Les voies d'endocytose chez l'amibe Dictyostelium discoideum ont été explorées en étudiant l'acidification des compartiments endocytaires et en caractérisant l'action de la caféine et de la cycloheximide, deux inhibiteurs qui ne modifient pas le métabolisme énergétique de la cellule.<br />Le dextran marqué par l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC dextran) a été employé comme sonde de phase fluide. Dictyostelium montre une internalisation de fluide plus active dans un milieu nutritif que dans un milieu non nutritif. Dans les deux cas, une cinétique biphasique est observée avec une première phase linéaire en fonction du temps, suivie d'un plateau qui correspond à l'équilibre dynamique entre l'entrée et la sortie de fluide. Les cinétiques sont modélisables sur la base d'un compartiment endocytaire unique. L'activité pinocytaire diminue avec la température avec une énergie d'activation de 27 kcal/mol.<br />Le FITC dextran a été utilisé comme sonde de pH. Au plateau de pinocytose, le compartiment endosomal est à une valeur moyenne de pH 5,8 (+/- 0,2) qui est indépendante du pH extracellulaire. Les bases faibles et d'autres agents comme la monensine ou le carbonyl cyanide m-chloro phenylhydrazone, diminuent l'acidité du compartiment endosomal. La détermination du pH endosomal pendant les phases initiales (t<15 min) met en évidence un compartiment plus acide que le compartiment endosomal majeur. Le pH endosomal reste constant pendant l'engagement de la différenciation induite par une carence nutritionnelle. <br />La caféine inhibe de façon immédiate toutes les activités endocytaires chez l'amibe Dictyostelium : la pinocytose de phase fluide, la phagocytose et la sécrétion des enzymes lysosomales. La caféine est aussi un inhibiteur de la croissance axénique dans la même gamme de concentrations que celles qui inhibent l'endocytose. D'autres méthylxanthines, comme la théobromine, la théophylline ou la paraxanthine sont sans effet sur l'endocytose ou la croissance de Dictyostelium. L'hypothèse pour expliquer l'effet inhibiteur de la caféine est une perturbation de l'homéostasie du Ca2+ intracellulaire.<br />La cycloheximide est un inhibiteur de la synthèse protéique chez les eucaryotes. Après une phase de latence d'environ 10 minutes, la cycloheximide bloque toutes les activités endocytaires chez l'amibe Dictyostelium. D'autres inhibiteurs de la synthèse protéique des cellules eucaryotes qui possèdent des modes d'action et des structures différents, tels que l'anisomycine, l'émétine, la pactamycine et la puromycine inhibent aussi l'endocytose. L'hypothèse envisagée pour rendre compte de l'inhibition de l'endocytose par les inhibiteurs de la synthèse protéique fait intervenir des mécanismes de réponse au stress.

Pseudomonas fluorescens est un bacille à Gram négatif ubiquitaire qui possède un fort potentiel adaptatif. En milieu hospitalier, cette bactérie est fréquemment retrouvée dans les solutions injectables, qu'elle contamine, mais émerge également comme agent pathogène responsable d'infections nosocomiales. Cependant, actuellement peu d'études permettent de déterminer le réel potentiel de virulence de cette bactérie, qui présente pourtant de nombreux traits relatifs à un pathogène opportuniste. <br />Afin d'appréhender le pouvoir pathogène de cette espèce, nous avons caractérisé et étudié une souche clinique, P. fluorescens MFN1032, isolée d'un patient atteint d'une infection pulmonaire. Cette souche est capable de pousser à 37°C et produits des facteurs de virulence. <br />Dans un premier temps, notre intérêt s'est particulièrement porté sur l'activité hémolytique de la souche, l'objectif étant de déterminer le ou les facteurs impliqués dans cette activité. Nous avons caractérisé une phospholipase C, PlcC, qui appartient à une classe de phospholipase C distincte de celles actuellement répertoriées. PlcC est impliquée dans l'activité hémolytique de MFN1032. Les résultats montrent que PlcC est étroitement liée à la production de biosurfactants, qui participent à l'activité hémolytique, via le régulateur transcriptionnel GntR.<br />D'autre part, le potentiel d'adaptation et de virulence de la souche est favorisé par des mécanismes de variations de phénotypes. Ainsi, différents variants phénotypiques ayant émergé de la souche MFN1032 ont été étudiés et comparés à la souche « sauvage », et les résultats montrent que l'activité hémolytique est directement concernée par cette variation. <br />D'un point de vue moléculaire, le phénotype d'une partie des variants est restauré par une complémentation en trans des gènes gacA ou gacS. La surexpression d'un des gènes gac diminue l'émergence des autres variants non complémentables par les gènes gac et présentant un phénotype « hyperadhérent ».<br />Le regroupement des différents résultats suggère que PlcC et GntR pourraient participer au processus d'émergence des variants hyperadhérents.

