Den ökande trenden med att använda tillverkade nanopartiklar (NPs) i olika tillämpningar i samhället har väckt oro när det gäller deras växelverkan med naturliga ekosystem. Syftet med denna studie är att ta fram data under förhållanden som simulerar realistiska scenarios och syftar till att förstå växelverkan mellan koboltbaserade NPs (Co, Co3O4 och Co SCS) och nickelbaserade NPs (Ni, NiO och Ni SCS) med naturliga nedbrytningsprodukter (biomolekyler, ekokorona) som utsöndras från Daphnia magna. Adsorption, metallfrisättning och stabilitet i närvaro av dessa biomolekyler (EC) i syntetiskt sötvatten (FW) är huvudfokus för denna multianalytiska studie. Förändringar av ytans sammansättning på grund av växelverkan mellan NPs och EC studerades parallellt. Resultaten jämfördes med resultat för NPs i närvaro av naturligt organiskt material (NOM) som tidigare tagits fram av medlemmar i professor Inger Odnevalls grupp vid avdelningen för Yt- och korrosionsvetenskap på KTH. ATR-IR-studierna visade på en tydlig och stark adsorption av EC till samtliga undersökta NPs där NPs av metall- och metalloxider vilka uppvisade den snabbaste adsorptionen. Uppmätta zeta-potentialer bekräftade en större adsorption av EC till NPs av metalloxider jämfört med övriga NPs. NTA-studier visade på en tydlig minskningen av partikelstorleken hos de undersökta NPs vid exponering i FW med EC jämfört med endast FW i vilken NPs av metalloxider uppvisade den mest signifikanta förändringen. Växelverkan mellan EC och NPs resulterade i en ökad metallfrisättning för flertalet av den undersökta NPs, med undantag av Ni SCS NPs. De nickelbaserade NPs uppvisade en lägre frisättningsnivå jämfört med de koboltbaserade NPs. Slutligen visade jämförelsen mellan närvaron av NOM och EC i syntetiskt sötvatten en signifikant skillnad i både zeta-potential och partikelstorlek under korta tider. Resultaten tyder på att adsorption av EC till NPs ger sämre skydd mot partikel-agglomerering än motsvarande adsorption av NOM. / The increasing trend of implementing engineered nanoparticles (NPs) in different societal applications has escalated the concerns on the risk of their interaction with natural ecosystems. With the lack of knowledge on NP interactions with biomolecules in ecosystems, this study provides a rather realistic scenario that aims to understand the interaction of cobalt-based NPs (Co, Co3O4, and Co SCS NPs) and nickel-based NPs (Ni, NiO and Ni SCS  NPs) with natural degradation products (eco-corona biomolecules) excreted from Daphnia magna. As the main focus of this study, the adsorption, dissolution, and stability of NPs in presence of the eco-corona biomolecules (EC) in synthetic freshwater (FW) were investigated by a multi-analytical approach. The effect of surface composition on the interaction of NPs was evaluated in parallel. The results were compared with NPs interacting with natural organic matters (NOM), research results previously performed by members of Prof. Odnevall’s group at the Division of Surface and Corrosion Science, KTH. ATR-IR studies showed a clear and strong adsorption of EC to all the investigated NPs with metallic and metal oxide NPs exhibiting the fastest adsorption. Zeta potential values corroborated the intensive adsorption of EC to metal oxides compared to the other NPs. NTA studies showed the decrease in particle size of the investigated NPs upon the exposure to EC compared to FW only with metal oxide NPs exhibiting the most significant change. The presence of EC enhanced the dissolution of most investigated NPs with Ni SCS NPs as an exception. Furthermore, nickel-based NPs showed lower dissolution than cobalt-based NPs. Finally, the comparison between effects in the presence of NOM and EC in freshwater showed significant differences in zeta potential as well as particle size over short-term exposures suggesting that the adsorption of EC to NPs provides less protection against agglomeration than adsorption of NOM.

