L'hyménoptère Cotesia congregata (Microgastrinae ; Braconidae) pond ses oeufs à l'intérieur de son hôte, la chenille du lépidoptère Manduca sexta (Noctuidae ; Sphingidae) et introduit des particules virales de bracovirus contenant 30 cercles d'ADN double brin. Les gènes viraux portés par ces cercles codent pour une série de protéines qui sont produites dans les tissus de la chenille parasitée. Ces protéines virales jouent un rôle indispensable à la réussite parasitaire. En effet, l'expression des gènes viraux entraîne de nombreuses altérations de la physiologie de l'hôte, notamment un contournement de l'immunité de la chenille qui permet le développement des larves du parasite. D'autre part, le développement de l'hôte est bloqué à un stade pré-pupal. Les travaux portant sur la caractérisation des génomes de bracovirus ont beaucoup progressé et plusieurs familles de gènes ont été découvertes. Une synthèse des connaissances actuelles sur l'immunité des insectes et les gènes de bracovirus potentiellement impliqués dans le contrôle de l'immunité et du développement des lépidoptères est présentée en introduction.<br />Au cours de ma thèse, le séquençage et l'analyse du génome du bracovirus de Cotesia congregata ont été réalisés (Espagne et al 2004). L'existence de plusieurs familles multigéniques a été mise en évidence, notamment la famille des protéines tyrosines phosphatases (PTP) composée de 27 gènes (Provost et al 2004), la famille des cystatines composée de 3 gènes (Espagne et al soumis) et enfin celle des protéines à motif ankyrine composée de 6 gènes (Pennacchio et al en préparation). La caractérisation détaillée de la famille des PTP a été effectuée. La technique d'électrophorèse en champs inversés (FIGE) a permis la localisation physique de ces gènes sur l'ensemble du génome viral, et leur expression a été analysée dans une série de tissus de l'hôte parasité grâce à une méthode de PCR multiplex. Enfin, des tests d'activité biochimique de PTP de bracovirus produites in vitro grâce à un système d'expression en baculovirus.<br />Les gènes des familles décrites sont exprimés dans l'hôte parasité et les protéines possèdent, en général, la fonction biochimique prédite grâce aux domaines conservés qu'elles contiennent. Ceci suggère que ces protéines virales jouent un rôle actif dans les modifications de la physiologie de l'hôte induite par le parasitisme. La caractérisation des gènes viraux exprimés dans l'hôte est une étape indispensable vers l'identification du rôle individuel de chaque protéine dans le contrôle de la physiologie des chenilles parasitées.

Le cycle érythrocytaire de Plasmodium falciparum, parasite responsable du paludisme, alterne entre prolifération intense et différenciation sexuée impliquant un contrôle fin de l'expression des gènes. Cependant, les acteurs de la régulation transcriptionnelle sont encore peu décrits.<br />L'étude comparative du transcriptome des clones 3D7 et F12, ne produisant pas de gamétocytes, a permis d'identifier à l'aide d'une bio-puce à ADN thématique, plusieurs gènes différemment exprimés et potentiellement impliqués dans la régulation des événements clés de la vie du parasite.<br />L'annotation de facteurs de transcription et d'éléments de régulation nous a conduit à analyser un facteur spécifique de séquence ADN de la famille <br />Myb des protéines à domaines tryptophane. La protéine PfMyb1 présente dans les extraits nucléaires du parasite est capable de se lier à des motifs "Myb Regulatory Element" identifiés dans des promoteurs plasmodiaux. L'inactivation du gène pfmyb1 par un ARN double brin a montré que ce facteur est essentiel à la survie du parasite et qu'il intervient dans la régulation transcriptionnelle de plusieurs gènes. Puis, deux facteurs spécifiques de structure ADN de la famille "High Mobility Group" des protéines à motif "HMG-box" HMGB ont été caractérisés par leurs propriétés architecturales essentielles au remodelage de la chromatine. Les différences d'activité, de localisation et d'expression de PfHMGB1 et PfHMGB2, lors du développement érythrocytaire, soulignent leur absence de redondance dans le parasite.<br />La caractérisation de ces interactions dynamiques ADN/protéines pourrait fournir de nouvelles stratégies de lutte contre cet important pathogène humain.

