L'objet de cette thèse était de mettre en place une séquence robuste d'imagerie rapide du tenseur de diffusion par RMN sur un imageur petit animal 7-T. Nous avons mis en place une séquence Twice Refocused Spin Echo afin de s'affranchir des problèmes de courants de Foucault. Nous avons préféré une acquisition spirale de l'espace-k à EPI pour son insensibilité aux artefacts de mouvement et de flux très importants en diffusion. Nous avons développé un logiciel sous Matlab pour la reconstruction des images du tenseur de diffusion et la visualisation des cartes d'anisotropie et cartes couleurs. Enfin nous avons utilisé un logiciel développé à l'INRIA de Nice-Sofia Antipolis (MedINRIA DTI Track) pour visualiser l'affichage des vecteurs propres et effectuer le « fiber tracking » à partir des datas collectées sur notre imageur 7-T sur cerveau de rat. Une fois la technique et les méthodes de reconstructions validées sur différents fantômes et sur cerveau de rat sain, nous l'avons appliqué à un modèle de rat traumatisé étudié au sein du laboratoire et traumatisé selon la méthode impact-accélération. L'objet de l'étude était de caractériser l'oedème cérébral post traumatique de manière précoce grâce à l'imagerie du tenseur de diffusion. Cette technique nous a permis de caractériser le type d'oedème cérébral post-traumatique par des modifications de la diffusivité moyenne. Des modifications d'anisotropie dans le corps calleux du cerveau de rat traumatisé ont montré la présence de lésions axonales diffuses. Enfin, l'imagerie fiber tracking a permis de détecter des lésions axonales au centre du corps calleux du cerveau de rat traumatisé.

Nous avons réalisé une expérience à l'échelle de la molécule unique pour étudier l'influence d'une force mécanique sur la transcription par l'ARN polymérase du phage T7. Cette enzyme, prototype de moteur moléculaire, est très processive et partage des homologies avec les membres de la famille Pol I incluant la transcriptase inverse du VIH 1. Une extrémité de l'ADN à transcrire est tenue par une polymérase fixée sur une surface, l'autre extrémité est attachée à une bille microscopique capturée à l'aide d'un piège optique interférométrique qui permet de mesurer la force développée durant la transcription. Des mesures de vitesse de transcription ont été réalisées dans la gamme 5-20 pN, à différentes concentrations en nucléotides (NTP). On observe que la diminution de la concentration en NTP, qui rend l'étape de liaison du nucléotide dans le site actif limitante, fait apparaître une dépendance marquée de la vitesse à la force, alors que les hautes concentrations en NTP rendent la polymérase insensible à la force. On en déduit que le mouvement d'avancée de l'enzyme le long de l'ADN est couplé à la fixation du nucléotide dans le site actif. Ainsi l'énergie d'hydrolyse n'est pas directement convertie en énergie mécanique. Les homologies entre polymérases suggèrent que ce mécanisme est également partagé, ce qui permet de proposer que pour les polymérases en général, l'étape de fixation du nucléotide dans le site actif est couplé au mouvement sur l'ADN.<br /><br />Nous avons également mené un autre type d'expérience en mesurant la force lors de l'ouverture mécanique de la double hélice d'ADN, qui a permis de déterminer la friction exercée sur l'ADN en rotation.<br /><br />La configuration d'ouverture de l'ADN a été également utilisée pour étudier l'interaction d'une protéine, EcoR V avec l'ADN. L'analyse des résultats a mis en évidence une grande variabilité dans l'énergie de dissociation, liée à des différences d'affinités entre les sites de reconnaissance spécifiques de l'enzyme.

Nous présentons dans ce manuscrit la réalisation et la caractérisation d'une double pince optique,<br />nous permettant de pratiquer des micromanipulations à l'échelle de la molécule unique sur des surfaces<br />opaques, et de mesurer des forces jusqu'à une vingtaine de piconewtons.<br />Ce montage est d'abord utilisé pour déposer sur des électrodes de mesures des molécules uniques<br />d'ADN , afin d'en explorer les propriétés de transport de charges (propriétés d'intérêts technologiques<br />dans le cadre de l'électronique moléculaire). Nous n'avons observé aucun courant dû à la présence de la<br />molécule. Nous concluons pour la résistance des brins d'ADN de 70 nm de long à une borne inférieure de<br />10^11 Ohm en solution, et de 10^13 Ohm à sec.<br />Nous présentons de plus des mesures de forces sur un système d'intérêt biologique : le dégrafage d'un<br />fragment de l'ARN ribosomique 23S de la bactérie Escherichia coli. Cette étude préliminaire nous a<br />permis d'arriver à des conclusions en accord avec d'autres expériences du même type.

