Em todo o mundo, menos de 5% dos doentes com tuberculose (TB), sejam casos novos ou previamente tratados, tem a avaliação dos isolados quanto ao perfil de sensibilidade aos antibioticos. No Rio Grande do Sul, estado localizado no sul do Brasil, cerca de 4700 casos novos de TB são registrados a cada ano, com uma taxa de cura de 68,9%, e uma taxa de abandono de 7,5%. A identificação rápida da resistência às drogas, em isolados clínicos de M. tuberculosis é importante para o estabelecimento de uma quimioterapia eficaz bem como para evitar a propagação de cepas resistentes. Os objetivos deste estudo foram caracterizar os pacientes de TB com maior risco de possuir TB-­‐MDR, analisando o perfil de resistência às drogas dos isolados e o perfil epidemiológico desses pacientes. Além disso utilizou-­‐se as amostras clínicas para avaliar o teste comercial (GenoType® MTBDRplus) e para desenvolver e padronizar um novo teste (Detect-­‐TBMR) para detectar as mutações mais frequentes associadas a resistência à INH e RIF. Uma proporção significativamente maior (75% versus 20%, p = 0,009) de pacientes do gênero masculino foi encontrada entre os casos resistentes às drogas do que entre os casos suscetíveis. 43,8% dos pacientes demoraram mais de 30 dias para procurar assistência médica e no grupo TB MDR, 25% dos casos não tinha sido submetido a qualquer tratamento prévio anti-­‐TB. Em nossas amostras, encontramos uma proporção de 48,3% de TB-­‐ MDR. A família T foi a família de spoligotipo mais frequente. Comparado com o método da proporções, a sensibilidade e especificidade do ensaio MTBDRplus foram 82% e 94% para a resistência à RIF, 60% e 94% para resistência à INH. Comparado com sequenciamento, a sensibilidade e especificidade do ensaio MTBDRplus foi 92% e 97% para a resistência à RIF e 100% e 100% para a resistência à INH, respectivamente. Para detectar resistência à RIF e INH, o ensaio Detect-­‐TBMDR mostrou sensibilidade e especificidade de 79,3% e 77,0% e 100% e 65%, respectivamente, em comparação com o método da proporções. Comparado com o sequenciamento, a sensibilidade e especificidade do ensaio Detect-­‐TBMDR foi de 81,2% e 94,7% e 100% e 96,2%, para detectar e resistência à RIF e INH, respectivamente. Ainda existem discordâncias entre o método das proporções e a abordagem molecular, particularmente em relação a resistência à INH. Contudo, estes métodos são muito importantes para o manejo mais rápido e correto dos pacientes, auxiliando na escolha do melhor esquema terapêutico. / In most parts of the world, less than 5% of new and previously treated tuberculosis (TB) patients are tested for multidrug resistance (MDR) TB. In Rio Grande do Sul state, the southern most Brazilian state; approximately 4700 new cases of TB are recorded each year, with a cure rate of 68.9%, and a noncompliance rate of 7.5%. Rapid identification of drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis is important to facilitate rapid and adequate chemotherapy of TB, and to prevent the spread of resistant strains. The aim of this study was to characterize TB patients at higher risk of having MDR-TB, to analyze the drug resistance and epidemiological profile of these patients. Use the clinical samples to assess the commercial test (GenoType® MTBDRplus) and develop and standardize a new test (Detect-MDRTB) for detecting the most frequent mutations associated with resistance to INH and RIF. A significantly higher proportion (75% versus 20%, p = 0.009) of males were found among drug-resistant cases than drug susceptible cases. 43.8% of patients took longer than 30 days to seek medical care and in the MDR group 25% of the cases did not undergo any previous anti-TB treatment. In our samples we found a proportion of 48.3% of MDR-TB. The T family was the most frequent spoligotype family. Compared with the proportion method, the sensitivity and specificity of the MTBDRplus assay were 82% and 94% for RIF-resistance, 60% and 94% for INH resistance. Compared with sequencing, the sensitivity and specificity of the MTBDRplus assay were 92% and 97% for RIF-resistance, 100% and 100% for INHresistance. To detect RIF and INH-resistance, the Detect-TBMDR assay showed a sensitivity and specificity of 79.3% and 77.0%, and 100% and 65%, respectively, compared to proportion method. When compared with sequencing, Detect-TBMDR assay, to detect RIF and INH-resistance, showed a sensitivity and specificity of 81.2% and 94.7% and to 100% and 96.2%, respectively. Discordances still exist between the proportion method and molecular approach, particularly regarding INH-resistance. However, these methods are very important for the management faster and correct patient, helping to choose the best treatment regimen.