L'interférence par l'ARN (ARNi) désigne la dégradation spécifique de séquence des ARN induite par des ARN double brin. Dans les cellules de mammifères, l'ARNi peut être induite par des petits ARN interférants (siARN). L'ARNi est effectuée par le complexe RISC (RNA induced silencing complex) contenant, entre autre, la séquence d'ARN guide, qui permet la reconnaissance de la cible et la nucléase Ago2, responsable de son clivage.<br />Ces travaux ont porté sur l'analyse cinétique de la dégradation des ARNm induite par les siARN dans des cellules de mammifères. Nous avons mesuré les vitesses de dégradation des ARNm de β-globine et de lymphotoxine-α sous interférence et montré, d'une part, que les différences d'efficacité des siARN sont liées à des différences de vitesses de dégradation et, d'autre part, que ces vitesses s'accélèrent entre 16h et 24h après la transfection pour deux siARN inhibant 80 à 90% des messagers. Nous avons aussi observé qu'un même siARN induit des inhibitions différentes pour les deux messagers de la lymphotoxine-α, ce qui nous a amené à proposer l'existence d'une interaction entre la traduction et l'interférence par l'ARN. <br />Nous avons analysé l'impact de l'interférence sur le métabolisme nucléaire des ARNm. Nous avons ainsi démontré que les siARN induisent la dégradation des ARN nucléaires avec une efficacité qui dépend d'une compétition cinétique entre l'interférence et les réactions de maturation et d'export qui affectent le transcrit ciblé. De plus, nous avons observé que la dégradation d'un ARN messager pouvait s'accompagner d'une accumulation de ses précurseurs, probablement par une augmentation de synthèse. Ainsi, l'interférence permet-elle de mettre en évidence de nouvelles régulations du métabolisme nucléaire des ARN.

La glycobiologie structurale est la branche de la biologie qui étudie la structure et les interactions de glucides, molécules jouant des rôles d'extrême importance dans tous les organismes. Dans la première partie de la thèse, nous nous sommes intéressés à la structure 3D de deux glycoconjugués, la tricolorine A et un O-glycanne de la protéine de Tamm-Horsfall, en utilisant les méthodes de cristallographie et de modélisation moléculaire. Le sujet développé dans la deuxième partie est centré sur l'interaction de glucides avec leurs récepteurs protéiques, les lectines. Les lectines sont une importante classe de protéines avec la capacité de “lire” l'information biologique qui est codifiée dans la structure 3D des sucres. La cristallographie macromoléculaire en combinaison avec des techniques de biophysique, telles que la microcalorimétrie de titration, ont été utilisées pour élucider les bases structurales et thermodynamiques de la reconnaissance lectine-sucre. Deux lectines, produites par les bactéries pathogènes opportunistes Pseudomonas aeruginosa et Chromobacterium violaceum et ayant un rôle dans l'infectivité, ont été étudiées. La structure tridimensionnelle de la lectine de Psathyrella velutina, le premier membre d'un nouvelle famille des lectines de champignon a également été résolue.

