Les patients atteints de dystrophies musculaires présentent de plus en plus fréquemment des complications cardiaques, qui sont majoritairement des cardiomyopathies dilatées (CMD), et qui déterminent leur pronostic vital. Dans ce contexte, les traitements de l'atteinte cardiaque sont ceux de l'insuffisance cardiaque, qui agissent sur l'environnement fonctionnel du cœur, mais pas directement sur l'atteinte myocardique.<br /> L'objectif de cette thèse a été d'évaluer les effets d'un traitement novateur de la CMD dans les dystrophies musculaires, en utilisant le hamster de la lignée CHF147. La démarche proposée est d'induire un phénomène compensateur de la dilatation cardiaque et ainsi d'améliorer le pronostic vital, en utilisant les propriétés de l'Insulin-like Growth Factor 1 (IGF-1).<br /> Des hamsters CHF147 jeunes ont été traités pendant un temps court, de façon systémique avec la protéine recombinante IGF-1 (rhIGF-1) à faible dose. Les effets macroscopiques, histologiques et fonctionnels du traitement ont été évalués 35 jours après le début de celui-ci et les voies de signalisation impliquées dans l'induction des effets observés ont été étudiées. Une étude de survie a été réalisée afin de mesurer les effets du traitement à long terme. L'évaluation des effets à court terme de l'administration de rhIGF-1 sur la CMD du hamster CHF147 indique un ralentissement de la dilatation des cavités cardiaques ainsi que de l'extension de la fibrose myocardique, et une préservation de multiples paramètres fonctionnels, tels que le débit cardiaque, le volume d'éjection, la pression de fin de diastole et, en particulier, la contractilité myocardique. Les effets observés sont dus en partie à des modifications au niveau des protéines impliquées dans le cycle du calcium. A long terme, la survie des hamsters CHF147 traités augmente significativement d'environ 20% et est associée à une préservation partielle de la fonction cardiaque.<br />Toutefois, une augmentation du niveau sérique d'IGF-1 pourrait augmenter le risque d'effets secondaires délétères. Afin de limiter les effets systémiques d'IGF-1 et de cibler son administration au cœur, nous avons injecté localement le plasmide pCMV-IGF1 codant pour l'IGF-1 dans le myocarde des hamsters CHF147. Les effets du traitement ont été évalués après 35 jours et montrent des résultats comparables à ceux obtenus avec la protéine rhIGF-1.<br />En conclusion, ce travail de thèse a montré qu'un traitement basé sur IGF-1 permet de ralentir l'évolution de la CMD des hamsters CHF147, en préservant la structure et la fonction cardiaques, et d'améliorer significativement leur survie. IGF-1 semble donc être un candidat prometteur pour la mise au point d'une approche par thérapie génique dans l'insuffisance cardiaque, due à une CMD, dans le contexte des dystrophies musculaires.

Le système de sécrétion de type III est présent chez plusieurs pathogènes à Gram négatif chez qui cette véritable nanomachine est impliquée dans le transport de molécules de virulence directement des bactéries vers le cytoplasme des cellules-cible. Pseudomonas aeruginosa, bactérie dont l'aiguille de sécrétion de type III est étudiée dans cette thèse, est responsable de nombreuses maladies nosocomiales ainsi que d'infections chez les patients atteints de mucoviscidose. Ce système de sécrétion est composé d'une base ancrée dans la double membrane bactérienne et d'une structure creuse en forme d'aiguille qui est un homopolymère d'une petite protéine.<br /><br />Dans le cytoplasme bactérien, la protéine PscF qui forme l'aiguille de type III chez P. aeruginosa est stabilisée avant sa sécrétion par 2 chaperonnes distinctes; PscE et PscG. Ceci est nécessaire à la fonctionnalité du système de sécrétion de type III.<br /><br />La structure cristallographique à 2.0A de résolution du complexe hétérotrimérique PscE:PscF55-85-PscG révèle que le domaine C-terminal de la protéine de l'aiguille PscF, impliqué dans le processus de polymérisation, est enfoui dans une cavité hydrophobe de la protéine PscG repliée de façon semblable à un domaine TPR. Ceci montre que le repliement macromoléculaire nécessaire pour stabiliser la protéine de l'aiguille de type III est différent de celui décrit chez le pilus de type IV et le flagelle. Les résidus qui précèdent l'hélice C-terminale de PscF sont maintenus dépliés par des interactions hydrophobes avec PscG. Ainsi, avant sa sécrétion, PscF est maintenue partiellement dépliée par ses chaperonnes. Elle transiterait ensuite sous forme partiellement dépliée à travers l'aiguille avant de se replier lors de sa polymérisation.<br /><br />La rupture des interactions spécifiques entre PscG et PscF entraîne une nette baisse de la cytotoxicité de la bactérie envers une lignée de macrophages, ce qui indique que cet hétérotrimère essentiel, qui possède des homologues chez une grande variété de pathogènes, est une cible thérapeutique attractive pour le développement de nouveaux médicaments.