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La calcificació vascular és una complicació de la malaltia renal crònica i una de les principals causes de l’augment de morbiditat i mortalitat en els pacients. Aquests pacients presenten una disminució en els nivells de vitamina D (1,25(OH)2D3) i desenvolupen hiperparatiroïdisme secundari. Per aquest motiu, pacients amb MRC són tractats amb calcitriol o altres anàlegs. La 25-hidroxivitaminaD també s'utilitza, però sense cap coneixement de la seva eficàcia i toxicitat. Les recomanacions actuals indiquen que s’ha de suplementar amb 25D per assolir un llindar determinat que pugui afectar les accions clàssiques i no clàssiques de la vitamina D en l'organisme. No obstant això, l’ incidència directa en l'homeòstasi del calci (sense convertir-lo en calcitriol) no s’entèn. En el present treball, s’ha determinat l'efecte de la urèmia en la regulació de gens del metabolisme de la vitamina D i el paper de la síntesi local de calcitriol en la urèmia sobre la calcificació vascular utilitzant els ratolins KO per la 1αhidroxilasa. També, hem estudiat l'eficàcia i la seguretat del tractament amb 25D en el metabolisme mineral en un model de reducció del 75% de la massa renal en ratolins que no tenen la 1αhidroxilasa i el seu possible efecte toxic en ratolins wild-type. Resultats inicials en rates mostren que la urèmia desregula l’expressió de proteïnes implicades en el metabolisme de la vitamina D en cèl•lules de múscul llis vascular (VSMC), augmentant l'expressió de la 1αhidroxilasa. Aquesta regulació és específica de teixit i és diferent en el ronyó. Ratolins wild-type amb un model de MRC tractats amb altes dosis diàries de calcitriol (400ng/Kg) durant dues setmanes mostren una pèrdua de pes significativa, mentre que els 1αKO no perden pes. Nivells sèrics de calci, fòsfor, BUN i 1,25D augmenten i són similar en els dos grups tractats. D'altra banda, els nivells de PTH disminueixen en ambdòs grups per sota dels valors normals. La calcificació vascular augmenta de forma significativa en els ratolins WT en comparació amb ratolins 1αKO. Resultats similars s'observen amb tinció de vermell d’alizarina i l’immunohistoquímica de Runx2, que augmenta només en ratolins WT. In vitro, les CMLV WT tractades amb sèrum urèmic també mostren un augment significatiu de la calcificació i del runx2, que no s'observa en les cèl·lules 1αKO. Quan les CMLV de rata s’obrexpressen la 1αhidroxialsa també calcifiquen més en comparació amb les cèl•lules control. Aquests resultats indiquen que la 1αhidroxilasa actuaria com a mediador de la calcificació vascular en la urèmia incrementant la síntesis local de 1,25(OH)2D3. Fet que és d’especial interès en els pacients amb malaltia renal que són tractats amb 25OHD3. Per a estudiar l'efecte de la 25D, es va realitzar un estudi dosi-respostaen ratolins 1αKO nefrectomitzats amb 25, 50 i 100 ng/g de 25(OH)D3 per comparar-ho amb una dosi única de 1,25(OH)2D3 (50pg/g). L’administració de 25(OH)D3 pot normalitzar el Ca, P i PTH en sèrum amb una potència semblant a la de la 1,25D en un model de ratolí 1αKO amb MRC, un ratolí incapaç d’activar la 25D a 1,25D. Confirmant una unió directa i activació del VDR per la 25D. La 25D també pot activar el VDR per imitar la 1,25D en la up-regulació de gens i proteïnes que medien el transport transcellular de calci en el ronyó (TRPV5, Calbindin-D28k, PMCA1b) i en el duodè (TRPV6, Calbindin D9k i PMCA1b) en els 1αKO nefrectomitzats. Les dosis de 25D necessàries per imitar la 1,25D en la correcció de les anomalies en el transport de calci transcel·lular a nivell renal i duodenal causen un augment en els nivells de 25D en sèrum per sobre dels nivells recomanats en pacients amb MRC. La calcificació vascular que s'observa en ratolins WT mostra un efecte tòxic del tractament. També, hem observat que la 25D és capaç d'activar la 24hidroxilasa i el VDR en CMLV, mostrant la capacitat de la 25D d’activar directament el VDR a l'artèria. En conclusió, tots aquests resultats suggereixen que la producció local de calcitriol per la 1αhidroxilasa en l'artèria mediaria la calcificació vascular observada en la urèmia. Resultats que indiquen que els tractaments amb 25D en pacients amb MRC han de fer-se de forma controlada tant pel seu efecte directe activant el VDR com a causa de l’increment de la 1αhidroxilasa en la urèmia la qual afavoriria la seva transformació a 1,25(OH)2D3 produint toxicitat. / La calcificación vascular es una complicación de la enfermedad renal crónica y una de las principales causas del aumento en la morbilidad y mortalidad en los pacientes. Estos pacientes presentan una disminución en los niveles de vitamina D (1,25(OH)2D3) y desarrollan hiperparatiroidismo secundario. Por esta razón, los pacientes con ERC son tratados con calcitriol u otros análogos. También se utiliza la 25-hidroxivitamina D, pero sin ningún conocimiento de su eficacia y toxicidad. Las recomendaciones actuales sugieren que se complemente con 25D para alcanzar un cierto umbral que pueda afectar las acciones clásicas y no clásicas de la vitamina D. Sin embargo, el impacto directo en la homeostasis del calcio (sin convertirlo en calcitriol) no se conoce. En el presente estudio, se determinó el efecto de la uremia en la regulación de genes del metabolismo de la vitamina D y el papel de la síntesis local del calcitriol en la uremia y su efecto sobre la calcificación vascular utilizando ratones KO para la 1αhidroxilasa. También, se estudió la eficacia y la seguridad del tratamiento con 25D en el metabolismo mineral en ratones que carecen de la 1αhidroxilasa con una reducción del 75% de la masa renal y el efecto en ratones WT de la dosis efectiva para reducir los niveles de PTH en ratones KO. Los primeros resultados en ratas demuestran que en la uremia se desregula la expresión de las proteínas implicadas en el metabolismo de la vitamina D en las células musculares lisas vasculares (CMLV), aumentando la expresión