Le monoxyde d'azote (NO) est formé à partir de L-arginine par la famille des NO synthases. La dysrégulation de la synthèse de cette molécule de signalisation cellulaire est impliquée dans le développement d'un grand nombre de pathologies. Les effets cellulaires du NO sont en partie dus à une inhibition des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale. Nous nous sommes intéressés aux effets du NO sur la régulation de l'oxydation phosphorylante et de le transition de perméabilité, deux processus mitochondriaux gouvernant la survie cellulaire. Nous avons ainsi démontré que l'inhibition de la cytochrome c oxydase (COX) par le NO était associée à une inhibition de la respiration et de la synthèse d'ATP. Cependant le NO augmente l'efficacité de l'oxydation phosphorylante (ATP/O) en diminuant le processus de « slipping ». Toutefois, notre travail a mis en exergue un effet du NO dépendant du substrat utilisé. En présence de NADH seul, le NO n'a pas l'effet bénéfique sur le rendement de l'oxydation phosphorylante, obtenu avec le FADH2 seul ou associé au NADH. L'étude de l'état d'oxydoréduction des cytochromes de la COX a révélé que dans les mitochondries énergisées avec du FADH2 seul ou en association avec le NADH, les cytochromes aa3 sont plus réduits qu'en présence de NADH seul. Nous pouvons suggérer que le « slipping » au niveau de la COX soit dépendant de l'état d'oxydoréduction de ses cytochromes. Le NO pourrait donc être un régulateur physiologique du processus d'oxydation phosphorylante. Nous avons également cherché à étayer l'hypothèse selon laquelle l'inhibition du complexe I aurait un effet anti-apoptotique en inhibant l'ouverture du PTP et la libération de cytochrome c. Le NO ayant un effet sur la chaîne respiratoire dans sa globalité, nous n'avons pu certifier que son effet activateur sur l'ouverture du pore soit dû à l'inhibition d'un complexe en particulier. Il semble que le phénomène de transition de perméabilité soit sensible à l'inhibition du complexe II. L'inhibition du complexe II par un inhibiteur comme le TTFA ou le malonate aurait un effet pro-apoptotique et ce malgré la présence d'inhibiteurs puissants du PTP comme la ciclosporine. Ces résultats suggèrent que le complexe II ferait partie des complexes protéiques régulateurs du PTP et que son inhibition soit dominante sur l'effet induit par l'inhibition du complexe I.