Le gène copH est l'un des 19 gènes constituant le cluster cop, impliqué dans la détoxication du cuivre dans le cytoplasme et le périplasme, chez Cupriavidus metallidurans CH34, souche modèle pour l'étude de la résistance aux métaux lourds chez les bactéries. La protéine CopH, localisée dans le périplasme, possède une structure et une fonction inconnues mais son expression est stimulée par la présence de cuivre. Nous avons analysé les propriétés de liaison CopH-Cu : les données montrent la présence d'un centre Cu(II) de type 2 dans un champ de ligands azotés. Les 2 seuls résidus histidine, a priori ligands du cuivre, n'interagiraient pas directement avec les ions Cu(II). Le site cuivre serait constitué d'atomes d'azote appartenant à la chaîne principale de la protéine.<br />L'étude des transporteurs CusA et CzcA a nécessité une purification optimisée en détergents et l'analyse de leur comportement en solution.

La protéine p76 (« hypothetical protein LOC196463 ») a été identifiée au laboratoire lors d'une analyse protéomique ciblant les protéines mannose-6-phosphate de lignées cellulaires humaines U937 et MCF7. Ce rapport de thèse présente l'étude de cette protéine concernant certaines de ses caractéristiques biochimiques, sa localisation intracellulaire et l'approche de sa fonction. Ainsi, nous avons mis en évidence la présence de 6 N-glycosylations, ainsi que la présence effective de sucres mannose-6-phosphate. Une maturation protéolytique des précurseurs de la forme humaine et murine de p76 a été observée ; les chaînes issues de ces clivages ont été en partie caractérisées à l'aide des anticorps développés au laboratoire. L'étude de sa localisation intracellulaire par immunofluorescence et par fractionnements subcellulaires réalisés sur du foie de souris indique clairement que p76 est localisée dans les lysosomes. Enfin, p76 ayant une homologie de séquence avec une phospholipase B nouvellement caractérisée de Dictyostelium discoideum, des tests fonctionnels ont été mis en œuvre pour détecter une telle activité pour la protéine recombinante hp76-myc, mais sans succès. En revanche, une expérience de fat blot a montré que hp76-myc se lie à la cardiolipine, un phospholipide particulier des membranes mitochondriales et bactériennes.

Les NOX Homologues représentent une nouvelle famille de protéines transmembranaires dont la caractéristique commune est d'être le cœur catalytique de la production d'anions superoxydes. Elles ont toutes une structure proche de NOX2 (ou gp91Phox selon l'ancienne nomenclature), la mieux caractérisée d'entre elles, et sont organisées en 6 ou 7 domaines transmembranaires. Cette famille compte actuellement 7 membres, NOX1, NOX2, NOX3, NOX4, NOX5 et DUOX 1 et DUOX2 ; elles ont une distribution tissulaire, cellulaire et intracellulaire spécifique les rendant quasi ubiquitaires dans l'organisme. Les fonctions de ces enzymes sont essentiellement rattachées à celles des espèces réactives de l'oxygène (ERO) mais dépendent aussi de leurs localisations. NOX2 est l'enzyme à l'origine de la production des ERO des phagocytes activés et a donc une fonction antimicrobienne. NOX3 est impliquée dans les pathologies du système vestibulaire et les DUOX1 et 2 sont des éléments clés de la biosynthèse des hormones thyroïdiennes. Les autres NOX, (NOX1, NOX4, NOX5), individualisées depuis quelques années seulement, ont une distribution tissulaire et cellulaire d'expression ARNm bien caractérisée, mais les données sur leurs fonctions physiologiques ou physiopathologiques restent fragmentaires ; Ces données sont le plus souvent issues d'expérimentations in vitro ou ex vivo n'évaluant leurs fonctions que de façon indirecte ou dans des systèmes simplifiés. Ainsi, en utilisant un modèle animal de souris déficientes pour le gène NOX1 établi dans le laboratoire, nous avons évalué directement la fonction de NOX1 dans le colon et dans le système vasculaire. <br />La première partie de ce travail a eu pour objectif de déterminer si NOX1 exerce une activité antibactérienne au niveau du colon et participe au contrôle de la translocation bactérienne à travers la muqueuse colique. NOX1 participe à la sévérité de la colite au Dextran Sulfate Sodium par l'intermédiaire de la flore colique et protège de la translocation bactérienne dans un modèle de neutropénie induite. Cependant, ces résultats devront être confirmés car les expérimentations ont toutes été réalisées avec des souris dont le fond génétique n'avait une homologie que de 87.5%. La seconde partie de notre travail devait déterminer si NOX1 exerce une activité régulatrice de la pression artérielle systolique et participe à la survenue de l'hypertension artérielle induite par l'angiotensine II. Nous montrons, avec des souris de génération F6 (homologie>98.5%), que NOX1 participe à la régulation physiologique de la pression artérielle, à la survenue de l'hypertension artérielle induite par l'angiotensine II et à la survenue de dissection aortique. NOX1 agit dans le tissu vasculaire par au moins 3 mécanismes, en favorisant l'accumulation de matrice extracellulaire, en régulant l'expression génique et en diminuant la biodisponibilité du NO.

