico desconocido missense de mayor probabilidad patógena han resultado ser c.946A>G (BRCA1), c.3032C>G (BRCA2), c.7559G>T (BRCA2) y c.9875C>T (BRCA2); mientras que las variantes splicing de mayor probabilidad patógena han sido c.68-7T>A (BRCA2), c.7008-14delT (BRCA2) y c.4501+3A>T (BRCA2). Los pacientes portadores de una variante patogénica en BRCA1/2 tienen mayor riesgo de tener un cáncer bilateral de mama y cáncer de mama en varón que en el resto de pacientes BRCAX. Existe asociación entre los pacientes BRCA1+ y los cánceres de mama triple negativo, con mayor presentación del tipo histológico medular. Los cánceres de ovario BRCA1/2+ suelen ser de tipo histológico seroso y existe una mayor prevalencia de este tipo de cáncer en BRCA1 con respecto a BRCA2 en nuestro estudio (33% vs. 16,7%, respectivamente). A / Breast cancer is the leading cause of cancer death in women worldwide, with an estimated 1.68 million new cases and 521,000 deaths in 2012. Women with a family history of breast cancer are 1.5 to 3.9-fold more likely to develop breast cancer than women without a family history, depending on the number and degree of kinship of the affected family members. Although this association could arise because of the shared environment and lifestyle, it can also be due to inherited genetic susceptibility. BRCA1 and BRCA2 are genes with greater penetrance and prevalence in Hereditary Breast and Ovarian Cancer (HBOC), but account 20% of these cancers. In this study we performed a molecular characterization and analysis of prevalence of BRCA1 and BRCA2 mutations in 396 families at risk of HBOC in the Region of Murcia. For sequencing of exons and adjacent areas of BRCA1 and BRCA2 genes, we used the method of modification of Sanger sequencing by automated capillary electrophoresis and pyrosequencing (Junior Gs 454, Roche Diagnostics). The screening of gene rearrangements was performed by MLPA technology. For the verification of detected rearrangements we used real-time PCR and to demonstrate founder effect of novel pathogenic variants with more than one unrelated family, microsatellite analysis was performed. The 17.7% of families are carriers of a pathogenic variant in BRCA1/2 and 11.49% are unknown variants. Seven pathogenic variants were novel, which c.1918C> T (BRCA1) comes from a common ancestor in our region. Have been identified unknown variants of increased pathogenic probability according to in silico tools. Missense variants of unknown clinical effect likely pathogenic were c.946A>G (BRCA1), c.3032C>G (BRCA2), c.7559G>T (BRCA2) and c.9875C>T (BRCA2); while splicing variants likely pathogenic were c.68-7T>A (BRCA2), c.7008-14delT (BRCA2) and c.4501+3A>T (BRCA2). BRCA1/2 carriers are at increased risk of having a bilateral breast cancer and male breast cancer than patients BRCAX. There is an association between BRCA1+ patients and triple negative breast cancers with medullary histological type overpresentation. Ovarian cancer BRCA1/2+ are usually serous histological type and there is a higher prevalence of this type of cancer in BRCA1 regarding BRCA2 (33% versus 16.7%, respectively).

El embarazo es un período de aumento de las demandas metabólicas, principalmente debido a los cambios en la fisiología de la mujer y requisitos del crecimiento fetal. Durante este período, la deficiencia de oligoelementos tiene efectos perjudiciales sobre la salud, tanto de las mujeres como en el desarrollo del feto. Hay una creciente preocupación por las amenazas que plantea la exposición de metales pesados intraútero sobre los resultados del embarazo y/o efectos adversos del desarrollo fetal en los niveles inferiores a las directrices internacionales. El feto es más sensible a la toxicidad de los metales pesados por carecer éte de los mecanismos de reparación necesarios. El propósito de esta investigación fue examinar las concentraciones de oligoelementos, así como los parámetros analíticos en sangre de gestantes a término y explorar posibles marcadores que pudieran actuar como factores de riesgo que permitieran pronosticar la rotura prematura de membranas (RPM) durante la gestación. Para la realización de esta investigación se aplicó un diseño retrospectivo de casos y controles. Los casos estuvieron formados por gestantes que sufrieron RPM (n = 51), mientras que los controles lo conformaron gestantes que no sufrieron RPM (n = 50). Las gestantes a término se seleccionaron de forma aleatoria en la unidad de Paritorio del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca, obteniendo datos clínicos y sociodemográficos de la gestante y del neonato, determinaciones analíticas sanguíneas y análisis de 23 elementos traza en sangre mediante Espectrometría de Masas (ICP-MS). Los objetivos del estudio fueron: (1) Examinar el perfil inflamatorio y las concentraciones de oligoelementos en sangre de gestantes a término; (2) investigar las posibles relaciones entre variables sociodemográficas y clínicas de la gestante y del neonato con las concentraciones de los oligoelementos; (3) examinar variables (inflamatorias y oligoelementos) que pudieran utilizarse como marcadores para pronosticar el riesgo de RPM en gestantes, y (4) proponer un modelo predictivo capaz de identificar los predictores, de la RPM en gestantes a término, tomando en consideración el perfil inflamatorio y los oligoelementos analizados. Las conclusiones del estudio fueron las siguientes: (1) Las gestantes a término