Chez les Vertébrés, la moelle épinière se développe à partir de la région postérieure de la plaque neurale. La plaque neurale se ferme progressivement pour donner la gouttière puis le tube neural au cours de l'allongement antéro-postérieur de l'embryon. Les précurseurs neuraux sont soumis à l'action de morphogènes comme Sonic Hedgehog (Shh) au niveau de la gouttière neurale. La protéine Shh qui est sécrétée par les structures ventrales de la gouttière et du tube neural contrôle à la fois la prolifération et la spécification des précurseurs neuraux ventraux. Si les mécanismes moléculaires qui mènent à la spécification neuronale commençaient à être bien connus, les bases moléculaires de l'action proliférative de Shh restaient à élucider. <br />Pour comprendre comment Shh contrôle la prolifération dans l'ébauche de moelle épinière j'ai utilisé l'embryon de poulet comme modèle d'étude. J'ai observé que deux régulateurs du cycle cellulaire : Cycline D1 et CDC25B sont exprimés dans la partie ventrale de la gouttière neurale. Les Cyclines D sont connues pour leur rôle dans le couplage des signaux extracellulaires avec la progression des cellules en phase G1 du cycle. La phosphatase CDC25B est connue pour promouvoir la transition G2/M. J'ai démontré par des expériences de perte et de gain de fonction que l'expression de Cycline D1 et de CDC25B est régulée par la voie de signalisation Shh dans la partie ventrale de la gouttière neurale. L'inhibition de la voie dans le tube neural entraîne un blocage des cellules en phase G1 et à la transition G2/M. La surexpression de Cycline D1 dans le tube neural favorise la prolifération cellulaire au détriment de la différenciation neuronale. Ces données suggèrent donc que Shh pourrait maintenir en prolifération certaines populations de précurseurs neuraux par l'activation de la Cycline D1. Ce travail a donc permis l'identification de Cycline D1 et CDC25B comme des cibles de Shh. Il suggère que Shh agit positivement sur la prolifération à deux phases du cycle cellulaire : la progression en G1 et la transition G2/M. Le contrôle de la progression en G1 pourrait servir à maintenir certains précurseurs en prolifération, la signification du contrôle à la transition G2/M reste à être déterminé. Cette étude nous permet de mieux comprendre par quels mécanismes la voie de signalisation Shh va coordonner la prolifération avec la spécification dans le tube neural.

La protéine FUR (Ferric Uptake Regulator) est un régulateur global ubiquitaire chez les bactéries Gram-négatives. Sa liaison au Fe2+, in vivo, entraîne la répression de l'expression des gènes qu'elle contrôle. Ce travail est une étude structurale par RMN de la forme dimérique non activée de FUR d'Escherichia coli, un dimère de 2*17 kDa contenant un ion zinc par monomère. Une forme monomérique oxydée, capable de dimériser en présence de réducteur et de zinc, a également été isolée et étudiée. Le dichroïsme circulaire et la RMN montrent que la dimérisation entraîne une structuration du domaine C-terminal lors de l'incorporation du zinc. Les structures secondaires du domaine N-terminal du monomère et du dimère sont très proches. Seuls les premiers résidus sont structurés en hélice Α dans le monomère et déstructurés dans le dimère non activé. Cette hélice, observée dans le dimère activé de FUR de P. aeruginosa, pourrait jouer un rôle dans le mécanisme de régulation. Une protéine tronquée (FUR1-82) a été construite, purifiée, cristallisée. Sa structure est superposable à celle du domaine N-terminal de FUR de P. aeruginosa et le spectre 1H-15N-HSQC est superposable aux signaux du domaine N-terminal de FUR monomère. L'étude, par anisotropie de fluorescence, de la liaison du monomère et du dimère à l'ADN montre qu'ils se lient spécifiquement à l'ADN en présence de métal, contrairement à la forme tronquée. L'affinité du monomère pour l'ADN est 5 fois plus faible que celle du dimère en excès de métal. L'ensemble de ces données nous a permis de proposer un mécanisme de dimérisation de FUR d'E. coli ainsi qu'un mécanisme d'activation mettant en jeu cette hélice Α N-terminale.