de la 1αhidroxilasa. Esta regulación es específica del tejido y es diferente de la del riñón. Los ratones wild type con un modelo de ERC tratados con dosis elevadas de calcitriol (400ng/Kg) muestran una pérdida significativa de peso, mientras que los 1αKO no pierden peso. Los niveles séricos de calcio, fósforo, BUN y 1,25D suben y son similares en los dos grupos. Por otro lado, los niveles de PTH caen por debajo de los valores normales en ambos grupos. La calcificación vascular aumenta significativamente en los ratones WT en comparación con los 1αKO. Resultados similares fueron observados con la tinción rojo de alizarina y la immunohistoquímica de Runx2, aumentando sólo en los ratones WT. In vitro, las CMLV WT tratadas con suero urémico también muestran un aumento significativo de la calcificación y de la expresión de runx2, que no se observa en las células 1αKO. Cuando las CMLV de rata sobrexpresan la 1αhidroxilasa calcifican más en comparación con las células control. Estos resultados indican que la 1αhidroxilasa actuaria como mediador de la calcificación vascular en la uremia incrementando la síntesis local de la 1,25(OH)2D3. Hecho que es de especial interés en los pacientes con enfermedad renal tratados con 25OHD3. Para estudiar el efecto de la 25D, se realizó un estudio de dosis-respuesta con ratones 1αKO nefrectomizados y tratados con 25, 50 y 100 ng/g de 25(OH)D3 y se compararon con una sola dosis de 1,25(OH)2D3 (50pg/g). La administración de 25(OH)D3 puede normalizar el Ca, P y PTH en suero con una potencia similar a la del 1,25D en un modelo de ratón 1αKO con ERC. Confirmando un efecto directo y activador de la 25D sobre el VDR. La 25D también puede activar el VDR para imitar la 1,25D en la regulación de genes y proteínas que median el transporte transcelular de calcio en el riñón (Calbindin-D28k, TRPV5, PMCA1b) y en el duodeno (Calbindin D9k y TRPV6, PMCA1b) en ratones 1αKO nefrectomizados. Las dosis de 25D necesarias para imitar la 1,25D en la corrección de las alteraciones en el transporte de calcio transcelular a nivel renal i duodenal producen un aumento en los niveles de 25D en el suero por encima de los niveles recomendados en pacientes con ERC. Además, esta dosis causa calcificación vascular en ratones WT. También hemos observado que la 25D es capaz de activar la 24hidroxilasa i el VDR en las CMLV, mostrando la capacidad de la 25D de activar de forma directa el VDR en la arteria. En conclusión, estos resultados sugieren que la producción local de calcitriol por la 1αhidroxilasa en la arteria mediaría la calcificación vascular observada en la uremia. Además los tratamientos con 25D en pacientes con ERC deben hacerse de forma muy controlada / Vascular calcification is a complication of chronic kidney disease and one of the main predictors of increased morbidity and mortality in patients. These patients present a decrease in vitamin D levels (1,25(OH)2D3) leading to secondary hyperparathyroidism. For these reasons CKD patients are usually treated with calcitriol or other analogues. 25-hydroxyvitaminD is also used without any knowledge of its efficacy and toxicity. Current recommendations are to supplement with 25D to achieve a certain threshold that could affect both, classical and nonclassical actions of vitamin D in the body. However, its direct effect on calcium homeostasis (without conversion in calcitriol) is not fully understood. In the present work, we determined the effect of uremia in the regulation of vitamin D metabolism genes, and the role of the local synthesis of calcitriol on uremia-induced vascular calcification using 1αhidroxilaseKO mice. Also, we studied the efficacy and safety of 25D treatment on mineral metabolism in a model of 75% nephron mass reduction in mice lacking 1αhidroxilase and the effect in WT mice of the dose found to be effective reducing PTH levels in KO mice. Initial results in rats show that uremia deregulates proteins involved in vitamin D metabolism in vascular smooth muscle cells (VSMC), increasing the expression of 1αhydroxylase. This regulation is tissue specific and is different from the one in the kidney. Wild type mice with a CKD model treated with high daily doses of calcitriol (400ng/Kg) for two weeks show a significant weight loss, while 1αKO do not lose weight. Serum calcium levels, phosphorus, BUN, and 1,25D increase and are similar in both calcitriol-treated groups. Furthermore, PTH levels decrease in both groups below normal values. Vascular calcium content significantly increased in the WT mice compared to 1αKO mice. Similar results are observed with alizarin red staining and immunohistochemical detection of Runx2, which increase only in WT mice. In vitro, WT VSMC treated with uremic serum also show a significant increase in calcification and runx2 expression that is not observed in 1αKO cells. When VSMC from rat overexpressed 1αhydroxyalse also calcify more compared with the control cells. These results show that 1αhidroxilase acts as a mediatior of vascular calcificaton in uremia, increasing local synthesis of 1,25(OH)2D3. This fact is important in patients with renal disease treated with 25OHD3. To study the effect of 25D, a dose response study was carried out in 1αKO nephrectomized using 25, 50 and 100 ng/g of 25(OH)D3 to compare with a single dose of 1,25(OH)2D3 (50pg/g). 