La compréhension des phénomènes d'adsorption des protéines aux interfaces solides liquides est un élément clé dans la conception et l'utilisation de membranes artificielles et de matériaux biocompatibles. Devant la complexité des phénomènes, les études fondamentales et leurs modélisations revêtent une importance stratégique. Les techniques de fluorescence et de polarisation de fluorescence résolues dans le temps permettent à de très faible concentration d'obtenir des informations tant sur l'environnement direct que sur le mouvement d'une molécule émettrice. Par ailleurs, les techniques de fluorescence confocales rendent possibles quant à elles la visualisation d'un volume parfaitement localisé de l'ordre du femtolitre. <br />La fluorescence intrinsèque des protéines ou le marquage direct par un chromophore ne rendent pas toujours compte simplement du mouvements des protéines. De ce fait, Nous avons synthétisé une sonde fluorescente composée de biotine éthylènediamine et d'alexa fluor 594. Ce marquage permet d'obtenir un temps de corrélation unique l de 32 ns, compatible à celui attendu pour une protéine de géométrie sphérique de masse molaire de 66 KDa. Durant ce travail de thèse, nous avons développé un dispositif optique innovant permettant d'effectuer des études d'adsorption sous flux par des mesures de fluorescence et de polarisation de fluorescence résolues dans le temps en mode confocal. Le dispositif mise au point permet d'obtenir une résolution spatial de 1,2 µm soit un volume de l'ordre du femtolitre qu'il est possible de déplacer dans une cuve d'épaisseur de 230 µm. En fluorescence dynamique, les valeurs de temps de corrélation et de durée de vie de fluorescence obtenue sont similaires avec ceux obtenus en mesure de fluorescence classique.<br />Enfin, nous avons suivi la cinétique d'adsorption et l'évolution des profile de concentration de l'avidine lors du processus d'adsorption sur une surface modèle (mica) et sur une membrane d'hémodialyse (AN-69).

Ce travail de thèse est une étude théorique des propriétés thermodynamiques de polypeptides en phase gazeuse avec comme objectif une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux impliqués dans le repliement des protéines. Une approche statistique basée sur des algorithmes Monte Carlo dans les ensembles généralisés, comme le Monte Carlo d'échange ou la méthode Wang-Landau, a été utilisée pour échantillonner le paysage énergétique complexe de ces systèmes. Les peptides étudiés comprenant de 2 à 20 acides aminés ont été modélisés par le champ de force AMBER 96. Les simulations ont été réalisées en étroite interaction avec les avancées expérimentales du groupe. Nous avons ainsi tenté de comprendre l'influence de la structure secondaire sur les mécanismes de photofragmentation, le rôle de l'entropie dans la stabilisation des feuillets beta à température ambiante et l'effet d'un champ électrique intense sur la conformation de peptides.

L'organisation de la chromatine eucaryote ainsi que les mécanismes qui régulent sa compaction restent discutés. Nous proposons de comprendre le rôle de variations locales de charges et de concentrations ioniques dans l'organisation supramoléculaire de la chromatine. Nous utilisons un système modèle, la particule cœur de nucléosome (NCP) constituée de 146pb d'ADN qui s'enroulent autour d'un octamère d'histones sur un 1.75 tours. Les extensions terminales des histones, les queues, sont mobiles et positivement chargées. A l'aide de NCPs reconstituées à partir d'ADN et d'histones intactes ou globulaires recombinants, nous montrons que les queues des histones H3 et H4 sont essentielles pour l'établissement d'interactions attractives entre NCPs, en solution diluée. Le rôle d'ions multivalents dans les interactions entre NCPs et la formation de précipités ont été étudiés. Le rôle des queues d'histones est également abordé pour la formation de phases denses obtenues sous stress osmotique.

La sécrétion régulée d'hormones est un processus décomposable en plusieurs étapes. Les granules de sécrétion (GS) contenant ces hormones sont formés au niveau du réseau trans-golgien puis migrent jusqu'à la périphérie de la cellule. Ces hormones sont libérées dans le milieu extérieur par exocytose en cas de stimulation de la cellule. Grâce à l'observation des GS situés dans la région juxta-membranaire par microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente, les mouvements de ces organites ont été étudiés à l'échelle du granule unique. Une méthode d'analyse permettant la mise en évidence de comportements transitoires au sein des trajectoires tridimensionnelles des GS a été mise au point. Grâce à son application à l'étude des effets de drogues du cytosquelette et à des observations en double marquage, nous avons pu associer chaque type de mouvements décrit par les GS à un environnement particulier (GS lié à la membrane plasmique, au cytosquelette d'actine ou de microtubules). Nous avons de plus étudié le rôle du complexe protéique Rab27A/MyRIP/Myosine Va lors de la capture des GS en périphérie de la cellule et leur accrochage aux filaments d'actine.