Le lymphome cutané primitif (LCP) CD30+ est une lymphoprolifération maligne de phénotype T. Son oncogenèse reste à ce jour inconnue. Le but de ma thèse est d'identifier des gènes exprimés spécifiquement dans les LCP CD30+ afin de comprendre les mécanismes d'oncogenèse et également d'identifier des marqueurs diagnostics ou thérapeutiques. Des banques d'ADNc soustraites sont réalisées par SSH « Suppressive Subtractive Hybridisation » entre des LCP CD30+ et des lymphocytes sanguins. Ces banques sont ensuite criblées par des techniques de Dot Blot avec des sondes radiomarquées spécifiques des échantillons étudiés. Les clones sélectionnés sont enfin validés par PCR en temps réel. Nous avons ainsi mis en évidence cinq gènes surexprimés dans les LCP CD30+ : THW, p120caténine, SPARC, PTTG1, CD30 et cinq gènes sousexprimés : humanine, CIN85, Bcl11B, CD30 L et CD30s. Il reste à vérifier si ces gènes sont responsables de l'oncogenèse ou s'ils sont uniquement des phénotypes des LCP CD30+.

Le manioc (Manihot esculenta Crantz) est une plante, dont les tubercules servent de nourriture de base pour près de 800 millions de personnes sous les tropiques. Malgré sont importance, ce tubercule présente deux inconvénients majeurs qui limitent leur utilisation en alimentation humaine : Une toxicité liée à la présence de composés cyanés, et une faible teneur en protéines. Dans l'optique de lever ces contraintes, plusieurs procédés de transformation ont étés mis au point par l'expérience des populations et des améliorations ont été apportées par la recherche. La plupart de ces procédés incluent une étape critique de fermentation spontanée. Cette étape présente quelques problèmes dus à sa dépendance vis à vis des microorganismes épiphytes. Ces problèmes sont notamment la présence de quantités résiduelles de composés cyanés non négligeables (100 à 170ppm) un temps de ramollissement très long (4 à 5 jours) et des produits dérivés de qualités nutritionnelles et hygiéniques douteuses. Dans l'optique d'améliorer ces procédés traditionnels de rouissage du manioc cyanogène, une centaine de microorganismes ont été isolés des cossettes de manioc séché, sur la base de leurs potentialités à produire la β-glucosidase, l'α-amylase, la pectine hydrolase et la polygalacturonase. Ces enzymes sont les plus impliqués dans les phénomènes biochimiques et physico-chimiques ayant lieu au cours du rouissage du manioc. Ils sont responsables de la dégradation des composés cyanés et du ramollissement des tubercules par dégradation des pectines qui constituent le squelette du tubercule. 60% des microorganismes isolés et identifiés ont été productrices d'α-amylases, 46% de β-glucosidase, et 36%de pectinases. Les capacités des différentes souches sélectionnées à produire ces principaux enzymes, ont ensuite été évaluées. Parmi ces microorganismes, deux se sont avérés particulièrement intéressantes : Une souche de bactérie lactique identifiée comme étant Lactobacillus plantarum avec une activité α-amylase de l'ordre de 17000±100UE/ml, et une activité ß-glucosidase de 2000±300µmol CN-/mn; Une moisissure identifiée comme étant Rhizopus oryzae à activité α-amylase de 20000±500UE/ml et activité pectine hydrolase de 2,3±0,2 µmol COO-/mn/mg. Ces deux souches ont été sélectionnées et utilisées comme ferments en culture mixte avec une biomasse initiale de 106ufc/g manioc frais de Lactobacillus plantarum et 103spores/g manioc frais de Rhizopus oryzae pour la fermentation des tubercules de manioc. Les résultats obtenus ont indiqué une acidification rapide avec un pH avoisinant 3,5±1 après 24 heures de rouissage, un ramollissement plus rapide (12±3mm/5s après 48 heures de rouissage). Mais le rouissage naturel s'est avéré meilleur du point de vue dégradation des composés cyanés. En effet la très forte acidification obtenue avec le ferment dès la 24eme heure, a provoqué un blocage du processus de dégradation des glucosides cyanogénétiques au niveau de la cyanohydrine, composé par ailleurs aussi toxique que l'acide cyanhydrique. Une étude de l'influence de quelques paramètres externes nous ont permis de noter que la température optimale de croissance de Lactobacillus plantarum était de 40±5°C pour un pH optimal de 6 alors que Rhizopus oryzae avait une température optimale de croissance à 30±7°C et un pH optimal de 5. Les essais de production de biomasses, indiquent que le meilleur milieu de multiplication des germes s'est avéré être le milieu CTM de Law et al., avec pour substrat de la farine de son de manioc mélangée au milieu nutritif de Meyer.<br />Dans l'optique de mettre à la disposition des populations ce ferment, des essais de conservation des souches par séchage ont indiqué que le fluide de protection indiqué pour avoir des taux de survies acceptables au terme du séchage était le glycérol, alors que le support le plus adapté a été l'amidon de manioc. On a ainsi obtenu plus de 75±5% de survivants après séchage sur lit convectif à une température de 35°C sous un débit d'air de 10 m3/h pour tous les deux germes. Ce ferment composé de Lactobacillus plantarum (106ufc/g) et Rhizopus oryzae (103spores/g), sur support amidon a induit contrairement aux microorganismes frais, une diminution effective du taux de glucosides totaux résiduels (5% en fin de rouissage) diminution corollaire à l'ajout du NaOH réalisé après la 24ème heure, afin de contourner l'effet néfaste du pH acide sur la dégradation de la cyanohydrine.