Durant ma thèse, je me suis intéressé à deux ARN régulateurs procaryotiques. Le premier, l'ARNIII, est un ARN multifonctionnel qui régule l'expression des gènes de virulence chez Staphylococcus aureus. Le second, CopA, est un ARN strictement complémentaire à sa cible et régule le taux de réplication du plasmide R1. L'ARNIII réprime l'expression des facteurs d'adhésion et active la synthèse des toxines en fin de phase exponentielle de croissance. Nous avons montré que le domaine 3' de l'ARNIII est nécessaire et suffisant pour l'inhibition de l'expression de deux protéines au niveau post-transcriptionnel, la protéine A et SA1000. La fixation de l'ARNIII à ses cibles est initiée par un contact boucle-boucle qui est rapidement converti en un duplex étendu. Ce duplex est ensuite la cible de la RNase III pour induire la dégradation rapide de l'ARNm. Nous avons également montré que la protéine Hfq est un ligand de l'ARNIII. Cette protéine est généralement impliquée dans des mécanismes de régulation basés sur des ARN régulateurs. La fonction de cette interaction dans la virulence de S. aureus est en cours d'étude.<br />L'ARN antisens CopA régule le taux de réplication du plasmide R1 en contrôlant la synthèse de la protéine initiatrice de la réplication, RepA. La fixation de CopA à sa cible, l'ARNm repA, inhibe la traduction et favorise la dégradation de l'ARNm par la RNase III. L'interaction entre les deux ARN conduit à la formation d'un complexe irréversible. Ce complexe n'est pas un duplex étendu, mais contient une jonction à quatre hélices stabilisée par une longue hélice intermoléculaire, l'hélice C. Nous avons montré que les structures des deux ARN ont évoluées afin de bloquer la progression du complexe irréversible vers le duplex étendu. De plus, nous avons montré que au sein du complexe irréversible, l'hélice C est reconnue efficacement par la RNase III au niveau de sites préférentiels.

En France la prise en charge des grandes douleurs fait toute sa place à la morphine. Cependant la prise prolongée de morphine entraîne la tolérance et la dépendance. Une stratégie de protéomique différentielle a été entreprise afin d'identifier les adaptations cellulaires à un traitement par la drogue dans des cellules SH-SY5Y. Nous avons montré, notamment, qu'un traitement chronique entraîne la dégradation par le protéasome des protéines Gbeta et Ggamma2. Aussi, le niveau de dégradation de Gbeta est corrélé avec le niveau de sensibilisation de l'adénylyl cyclase (AC), phénomène impliqué dans la dépendance à la morphine. Globalement, l'analyse protéomique a permis de détecter environ 50 protéines et une centaine de phosphoprotéines modulées par la drogue. Mes travaux ont permis de proposer un nouveau mécanisme moléculaire responsable de la sensibilisation de l'AC et surtout suggèrent pour la première fois que le protéasome est impliqué dans les effets chroniques de la morphine.