25(OH)D3 administration can normalize serum Ca, P, and PTH with a potency similar to that of 1,25D in the 1αKO mouse model of CKD, confirming a direct binding and activation of the VDR by 25D. Also, 25D can activate the VDR to mimic 1,25D in the up-regulation of genes and proteins mediating transcellular calcium transport in the kidney (TRPV5, Calbindin-D28k, PMCA1b) and in the duodenum (TRPV6, Calbindin-D9k, and PMCA1b) in the nephrectomized 1αKO. The doses of 25D required to mimic 1,25D in correcting the abnormalities in renal and duodenal transcellular calcium transport cause elevation in serum 25D levels far beyond the recommended levels in CKD patients. Furthermore this dose causes vascular calcification in WT mice. Also, we observed that 25D is able to activate 24hydroxylase and VDR in VSMC, showing the capacity of 25D to direct activate VDR in the artery. In conclusion, all these results suggest that local production of calcitriol by 1αhydroxylase in the artery may mediate vascular calcification observed in uremia. Furthermore, 25D treatments in patients with CKD should be done in a very controlled manner.

Throughout its lifespan, eukaryotic cells steadily consume free cytoplasmic orthophosphate to produce phospholipids and mRNA. However, during DNA synthesis, in a matter of minutes, cells require large amount of phosphate molecules to be incorporated in dNTPs. It is not known whether this high consumption produces a sharp variation in cellular orthophosphate levels, or alternatively, a homeostatic system exists to prevent any variation. Polyphosphate (polyP) is a linear chain made of hundreds of Pi residues present in all living organisms, with a still unclear molecular function. In the present study we show that degradation of polyP is cell cycle regulated and, also, an important process to sustain the synthesis of dNTPs in S. cerevisiae. Mutants that cannot synthesise polyP (vtc4) or cannot hydrolyse it (ppn1 ppx1) present a lower rate of dNTP synthesis and it takes longer time to duplicate DNA. Recovery after UV stress also requires high levels of dNTPs, and here we show that mutants bearing low levels of polyP are more sensitive to UV, while cells overexpressing VTC4 are more resistant. Finally, we demonstrate that human dermal fibroblasts with reduced levels of polyP are also more sensitive to UV damage, suggesting that the protective role of polyP against UV damage might be conserved. In conclusion, this work identifies a new and important player during the synthesis of the building blocks of DNA.

La malaltia de la bursitis infecciosa, o alaltia de Gumboro, és una patologia aviària d'origen viral que afecta principalment les cries d'aus. En les granges de cria d'aviram, el virus que la origina, l'IBDV, provoca una elevada mortalitat en els pollastres. La determinació de l'estructura tridimensional a alta resolució de la proteïna de la càpside d'aquest virus, la VP2, ha permès caracteritzar alguns dels elements que medien l'assemblatge i l'estabilitat de la càpside viral. També s'han identificat els residus implicats en la formació de cossos d'inclusió, que confereixen resistència a les partícules virals en l'entorn extracel·lular. D'altra banda, la determinació de l'estructura tridimensional de la polimerasa del virus, la VP1, ha aportat noves dades sobre la iniciació de la polimerització i sobre la regulació de la seva activitat per part de la VP3, la proteïna encarregada de la coordinació del cicle viral. / The infectious bursal disease, also known as Gumboro disease, is an avian pathology that affects broilers and chicks. In chicken farms, this virus, called IBDV, is responsible for high mortalities. The tridimensional structure determination at atomic resolution of this virus capsid protein, VP2, allowed us to characterize some of the elements that mediate the capsid assembly and stabilization. Furthermore, the residues implicated in the formation of inclusion bodies, that provide extra resistance to the virus in the extracellular stage, have been identified. Moreover, the tridimensional structure determination of the viral polymerase, VP1 protein, brought some light on the mechanisms involved in polymerization initiation and regulation of the activity mediated by VP3, the viral cycle coordination protein.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431159-Texto+Completo-0.pdf: 8354772 bytes, checksum: 8abf5160038abef327a3d35aa522175e (MD5) Previous issue date: 2011 / Tuberculosis is a chronic infectious disease mainly caused by Mycobacterium tuberculosis that requires urgent new efforts towards its treatment and cure face the emergence of drug-resistant strains, its world spreading, the increasing number of infected patients among immune compromised populations, and the large number of latent infected individuals that are reservoir to the disease. Nucleotides metabolism pathways provide promising molecular targets for the development of novel drugs against active tuberculosis and might also target its latent forms. The orotate phosphoribosyltransferase (OPRT) enzyme of the de novo pyrimidine synthesis pathway catalyzes the reversible phosphoribosyl transfer from 5'-phospho-α-D-ribose 1'-diphosphate (PRPP) to orotic acid (OA), forming orotidine 5’-monophosphate (OMP), precursor of remaining pyrimidine nucleotides. This work describes