This thesis covers a wide variety of projects within the domain of computational structural biology. Structural biology is concerned with the molecular structure of proteins and nucleic acids, and the relationship between structure and biological function. We used molecular modeling and simulation, a purely computational approach, to study DNA-linked molecular nanowires. We developed a computational tool that allows potential designs to be screened for viability, and then we used molecular dynamics (MD) simulations to test their stability. As an example of using molecular modeling to create experimentally testable hypotheses, we were able to suggest a new design based on pyrrylene vinylene monomers. In another project, we combined experiments and molecular modeling to gain insight into factors that influence the kinetic binding dynamics of fibrin "knob" peptides and complementary "holes." Molecular dynamics simulations provided helpful information about potential peptide structural conformations and intrachain interactions that may influence binding properties. The remaining projects discussed in this thesis all deal with RNA structure. The underlying approach for these studies is a recently developed chemical probing technology called 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE). One study focuses on ribosomal RNA, specifically the 23S rRNA from T. thermophilus. We used SHAPE experiments to show that Domain III of the T. thermophilus 23S rRNA is an independently folding domain. This first required the development of our own data processing program for generating quantitative and interpretable data from our SHAPE experiments, due to limitations of existing programs and modifications to the experimental protocol. In another study, we used SHAPE chemistry to study the in vitro transcript of the RNA genome of satellite tobacco mosaic virus (STMV). This involved incorporating the SHAPE data into a secondary structure prediction program. The SHAPE-directed secondary structure of the STMV RNA was highly extended and considerably different from that proposed for the RNA in the intact virion. Finally, analyzing SHAPE data requires navigating a complex data processing pipeline. We review some of the various ways of running a SHAPE experiment, and how this affects the approach to data analysis.

Le diabète de type-2 et le syndrome métabolique sont associés à une augmentation du stress oxydant et du risque cardiovasculaire. L'hyperactivation plaquettaire et les dyslipoprotéinémies sont deux causes majeures de l'athérothrombose. Nous avons montré que des lipoprotéines de basse densité (LDL) issues du plasma de diabétiques de type-2 activent les plaquettes sanguines. L'objectif principal de notre étude a été d'établir le profil en lipides et peroxydes lipidiques de LDL provenant de volontaires ayant un syndrome métabolique (SM), un diabète de type-1 (DT-1) ou de type-2 (DT-2), comparativement à celui de volontaires sains (V). Un autre objectif a été de déterminer leur impact sur l'activation plaquettaire. Seules les LDL des groupes SM et DT-2 ont des anomalies lipidiques telles que : augmentation des triacylglycérols, diminution des esters de cholestérol et de l'acide linoléique. Les LDL des groupes SM, DT-1 et DT-2 présentent un stress oxydant, démontré par l'augmentation des produits de peroxydation lipidique comme les acides gras hydroxylés et le dialdéhyde malonique, ainsi que par la diminution des plasmalogènes (sous-classe de phospholipides à éthanolamine). Comparativement aux plaquettes incubées avec les LDL de V, les plaquettes incubées avec les LDL des autres groupes sont activées comme le montre une exacerbation de la cascade de l'acide arachidonique (p38 MAPK, phospholipase A2 cytosolique, thromboxane A2). Ainsi, dans les états pré-diabétique et diabétique de type-2, les LDL subissent des modifications lipidiques et oxydatives, puis activent les plaquettes. Nos résultats suggèrent que les peroxydes lipidiques des LDL induisent l'hyperactivation plaquettaire.