La phosphorylation constitue un mécanisme de régulation de la fonction biologique des protéines lié au contrôle des associations inter-moléculaires, de l'activité enzymatique ou de la liaison de ligands. L'isomérisation des liaisons Ser/Thr-Pro après phosphorylation par des kinases spécifiques, souvent impliquées dans le contrôle du cycle cellulaire, se présente comme un nouveau mode de régulation. Ces deux mécanismes de signalisation sont étroitement liés par l'intermédiaire d'enzymes catalysant l'isomérisation cis/trans des prolines au niveau de motifs Ser/Thr-Pro phosphorylés telles que les peptidyl-prolyl cis/trans isomérases de la famille de Pin1. Elles jouent un rôle cellulaire essentiel mais leur rôle moléculaire exact est encore mal connu. Les interactions moléculaires entre Pin1 et de nombreuses phospho-protéines mitotiques indiquent un rôle dans la régulation du cycle cellulaire et dans l'oncogénèse, et font de Pin1 une cible pharmacologique émergente dans le traitement des cancers. Récemment, des interactions avec la protéine microtubulaire Tau dans sa forme pathologique hyperphosphorylée, au niveau d'un site unique centré autour du motif Thr231-Pro232, pourraient impliquer Pin1 dans la régulation de la liaison de Tau aux microtubules et dans les phénomènes de neurodégénérescence observés dans la maladie d'Alzheimer.<br /><br />Nous avons ciblé les interactions entre Pin1 et la protéine Tau comme modèle de substrats pour une étude détaillée des mécanismes intervenant à l'échelle moléculaire, sur base de substrats peptidiques, qui permettraient d'expliquer le rôle fonctionnel de Pin1. L'interaction avec les substrats au travers des motifs Ser/Thr-Pro phosphorylés est double : un domaine de liaison WW permet la liaison du substrat et un domaine catalytique PPIase (peptidyl-prolyl isomérase) catalyse l'isomérisation cis/trans des prolines. Un criblage par RMN des différents motifs phospho-Ser/Thr-Pro au sein de la protéine Tau a permis de déterminer un nouveau site d'interaction centré autour du motif Thr212-Pro213, phosphorylé uniquement dans la forme pathologique de Tau. <br /><br />Nous avons étendu l'investigation des interactions avec Pin1 à l'échelle de la protéine Tau entière. Comme pour la plupart des régions protéiques impliquées dans les interactions avec Pin1, la protéine Tau se caractérise par une absence de structure globale qui limite considérablement les études par RMN. Un fragment peptidique de 40 acides aminés comprenant les sites Thr231 et Thr212 phosphorylés a permis de montrer un rôle régulateur du domaine WW dans l'activité enzymatique. Une première étude avec une protéine mutante mimant l'état phosphorylé de Tau a montré une interaction avec le domaine catalytique de Pin1 et a nécessité la mise au point préalable d'une technique d'attribution de la protéine Tau par RMN que nous avons appelé « mapping peptidique ».<br /><br />La phosphorylation du domaine WW de Pin1 est associée à l'inhibition de la liaison des substrats et joue un rôle dans la régulation de l'activité de Pin1 in vivo. La forme non phosphorylée active de Pin1 est retrouvée majoritairement dans les cellules cancéreuses et la forme phosphorylée inactive dans les cellules saines. Nous avons envisagé de cibler les interactions entre Pin1 et les phospho-peptides avec la synthèse de molécules organiques mimant le dipeptide phosphoThr-Pro et la mise en œuvre d'un test de criblage par RMN pour l'obtention d'inhibiteurs ciblant le domaine WW de Pin1 qui pourraient mimer la forme inactive de la protéine.

Au cours de la maturation des gamètes mâles a lieu un événement unique : les structures classiques qui ordonnent l'ADN sont complètement bouleversées et remplacées par une nouvelle, de composition et d'agencement différents, qui permet au noyau du spermatozoïde final une compaction qui n'est retrouvée nulle part ailleurs. Les signaux épigénétiques ainsi que les événements qui se déroulent alors au niveau moléculaire ne sont pas encore bien élucidés. C'est dans l'optique d'une meilleure compréhension de ce phénomène que la protéine Atad2 a été identifiée et caractérisée. Ce facteur, qui possède un bromodomaine ainsi qu'un domaine AAA, est retrouvé sous deux formes chez la souris. La plus courte, strictement testiculaire, est capable de se lier à la chromatine acétylée. De plus, comme les autres membres de la famille des AAAATPases, Atad2 est capable de se multimériser. Cette multimérisation régule son affinité à la chromatine. Des études plus poussées ont montré un rôle dans l'activité transcriptionnelle ainsi que dans la stabilité des structures basales d'ordonnancement de l'information génétique, les nucléosomes. De plus, chez l'humain, Atad2 a été retrouvé exprimé de façon aberrante dans certaines tumeurs. L'élucidation du rôle de cette protéine dans les cellules germinales et somatiques apportera ainsi des informations sur le changement complet de la nature chromatinienne au cours de la spermatogenèse, et peut-être permettra peut-être une meilleure appréhension de l'activité génomique ayant lieux dans les cellules tumorales.