CE TRAVAIL AVAIT POUR OBJECTIF DE MONTRER LA POSSIBILITE D'UTILISER DES METHODES OPTIQUES DANS L'INVESTIGATION BIOPHYSIQUE NON INVASIVE DU SYNDROME CUTANE D'IRRADIATION AIGUË, POUR DES DOSES D'IRRADIATION RELATIVEMENT FAIBLES. <br /> LA PREMIERE PARTIE REVIENT SUR LES MOTIVATIONS QUI ONT ABOUTI AU CHOIX DE LA POLARISATION COMME AGENT DE CONTRASTE DANS LE CADRE DE CETTE ETUDE. NOUS AVONS ALORS OPTE POUR LA POLARIMETRIE DE MUELLER, TECHNIQUE ADAPTEE A L'ETUDE D'UN MILIEU DEPOLARISANT TEL QUE LA PEAU.<br /> LA DEUXIEME PARTIE POSE LES BASES THEORIQUES DANS L'INTERPRETATION DES RESULTATS OBTENUS A PARTIR DE LA MESURE DE LA MATRICE DE MUELLER D'UN MILIEU. LA LECTURE DE CETTE DERNIERE N'ETANT PAS IMMEDIATE, UN ALGORITHME DE DECOMPOSITION ET DE CLASSIFICATION DES MATRICES DE MUELLER DEPOLARISANTES ET NON DEPOLARISANTES A ETE DEVELOPPE. CELUI-CI EST VALIDE SUR UNE SERIE D'ECHANTILLONS DE NATURES TRES DIVERSES.<br /> LA TROISIEME PARTIE PRESENTE LE POLARIMETRE ET LES RESULTATS, ANGULAIRES ET SPECTRAUX, OBTENUS SUR DES ECHANTILLONS DE PEAU IRRADIES OU IL N'Y A AUCUN SIGNE CLINIQUE VISIBLE. EN UTILISANT L'ALGORITHME PRECEDENT NOUS AVONS MIS EN EVIDENCE DEUX AGENTS DE CONTRASTE POLARIMETRIQUE QUI SEULS OU COMBINES APPORTENT UNE INFORMATION SUR LE TAUX D'IRRADIATION. CES RESULTATS SONT CONFORTES PAR UNE ETUDE HISTOLOGIQUE MENEE EN PARALLELE PAR L'IRSN. NOUS AVONS AINSI MONTRE QUE LA POLARISATION PEUT ETRE UN AGENT DE CONTRASTE POUR DE FAIBLES DOSES D'IRRADIATION.<br /> LA DERNIERE PARTIE MONTRE L'INTERET D'UTILISER EN COMPLEMENT A LA POLARIMETRIE UNE METHODOLOGIE D'OPTIQUE COHERENTE (SPECKLE, TOMOGRAPHIE PAR COHERENCE OPTIQUE) POUR LOCALISER LES ALTERATIONS CUTANEES.

Le fil de traîne de l'araignée est un matériau remarquable, un biopolymère aux exceptionnelles propriétés mécaniques. La soie d'araignée a été au centre d'une intense recherche utilisant une large gamme de techniques expérimentales et de modélisations théoriques. Néanmoins, ses propriétés macroscopiques n'ont pas encore été correctement reliées à sa structure et sa dynamique microscopiques.<br />Dans ce travail de thèse, les techniques de diffusion neutronique ont été pour la première fois utilisées pour l'étude de la soie d'araignée. La forte contribution de l'hydrogène en diffusion des neutrons ainsi que la différence des longueurs de diffusion de l'hydrogène et du deutérium ont permis de porter un regard nouveau sur les propriétés structurales et dynamiques des soies d'araignée. Ainsi les résultats appuient un modèle hiérarchique à trois phases de nanofibrilles composées de domaines cristallins et d'ordre à courte portée, contenues dans une matrice amorphe. Des expériences complémentaires de diffusion du rayonnement synchrotron suggèrent que l'eau absorbée par la matrice amorphe forme une glace amorphe à basses températures. Des expériences de diffraction de neutrons (abréviation anglaise : WANS) ont montré un pic méridional hors réseau -non observé par les expériences en rayons X (abréviation anglaise : WAXS)- attribué à une structure smectique de feuillets beta dans les domaines d'ordre à courte portée. L'échange de H2O contre D2O pour les expériences de diffusion de neutrons aux petits angles (abréviation anglaise : SANS) a permis d'observer la variation de contraste à l'intérieur des nanofibrilles et entre les nanofibrilles et la matrice. La mobilité moléculaire a été sondée par des techniques de diffusion inélastique et quasiélastique des neutrons. Il semble qu'une hiérarchie de phénomènes de relaxations décrive la soie hydratée, tandis que la soie native a un comportement vitreux à température ambiante.

Le complexe de la NADPH oydase des neutrophiles catalyse la formation des ions<br />superoxydes nécessaires à la destruction des pathogènes. Il est constitué de deux protéines<br />membranaires (gp91phox, p22phox), de trois facteurs cytosoliques (p47phox, p67phox, p40phox) et<br />d'une petite protéine G, Rac. Afin de comprendre les interactions et les réarrangements<br />structuraux mis en jeu lors de l'activation du complexe, des études structurales des facteurs<br />cytosoliques entiers seuls et en complexe ont été menées. Deux approches ont été choisies : la<br />microscopie électronique et la diffusion des rayons X aux petits angles. Cette dernière<br />approche a permis de calculer une enveloppe pour p47phox et p67phox.