cloning, amplification and characterization of M. tuberculosis H37Rv pyrE gene as encoding a functional OPRT, its apparent and true kinetic constants for forward and reverse reactions, product inhibition profile, and kinetic mechanism assignment as Mono-Iso Ordered Bi Bi, not previously described for an enzyme member of type I phosphoribosyltransferase family. Thermodynamic constants and discrimination profile allowed natural enzyme’s substrates binding patterns identification. Characterization of the reaction catalyzed by mycobacterial OPRT is essential to structure-based drug development, aiming to advance towards tuberculosis control. Resulting data from enzyme’s characterization were the starting point for OPRT specific inhibitors planning, selection and testing.A starting compound was identified as promising lead molecule, with values in nanomolar range, and was further submitted to several chemical replacement experiments, leading to a derived molecule with lower inhibitory constants and improved thermodynamic discrimination profile. Both compounds identified were characterized as competitive and uncompetitive inhibitors towards OPRT substrates OA and PRPP, respectively. Advantage of M. tuberculosis unique kinetic mechanism among homologues OPRTs was taken in order to plan a specific molecule that might trap the enzyme in a noncatalytic ternary complex E ∙ PRPP ∙ I, both inhibiting pyrimidine synthesis and sequestering PRPP from cellular pool, thereby affecting other metabolic pathways. M. tuberculosis OPRT characterization and results on primary inhibitors identification are crucial step towards a potential novel drug development for tuberculosis treatment and prophylaxis. Results from this work are believed to enhance the understanding of mycobacterial nucleotide metabolism and provide pertinent data to advance towards specific molecular targets inhibitors development, aiming tuberculosis control. / A tuberculose é uma doença infecciosa crônica, causada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis, e requer novas iniciativas urgentes para o seu tratamento e cura em decorrência do surgimento de cepas resistentes a drogas, sua abrangência global, e o significativo aumento de pessoas infectadas entre pacientes imunodeprimidos; além do grande número de pessoas infectadas com a forma latente da tuberculose, que atuam como reservatório da doença. As enzimas que constituem as vias de metabolismo de nucleotídeos são alvos promissores para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da tuberculose, tanto na sua forma ativa quanto latente. A enzima orotato fosforibosiltransferase (OPRT), pertencente à via de síntese de novo de nucleotídeos de pirimidina, catalisa a transferência reversível do grupamento fosforibosil da molécula de 5’-fosfo-α-Dribose 1’-difosfato (PRPP) para o ácido orótico (OA), formando orotidina 5’- monofosfato (OMP), molécula precursora dos demais nucleotídeo de pirimidina. Este trabalho descreve a clonagem, amplificação e caracterização do produto do gene pyrE de M. tuberculosis H37Rv como uma enzima OPRT funcional; a determinação de suas constantes cinéticas aparentes e verdadeiras para as reações direta e inversa; ensaio de inibição pelos produtos; e a determinação do mecanismo cinético da reação como sendo Mono-Iso Ordenado Bi Bi, mecanismo que até então não havia sido descrito para uma enzima pertencente à família das fosforibosiltransferases do tipo I. As constantes termodinâmicas e o perfil de discriminação termodinâmica permitiram a identificação dos modos de interação dos substratos naturais da enzima com seu sítio de ligação.A caracterização da reação catalisada pela enzima OPRT micobacteriana é uma etapa essencial para o desenvolvimento de novas drogas de ação específica que permitam o melhor controle da tuberculose. Os dados resultantes da caracterização da enzima foram utilizados como ponto de partida para o planejamento, seleção e teste de inibidores seletivos contra a OPRT de M. tuberculosis. Um composto inicial, com valores de na faixa de concentração de nanomolar, foi identificado como potencial composto líder, sendo submetido a diferentes protocolos de derivatizaçao química, permitindo a obtenção de uma molécula derivada com valores de constantes inibitórias e perfil de discriminação termodinâmica aprimorados. Estes dois compostos foram caracterizados como inibidores competitivos e incompetitivos em relação aos substratos naturais da OPRT, OA e PRPP, respectivamente; onde o conhecimento do singular mecanismo cinético de reação da enzima de M. tuberculosis foi utilizado para o planejamento de moléculas capazes de formar um complexo ternário não catalítico (E ∙ PRPP ∙ I), inibindo a síntese de nucleotídeos de pirimidina e sequestrando moléculas de PRPP do meio celular, afetando ainda, outros processos metabólicos essenciais. Os resultados deste trabalho colaboram ainda para uma melhor compreensão do metabolismo de nucleotídeos de micobactérias e fornecem informações relevantes para o avanço do desenvolvimento de inibidores de ação seletiva sobre alvos moleculares específicos para o tratamento e profilaxia da tuberculose.