Les modifications post-transcriptionnelles qui régulent la structure et la fonction de la chromatine sont reconnues par de multiples modules protéiques, dont les bromodomaines. Alors que la reconnaissance de modifications individuelles des histones par ces modules est bien caractérisée, la reconnaissance d'histones portant plusieurs modifications est mal connue. Nous avons étudié comment Brdt s'associe à la chromatine acétylée par l'intermédiaire de ses deux bromodomaines (BD1 et BD2) pour induire sa compaction au cours des dernières étapes de la spermatogenèse. Nous avons également étudié l'effet de la mutation K61Q du premier bromodomaine de Brdt, impliquée dans certains cas d'infertilité masculine. BD1, bien que présentant une structure de bromodomaine classique, se montre sélectif pour des formes di-acétylées de la queue N terminale de l'histone H4 avec une préférence pour le peptide H4-K5/K8ac et ne montre pas d'affinité pour les peptides mono-acétylés H4-K5ac, H4-K8ac et H4-K12ac. Au contraire, BD2 présente un spécificité pour l'histone H3 mono-acétylée sur K18. La structure cristallographique du complexe Brdt-BD1/H4‑K5/K8ac révèle que les deux lysines acétylées se placent ensemble dans la cavité hydrophobe du bromodomaine. Ces observations mettent en évidence un nouveau mode de lecture du code histone par lequel un bromodomaine reconnaît spécifiquement le motif formé par l'acétylation de deux lysines adjacentes.

Les organismes cellulaires appartiennent à l'un des trois domaines du vivant : Archaea, Bacteria, Eucarya. Les Archaea sont des organismes unicellulaires avec un phénotype bactérien mais qui possèdent de nombreux caractères moléculaires eucaryotes. En particulier, la machinerie de réplication archéenne est une version homologue et simplifiée de celle des eucaryotes. Au cours de cette thèse, j'ai étudié la réplication de l'ADN chez les Archaea en combinant des approches in vitro et in silico.<br />Premièrement, j'ai essayé de purifier la protéine initiatrice de la réplication Cdc6/Orc1, sous une forme native, dans l'espoir de mettre au point le premier système de réplication de l'ADN in vitro chez les Archaea. Malheureusement, cette approche a été infructueuse en raison de l'instabilité et des propriétés d'agrégation de la protéine.<br />Deuxièmement, j'ai réalisé une analyse comparative du contexte génomique des gènes de réplication dans les génomes d'Archaea. Cette analyse nous a permis d'identifier une association très conservée entre des gènes de la réplication et des gènes liés au ribosome. Cette organisation suggère l'existence d'un mécanisme de couplage entre la réplication de l'ADN et la traduction. De manière remarquable, des données expérimentales obtenues chez des modèles bactériens et eucaryotes appuient cette idée. J'ai ensuite mis au point des outils expérimentaux qui permettront d'éprouver la pertinence biologique de certaines des prédictions effectuées.<br />Finalement, j'ai examiné la distribution taxonomique des gènes de la réplication dans les génomes d'Archaea afin de prédire la composition probable de la machinerie de réplication de l'ADN chez le dernier ancêtre commun des Archaea. Dans leur ensemble, les profils phylétiques des gènes de la réplication suggèrent que la machinerie ancestrale était plus complexe que celle des organismes archéens contemporains.

Les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) sont considérés comme des messagers intracellulaires et sont produits principalement par les NADPH oxydases (Nox) dont Nox4 est l'un des représentants. Le dysfonctionnement de Nox4 est relié à de nombreuses pathologies (cancer, athérosclérose, hypertension pulmonaire ou arthrose). La régulation de l'activité NADPH oxydase de Nox4 est encore peu connue. L'objectif de ce travail est d'étudier l'activité NADPH oxydase et diaphorase (initiation du transfert d'électron) de Nox4.<br />Le clonage du gène de Nox4 a mis en évidence deux isoformes protéiques (Nox4A, forme entière et Nox4B, forme délétée d'un domaine de fixation du NADPH). La mise en place de deux modèles d'étude cellulaire (cellules HEK293E) et acellulaire (protéines recombinantes Nox4 tronquées) a permis d'obtenir les résultats suivants:<br />1) L'activité NADPH oxydase de Nox4A surexprimée dans les cellules HEK293E est constitutive et la partie C terminale cytosolique en milieu acellulaire possède une activité diaphorase. Par contre, Nox4B est inactive. <br />2) L'activité NADPH oxydase de Nox4 est inhibée par une série de composés quinones faiblement substitués (benzoquinone, hydroquinone, tMetBQ) et stimulée par d'autres quinones (tBuBQ, tBuBHQ, duroquinone, AA-861). L'implication du calcium et de la 5-lipoxygénase dans le mécanisme d'action des composés AA-861 et tBuBHQ a été écartée. Nos données convergent vers l'hypothèse d'une action directe des quinones sur la partie N terminale membranaire de Nox4.<br />Nous avons donc démontré que l'activité NADPH oxydase de Nox4 n'est pas seulement constitutive mais modulable par différentes quinones. Le mécanisme moléculaire précis reste à définir.