L'ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique est une protéine membranaire dont plusieurs conformations ont été résolues par cristallographie des rayons X. Ces structures ont été précieuses pour l'interprétation de nos études fonctionnelles sur le rôle du domaine A et de la boucle L6-7 de l'ATPase. Mais nous avons montré que les conditions de cristallisation aboutissent parfois à des structures paradoxales : la présence de concentrations importantes de Ca2+ pendant la cristallisation en présence d'AMPPCP conduit l'ATPase à adopter une conformation probablement différente de sa structure moyenne en solution; de même, dans les conformations de l'ATPase proches de l'état phosphorylé «E2P», les inhibiteurs généralement utilisés pour stabiliser l'ATPase bloquent de façon artéfactuelle l'ouverture des sites Ca2+ vers la lumière du réticulum. Nous avons tenté de comprendre les avantages et inconvénients de divers polymères amphiphiles conçus pour stabiliser en solution les protéines membranaires.

Le parasite intracellulaire Toxoplasma gondii est l'agent pathogène de la toxoplasmose. Cette maladie est gravissime pour le fœtus et pour l'individu immunodéprimé. L'interconversion du parasite de la forme tachyzoïte virulente à la forme bradyzoïte quiescente est au centre de la pathogénèse de cette infection. Ce processus engage une régulation coordonnée des gènes du parasite qui se traduit par une cascade d'évènements moléculaires au niveau de l'ADN. Des études suggèrent un contrôle transcriptionnel de l'interconversion avec l'expression exclusive de certains gènes dans une forme donnée. Cependant, ce parasite et son phyllum se distinguent des autres eucaryotes par une quasi-pénurie des facteurs spécifiques de transcription. Nous avons émis l'hypothèse que le niveau d'expression des gènes du Toxoplasme est étroitement régulé par la structure physique et la nature chimique de la chromatine. Ce manuscrit illustre l'influence majeure du « code histone » sur la différenciation parasitaire. Nous avons identifié plusieurs enzymes en charge de l'écriture de ce code. L'exemple le plus frappant est la découverte d'une methyltransférase TgCARM1 qui méthyle l'arginine 17 de l'histone H3, une marque activatrice de la transcription. Nous avons également identifié le premier complexe co-repressor du Toxoplasme (TgCRC). TgCRC en opposition avec l'acétylase TgGCN5 régule en partie la balance acétylation/déacétylation, qui en retour influe sur la différenciation parasitaire. L'ensemble de nos résultats converge vers l'idée de l'existence d'un « code histone parasitaire » hautement sophistiqué, qui a co-évolué avec celui de la cellule hôte parasitée.