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000411825-Texto+Completo-0.pdf: 1068093 bytes, checksum: 29a9720f1c8599bf5e5b990d17e4dcb6 (MD5) Previous issue date: 2009 / The two main species in the genus Angiostrongylus that cause human disease are A. cantonensis and A. costaricensis. These parasites have different tissue tropism, A. cantonesis is neurotropic and causes eosinophilic meningoencephalitis, A. costaricensis is located in the mesentery causing abdominal angiostrongyliasis. Immunological tests currently used for angiostrongyliasis diagnosis are limited by low especificity. Otherwise, specialized functional proteins, such as enzymes, may lead to more specific reactivity. The aim of the present work is to identify hemoglobinotytic activity in A. cantonensis. Digestive organs from the female worms were homogenized in lyses buffer. The protein extract (AcPE) was incubated whit bovine hemoglobin (BHh) at different pH range. Zymography assay was carried out by copolimerized SDS-PAGE with either 0. 4% BHb or 0. 1% gelatin. Hemoglobin degradation was well demonstrated at an extensive pH range, from 3. 0 to 7. 0. No degradation bands were detected by zymography either with gelatin or hemoglobin as substrate. These limited data from zymography and those from pH titration may suggest that AcPE contains not a single component but a low abundance enzyme complex. The identification, characterization and clonning of molecules with hemoglobinolytic activity stays as a prioritary aim. / Angiostrongylus costaricensis e A. cantonensis são as principais espécies patogênicas para o homem no gênero Angiostrongylus. Esses parasitos tem tropismo tecidual diferentes, A. cantonensis é um parasito neurotrópico que causa a angiostrongilíase meningoencefálica e A. costaricensis localiza-se no mesentério sendo o agente etiológico da angiostrongilíase abdominal. Os testes imunológicos utilizados ultimamente para o diagnóstico das Angiostrongilíases são limitados pela baixa especificidade. Entretanto, proteínas funcionais especializadas, tais como enzimas, podem ser fontes de reatividade imunológica específica. O objetivo do presente trabalho é identificar atividade hemoglobinolítica nesses parasitos. Tubos digestivos de fêmeas foram homogeneizadas em tampão de lise. As proteínas do extrato (ExAca) foram incubadas com hemoglobina bovina (HbB) em diferentes pHs. Zimografia foi realizado em géis copolimerizados com 0,4% gelatina ou 0,1% BHb. Degradação da hemoglobina foi bem demonstrada em uma ampla faixa de pH, de 3,0 para 7,0. Não foram detectadas bandas de degradação na zimografia com gelatina ou hemoglobina como substrato. Os dados limitados da zimografia e os resultados de atividade hemoglobinolítica, com ou sem a titulação de pH, pode sugerir um complexo de proteases em pequena quantidade. Exploração de diversas estratégias de concentração do extrato protéico, sem perda da atividade da enzima, constitue a perspectiva desse trabalho, visando à identificação, caracterização e produção em larga escala de moléculas com atividade hemoglobinolítica.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000424566-Texto+Completo-0.pdf: 2168714 bytes, checksum: 2f865a2656e725b28201a2b328378a5c (MD5) Previous issue date: 2010 / Molecular docking is one of the main stages of Rational Drug Design (RDD). This is a method that provides a better orientation and conformation in which a molecule will bind to another to form a stable complex. Most docking algorithms consider flexible ligands, due to their usually small size. On the other hand, because the receptor is generally a molecule consisting of a larger number of atoms, it is treated as rigid. However, protein molecules are naturally flexible, and to consider such flexibility throughout the docking process is still not an easy task. The motivation for developing this work came from the need to perform molecular docking simulations in a more realistic manner, considering the dynamics and plasticity of a receptor molecule. Among the various ways to consider the receptor flexibility, our approach was to use a molecular dynamics simulation (MD) to generate the different conformations of the receptor. In this study we have investigated the effect of the explicit flexibility of the InhA enzyme of Mycobacterium tuberculosis by performing molecular docking simulations in each of the different conformations of the enzyme (wild-type, and I16T and I21V mutants), produced by MD, with the inhibitors ethionamide (ETH), triclosan (TCL) and isoniazid-pentacyanoferrate II (PIF).With the flexible model of the receptor, the experiments produced a series of snapshots of InhA inhibitors used in this study, showing different modes of ligand binding, which could not be evaluated using a single conformation of the crystal structure (PDB ID: 1ENY). Our analysis showed that for the InhA-ETH complex, only 5 residues interacted with the ligand in the crystal structure, whereas 80 residues along the trajectory made contacts with the ETH in the flexible model. Similarly, for the InhA-TCL complex only 2 residues of the crystal structure interacted with the ligand, while in the flexible receptor model, we found 46 residues interacting with the TCL. Finally, for the complex InhA-PIF, we found that 2 residues of the receptor interacted with the ligand in the crystal structure, and on the other hand, 35 residues interacted with PIF in the flexible model. This suggests that the flexible receptor model can accommodate a more diverse set of conformations of the