L'activité de PrfA, régulateur transcriptionnel de nombreux gènes de virulence de Listeria monocytogenes, dont hly, est inhibée par des sucres rapidement métabolisés comme le glucose et le fructose. Cette inhibition ne suit pas le mécanisme général de répression catabolique des firmicutes, car l'inactivation de ccpA (catabolite control protein A) ne lève pas la répression de l'expression des gènes de virulence exercée par le glucose ou le fructose. Dans le but de tester si le co-répresseur P-Ser-HPr serait impliqué dans la régulation de l'activité de PrfA, nous avons utilisé la souche BUG1199 de B. subtilis, qui contient intégrés à son génome, prfA sous contrôle du promoteur pspac qui est inductible à l'IPTG, et la fusion hly-lacZ. La formation de la P-Ser-HPr requiert l'intervention d'une enzyme bifonctionnelle l'HPr kinase/phosphorylase (HPrK/P), qui en fonction de la concentration de certains métabolites, soit phosphoryle HPr sur sa Ser-46, soit déphosphoryle la P-Ser-HPr. L'allèle hprKV267F codant pour une HPrK/P qui a conservé une activité kinase normale mais ne possédant quasiment plus d'activité phosphorylase, favorise l'accumulation de la P-Ser-HPr dans la cellule. L'introduction de la mutation hprKV267F dans BUG1199 inhibe fortement l'activité de PrfA. La substitution dans HPr de la Ser-46 par une alanine empêche la formation de la P-Ser-HPr et restaure l'activité de PrfA, alors que l'inactivation de CcpA n'a aucun effet. Cependant l'interruption de ccpA dans BUG1199 à hprK sauvage, inhibe l'activité de PrfA. Cette répression de l'activité de PrfA dans le mutant ∆ccpA est probablement due aussi à l'accumulation de P-Ser-HPr dans la cellule, car elle est levée lorsque la Ser-46 dans HPr est remplacée par une alanine. Outre sa phosphorylation sur la Ser-46, HPr est également phosphorylée sur son His-15 par l'enzyme I (EI) via la cascade de phosphorylation PEP-dépendante du PTS (Phosphoenolpyruvate carbohydrate phosphoTransferase System). Cependant la P-Ser-HPr est un mauvais substrat pour l'EI, ce qui favorise probablement l'inhibition de PrfA. En effet, l'interruption des gènes codant pour HPr et/ou EI, inhibe également l'activité de PrfA. Ainsi pour être active, PrfA a besoin d'un PTS fonctionnel.

Une perte de poids est une situation fréquemment rencontrée en médecine. Paradoxalement<br />quand elle est involontaire (dénutrition, hypercatabolisme), la consommation d'oxygène du<br />corps entier est augmentée. Cependant, les mécanismes biochimiques restent discutés. Nos<br />résultats montrent que la restriction calorique s'accompagne d'une diminution de l'activité de<br />la chaîne respiratoire et de la respiration de mitochondries hépatiques, proportionnelle à<br />l'intensité de la restriction calorique et fortement corrélée au taux plasmatique de leptine. A<br />l'inverse, chez le rat traité par dexaméthasone (modèle de dénutrition) il y a une augmentation<br />de la fuite de protons des mitochondries hépatiques et une anomalie in vivo de la<br />phosphorylation oxydative du muscle squelettique. Si ces modifications peuvent expliquer les<br />variations du métabolisme de base, l'adaptation à la restriction calorique semble aussi capable<br />de limiter la production de radicaux libres oxygénés.

MCM7, une des sous unités de l'ADN hélicase MCM, est poly-ubiquitinylée quand elle est sur la chromatine en réplication ou en réparation. Pendant la réplication, l'ubiquitinylation dégradative de MCM7 provoque son départ de la chromatine. La proto-oncoprotéine Int6 interagit avec les formes ubiquitinylées de MCM7 pour les protéger de la dégradation. Son absence entraîne la déstabilisation de MCM7 et l'apparition de lésions à l'ADN. La capacité d'Int6 à réguler la dégradation de MCM7 et peut-être d'autres facteurs semble donc primordiale pour la stabilité génomique. Suite à une irradiation causant des cassures de l'ADN, l'ubiquitinylation de MCM7 la stabilise et est stimulée par BRCA1, un suppresseur de tumeur doté d'une activité ubiquitine ligase. Cette stabilisation participerait au rôle de MCM7 dans le signalement des lésions de l'ADN. Ces travaux ajoutent MCM7 à la liste des protéines dont l'ubiquitinylation régule le métabolisme de l'ADN pour maintenir l'intégrité génomique.