presentaron concentraciones de bario, cromo, estaño, estroncio y titanio que se sitúan por encima de los valores de referencia. Por el contrario se observaron concentraciones por debajo de los valores de referencia en bromo, hierro, manganeso, plomo y selenio. (2) En la comparación con gestantes multíparas, las gestantes nulíparas presentaron concentraciones superiores de boro y calcio, y concentraciones inferiores de estroncio y manganeso. La edad de la gestante presentó una correlación positiva con las concentraciones de estroncio y una correlación negativa con las de cromo. Se observó una correlación positiva entre las concentraciones de estroncio en sangre materna y el peso del neonato. En la prueba de Apgar neonatal a los 5 minutos se observó una correlación negativa para las concentraciones de sodio. (3) En la hematimetría, el grupo de pacientes con RPM presentaron mayores niveles de actividad de Protombina y menores niveles en la concentración de plaquetas, el tiempo de Protrombina, la ratio tiempo de Protrombina y el índice INR. En cuanto a los oligoelementos, el grupo RPM presenta una concentración inferior de bario en sangre. Se observó una correlación positiva en el grupo de RPM, entre aluminio y tiempo de expulsivo. (4) Las variables que mejor discriminan entre gestantes que han sufrido y que no han sufrido RPM son las concentraciones en sangre materna de bario, plaquetas y la ratio tiempo de Protrombina. Sería necesario un adecuado control de las deficiencias de determinados elementos traza esenciales y la exposición a metales tóxicos en pacientes gestantes, ya que estas variaciones en sangre materna podrían ser factores asociados a patologías gestacionales como la RPM y parto pretérmino, que constituyen la principal causa de morbi-mortalidad neonatal. / Pregnancy is a period of increased metabolic demands, mainly due to changes in the physiology of women and fetal growth requirements. During this period, deficiency of trace elements has detrimental effects on the health of both women and fetal development. There is a growing concern about the threats posed by heavy metals in utero exposure on pregnancy outcome and / or adverse effects of fetal development at lower levels to international guidelines. The fetus is more sensitive to the toxicity of heavy metals because they lack the mechanisms necessary repair. The purpose of this research was to examine the concentrations of trace elements and laboratory parameters in blood of pregnant women at term and explore possible markers that could act as risk factors that predict allow premature rupture of membranes (PROM) during pregnancy. To carry out this research a prospective case-control design was applied. The cases were formed by pregnant women who suffered PROM, while controls were formed by the pregnant women who did not suffer PROM. In our study 101 women were selected, pregnant to term, randomly chosen in the Delivery Room Unit University Hospital Virgen de la Arrixaca obtaining clinical and sociodemographic data of pregnant women and newborn, blood laboratory tests and analysis of 23 trace elements in blood using Mass Spectrometry (ICP-MS). The study objectives were: 1. to examine the inflammatory profile and concentrations of trace elements in the blood of pregnant women at term, 2. To investigate the possible relationship between sociodemographic and clinical variables of the mother and newborn with the concentrations of trace elements, 3. A third goal consisted of examining (inflammatory and trace elements) variables that could be used as markers to predict risk in pregnant PROM, 4. Propose a predictive model capable of identifying predictors of PROM in pregnant women at term, considering the inflammatory profile and trace elements analyzed. The most important conclusions of the study were: 1. The term pregnant women had concentrations of barium, chromium, tin, strontium and titanium that are above the baseline. Contrarily concentrations were below the reference values of bromine, iron, manganese, lead, and selenium, 2. In comparison with multiparous pregnant, nulliparous had higher concentrations of boron and calcium and lower concentrations of strontium and manganese. The age of the mother was positively correlated with the concentrations of strontium and a negative correlation with chromium. A positive correlation between the concentrations of strontium in maternal blood and neonatal weight was observed. The neonatal Apgar test at 5 minutes a negative correlation for sodium concentrations was observed, 3. The group of patients with PROM obtained in the hematimetria higher levels of Prothrombin activity and lower levels in the platelet count, Prothrombin time, the ratio of Prothrombin time and INR rate. As for PROM group trace elements has a lower concentration of barium in blood. A positive correlation was observed in the group of PROM, between aluminum and time to expulsion, 4. The variables which best discriminated between pregnant women who have suffered PROM are maternal blood concentrations of barium, platelets and Prothrombin time ratio. It would require adequate control deficiencies of certain essential trace elements and exposure to toxic metals in pregnant patients because these variations in maternal blood could be factors associated with gestational diseases such as premature rupture of membranes and preterm delivery, which are the leading cause of neonatal morbidity and mortality.