La quiescine/sulfhydryl oxydase QSOX1 catalyse la formation de ponts disulfures. In vivo, ses substrats et ses rôles cellulaires restent à déterminer. Les stress oxydants sont notamment impliqués dans les maladies neurodégénératives. L'hormone estradiol-17b (E2) possède des effets neuroprotecteurs. Nos objectifs ont été d'étudier la régulation de l'expression de QSOX1 par E2 et son implication dans les stress oxydants et la neuroprotection par E2.<br />Nous avons tenté d'établir un modèle de protection par E2 des cellules PC12/ERa soumises à un stress oxydant induit par H2O2 ou le complexe Fe(III)-HQ. Malgré différentes conditions testées, aucune protection par E2 n'a pu être obtenue.<br />Nous avons ensuite étudié la régulation de l'expression de QSOX1 dans le cerveau de Rates ovariectomisées traitées ou non par E2. Dans trois aires cérébrales exprimant fortement ERa et ERb, le niveau de messagers QSOX1 diminue en présence de E2.<br />Enfin, nous avons étudié l'implication de QSOX1 dans les stress oxydants. Dans les cellules PC12 soumises au stress oxydant, l'expression des messagers et de la protéine QSOX1 augmente. Suite au stress oxydant, la viabilité des cellules MCF-7 surexprimant QSOX1 diminue moins fortement que celle des cellules contrôles. La diminution de l'apoptose est associée à une moindre dépolarisation des mitochondries dans ces cellules.<br />Nos travaux ont ainsi permis de confirmer l'estrogéno-dépendance de QSOX1 in vivo et de montrer pour la première fois le rôle de QSOX1 dans la protection des cellules contre l'apoptose induite par les stress oxydants. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives et renforcent l'intérêt de l'étude de QSOX1 dans la neuroprotection par E2.

Les mécanismes d'adaptation d'Escherichia coli à une alternance quotidienne entre des conditions de croissance et de carence ont été étudiés grâce à une stratégie d'évolution expérimentale. Douze populations d'E. coli, dérivant d'un ancêtre commun, ont été propagées pendant plus de 40 000 générations par transferts journaliers dans un milieu minimum contenant une quantité limitante de glucose. L'évolution des 12 populations se caractérise par un degré important de parallélisme phénotypique (augmentation du fitness et du volume cellulaire, ...) et génétique, les mêmes gènes étant ciblés par la sélection naturelle dans la majorité des populations. Des mutations bénéfiques ciblant le gène spoT, acteur majeur de la réponse stringente permettant l'adaptation aux carences, avaient été identifiées dans 8 populations. Nous avons mis en évidence des mutations bénéfiques ciblant des gènes impliqués dans la biosynthèse de la paroi (pbpA-rodA) et la superhélicité de l'ADN (topA, fis). L'étude moléculaire de 2 mutations bénéfiques touchant l'opéron pbpA-rodA révèle qu'elles diminuent la quantité de protéine PBP2. L'analyse de 3 mutations ciblant le gène spoT montre qu'elles atténuent le contrôle stringent lors de l'entrée en phase stationnaire sans modifier les niveaux cellulaires de (p)ppGpp. Différentes mutations d'un même gène ayant les mêmes effets, l'évolution révèle un parallélisme moléculaire important. Près de la moitié des mutations bénéfiques affecte les réseaux de régulation globale de l'expression des gènes (spoT, fis, topA). La plasticité des réseaux de régulation globale joue donc un rôle primordial au cours de l'évolution et l'adaptation des bactéries.