ligand. When considering the plasticity of the receptor to perform a docking simulation, it means that the amino acid residues, loops and turns of the receptor can move slightly in different directions, allowing the ligand to explore spaces in the binding site that would have not been possible before. We believe that this work is helping to build knowlege of the importance of receptor flexibility in molecular docking process, and paves the way for further investigation. / A docagem molecular é uma das principais etapas do processo de Rational Drug Design (RDD). Este é um método que prevê a melhor orientação e conformação na qual uma molécula se ligará à outra, de modo a formar um complexo estável. Os algoritmos de docagem atuais consideram o ligante flexível, devido ao seu tamanho geralmente pequeno. Já o receptor, por ser uma molécula composta por um número maior de átomos, é tratado como rígido. Porém, proteínas são moléculas naturalmente flexíveis, e considerar esta flexibilidade durante um processo de docagem ainda não é uma tarefa fácil. A motivação para desenvolver este trabalho surgiu da necessidade de realizar simulações de docagem molecular mais realísticas, que considerem a dinâmica e a plasticidade de uma molécula receptora. Dentre as diversas formas de considerar a flexibilidade do receptor, usamos uma simulação de dinâmica molecular (DM) para gerar as diferentes conformações do receptor. Investigamos o efeito da flexibilidade explícita da enzima InhA de Mycobacterium tuberculosis através da realização de simulações de docagem molecular em cada uma das diferentes conformações da mesma (tipo selvagem e mutantes I16T e I21V) obtidas por DM, com os inibidores etionamida (ETH), triclosan (TCL) e isoniazidapentacianoferrato II (PIF). Com o modelo flexível do receptor, os experimentos produziram um conjunto de snapshots dos inibidores da InhA utilizados neste estudo, mostrando diferentes modos de ligação do ligante, que não poderiam ser avaliados com base em uma única conformação da estrutura cristalina (PDB ID: 1ENY). Nossa análise revelou que para o complexo InhA-ETH, apenas 5 resíduos interagiram com o ligante, na estrutura cristalina, enquanto que 80 resíduos ao longo da trajetória fizeram contatos com a ETH no modelo flexível. Para o complexo InhATCL apenas 2 resíduos da estrutura cristalina interagem com o ligante, e no modelo de receptor flexível, encontramos 46 resíduos interagindo com o TCL. Finalmente, para o complexo InhAPIF, verificamos que 2 resíduos do receptor interagiram com o ligante na estrutura cristalina, enquanto que para o modelo flexível encontramos 35 resíduos interagindo com PIF. Isto sugere que o modelo de receptor flexível pode acomodar um conjunto mais diversificado de conformações do ligante. Considerar a plasticidade do receptor ao realizarmos uma simulação de docagem significa que os resíduos de aminoácidos, alças e voltas do receptor, podem mover-se ligeiramente em diferentes direções permitindo que o ligante possa então explorar espaços no sítio de ligação que antes não seria possível. Acreditamos que este trabalho está ajudando a construir o conhecimento sobre a importância da flexibilidade do receptor no processo de docagem molecular, e possibilita uma investigação mais aprofundada no futuro.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:33Z (GMT). No. of bitstreams: 3 000399964-Texto+Completo+Parte+A-0.pdf: 18391919 bytes, checksum: af1c2f20c95ef9a171c3d3fc299fe1e4 (MD5) 000399964-Texto+Completo+Parte+B-1.pdf: 11500816 bytes, checksum: 2d0b16c2a821b4adbb77c7b4d4f28602 (MD5) 000399964-Texto+Completo+Parte+C-2.pdf: 17810555 bytes, checksum: f216fc25091f70f4980a1f7a25ffde6b (MD5) Previous issue date: 2007 / Tuberculosis (TB) remains the leading cause of mortality due to a single bacterial pathogen, Mycobacterium tuberculosis. The reemergence of tuberculosis as a potential public health threat, the high susceptibility of human immunodeficiency virus-infected persons to the disease, the proliferation of multi-drug-resistant strains (MDR-TB) and, more recently, of extensively drug resistant isolates (XDR-TB) have created a need for the development of new antimycobacterial agents. There is an ongoing need for innovation in proposing new structural scaffolds for chemotherapeutic agent development to control TB. Mycolic acids, the hallmark of mycobacteria, are high-molecular-weight α-alkyl, β-hidroxy fatty acids, which appear mostly as bound esters in the mycobacterial envelope. Isoniazid (INH) is the most prescribed chemotherapeutic agent for active TB and prophylaxis and requires activation by the catalase-peroxidase activity of KatG. The product of the M. tuberculosis inhA structural gene (InhA) has been shown to be the primary target for INH. InhA was identified as an NADH-dependent enoyl-ACP reductase specific for long chain enoyl thioesters. InhA is a member of the mycobacterial Type II fatty acid biosynthesis system, which elongates acyl fatty acid precursors of mycolic acids. The main focus of our contribution is on data describing the mode of action of an inorganic complex, pentacyano (isoniazid) ferrateII that requires no KatG-activation and is an in vitro slow-onset inhibitor of WT and INH-resistant M. tuberculosis enoyl reductases. This inorganic complex represents a new class of lead compounds to the development of anti-tubercular agents aiming the inhibition of a validated target. We also describe the recent developments in the search for inorganic complexes with anti-tubercular activity. / A tuberculose (TB) continua sendo a principal causa de mortalidade devido a um único patógeno bacteriano, Mycobacterium tuberculosis. A reemergência da tuberculose como uma ameaça potencial à saúde pública, a alta suscetibilidade de pessoas infectadas com o vírus da imunodeficiência humana à doença, a proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas (MDR-TB) e, mais recentemente, de cepas extensivamente resistentes às drogas (XDR-TB) criaram a necessidade do desenvolvimento de novos agentes antimicobacterianos. Existe uma necessidade contínua de inovação em propor novas estruturas para o desenvolvimento de agentes quimioterápicos para o controle da TB. Os ácidos micólicos, característicos de micobactérias, são ácidos graxos α-alquil, β-hidróxi de alto peso molecular que aparecem, principalmente, como ésteres ligados ao envelope micobacteriano. A isoniazida (INH) é o agente quimioterápico mais prescrito para a TB ativa e para a profilaxia e necessita de ativação pela atividade de catalase-peroxidase da KatG. O produto do gene estrutural M. tuberculosis inhA (InhA) demonstrou ser o alvo primário da INH. A InhA foi identificada como uma enoil-ACP redutase dependente de NADH, possuindo especificidade por enoil tioésteres de cadeia longa. InhA é um membro do sistema de biossíntese de ácidos graxos micobacterianos do tipo II que elonga ácidos graxos acilados, precursores dos ácidos micólicos. O foco principal de nossa contribuição são dados descrevendo o modo de ação de um complexo inorgânico, pentaciano (isoniazida) ferrato II que não necessita de ativação pela KatG. Ademais é um inibidor do tipo ligação lenta da enoil redutase WT e resistente à INH de M. tuberculosis. Este complexo inorgânico representa uma nova classe de compostos líderes para o desenvolvimento de agentes antituberculose objetivando a inibição de um alvo validado.Nós também descrevemos os avanços recentes na busca por complexos inorgânicos com atividade antituberculose.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000407067-Texto+Completo-0.pdf: 3459051 bytes, checksum: d1b647d03a940c703ad0b5b801bad1d2 (MD5) Previous issue date: 2008 / Tuberculosis (TB), caused by Mycobacterium tuberculosis, remains the leading cause of mortality due to a bacterial pathogen. The proliferation rate of multidrugand extensively drug-resistant strains of M. tuberculosis is increasing worldwide. There is a continuous requirement for studies on mycobacterial metabolism to identify promising targets for the development of new anti-TB agents. In bacteria, pyrimidine nucleotide interconversion pathways are important in a number of essential processes, including DNA, RNA, and phospholipid biosynthesis. The gene (cmk, Rv1712) encoding cytidine monophosphate kinase (CMK) enzyme has been proposed by sequence homology to be present in the genome of M. tuberculosis. Here we describe PCR amplification and cloning of cmk gene, expression and purification of its product to homogeneity, and N-terminal sequencing and mass spectrometry analyses of the recombinant protein. Results of steady-state kinetics showed that M. tuberculosis cmk gene encodes a monomeric CMK that phosphorylates preferentially CMP and dCMP, and that UMP is a poor substrate. These results reinforce the presence of a nucleoside monosphosphate kinase specific for UMP in M. tuberculosis. Double-reciprocal plots of steady-state kinetic results were consistent with ternary complex formation and sequential mechanism for M. tuberculosis CMK reaction. A plausible role for CMK in M. tuberculosis is discussed. / A tuberculose (TB), doença infecto contagiosa, causada pelo Mycobacterium tuberculosis, é a maior causa de morte por agente infeccioso do mundo. O aumento da incidência de cepas multi-resistentes (MDR-TB) e extensivamente resistentes (XDR-TB) tem contribuído para o aumento do número de mortes. Por este motivo, há a necessidade de estudos para identificarmos, no metabolismo da micobactéria, possíveis alvos para o desenvolvimento de drogas capazes de combater estas novas cepas. Em bactérias, as rotas de interconversão de nucleotídeos pirimidínicos são importantes em inúmeros processos essenciais, incluindo a biosíntese de DNA, RNA e fosfolipídios. O gene (cmk, Rv1712) que codifica a enzima citidina monofosfato quinase (CMK) foi descrito, por homologia de seqüência, no genoma de M. tuberculosis. Neste trabalho o gene cmk foi amplificado por PCR e clonado em vetor de expressão. A proteína CMK foi expressa em grande escala e purificada. O produto homogêneo desta purificação sofreu seqüenciamento N-terminal e espectrometria de massa. Os resultados da cinética em estado estacionário mostraram que o gene cmk de M. tuberculosis codifica a proteína monomérica CMK, que fosforila preferencialmente CMP e dCMP, e que UMP é um substrato pobre. Estes resultados reforçam a presença de uma nucleotídeo monofosfato quinase específica para UMP em M. tuberculosis. Os parâmetros cinéticos fornecidos pelo ensaio e análise dos gráficos de duplo-recíproco mostraram que a enzima forma um complexo ternário e que seu mecanismo é seqüencial. Um possível papel para a enzima CMK é discutido.