La lectine de Helix pomatia (HPA), extraite de la glande à albumine de l'escargot de Bourgogne et spécifique du résidu GalNAc, appartient à une nouvelle famille de lectine dite de type H. Elle est utilisée depuis plus de vingt ans comme marqueur d'adénocarcinomes (notamment du sein, du colon, du poumon) à fort pouvoir métastatique et donc faible pronostic vital. Son utilisation comme outil de routine en oncologie est, cependant, fortement limitée par son impossibilité à la produire sous forme recombinante. Afin de contourner ces difficultés, des protéines homologues ont été recherchées chez d'autres invertébrés. Deux lectines de type H ont été identifiées chez l'amibe Dictyostelium discoideum (discoidines) et une chez le corail Sinularia lochmodes (SLL-2). Les discoidines sont composées de deux domaines distincts, un domaine C-terminal, spécifique des résidus galactosylés et homologue à HPA et un domaine N-terminal, dit domaine discoidine, de fonction inconnue. Ces travaux de thèse portent, dans un premier temps, sur la poursuite de la caractérisation structurale de la discoidine 1 puis sur la production du domaine N-terminal de la discoidine 2 afin de confirmer la fonction lectine supposée. Dans un second temps, des expériences de microscopie confocale ont montrés que les discoidines ne possédaient pas la capacité d'HPA dans la discrimination des cellules métastatiques par rapport aux non métastatiques. La construction, par mutagenèse, d'une protéine chimérique entre la discoidine 2, très facilement produite dans E. coli, et HPA a alors été entreprise, le but étant de lui apporter la même spécificité qu'HPA. Enfin, la protéine SSL-2 a été clonée et de nombreux essais d'expression sous forme soluble et de purification ont été réalisés en vue de sa caractérisation biochimique et structurale pour sa possibilité d'utilisation comme marqueurs en histopathologie

Les régions terminales (les télomères) des chromosomes de la plupart des organismes sont<br />essentielles au maintien de l'intégrité des chromosomes et sont impliquées dans la cancérogenèse et<br />le vieillissement cellulaire. Les télomères sont formés d'un brin riche en guanines et d'un brin<br />complémentaire riche en cytosines. In vitro, chaque brin s'organise en une structure repliée, le<br />quadruplexe de guanines pour l'un, le motif i pour l'autre, ce qui pose la question du rôle<br />biologique de ces structures. Plusieurs protéines s'associant au brin G et favorisant la formation de<br />quadruplexes de guanines sont connues. Deux protéines reconnaissant spécifiquement le brin C de<br />l'ADN télomérique humain viennent d'être identifiées (ASF/SF2 et hnRNP K).<br />Nous avons voulu contribuer à la compréhension des mécanismes de régulation des<br />télomères en recherchant une protéine se liant spécifiquement à une séquence d'ADN télomérique<br />riche en cytosines. Cette étude a été entreprise sur un organisme eucaryote, la levure<br />Saccharomyces cerevisiae.<br />Nous avons commencé par montrer que le fragment d'ADN télomérique de levure,<br />d[(CCCACA)3CCC], pouvait former un motif i in vitro. Nous avons observé par migration<br />électrophorétique non dénaturante, la formation d'un complexe ADN-protéine sur lequel nous<br />avons focalisé nos efforts. La masse moléculaire de cette protéine (~ 250 kDa) a été déterminée par<br />passage sur tamis moléculaire. L'association ADN-protéine a été observée pour une gamme de pH<br />allant de 6 à 8. Un duplexe d'ADN B d(CGCGATCGCG) ou une petite suite de cytosines d(CCC)<br />ne sont pas compétiteurs et le signal retardé est atténué de moitié pour un rapport monobrin<br />d(T14)/sonde de 4000. L'ADN d'E. coli, coupé en fragments de 10 à 1000 bases, est compétiteur<br />(50%) pour un rapport compétiteur/sonde égal à 1000. Mais toutes les séquences d'oligomères<br />testées formant in vitro un motif i monomérique (séquences comptant 4 répétitions de 2, 3, 4 ou 5<br />de désoxycytidines, dont des séquences télomériques ou centromériques naturelles), entrent en<br />compétition avec la séquence d[(CCCACA)3CCC], notamment dans des conditions (pH,<br />température, force ionique,..), où le motif i est observé in vitro.<br />Pour identifier les protéines impliquées dans l'association avec l'ADN télomérique, nous<br />avons utilisé des billes de streptavidine greffées ou non avec la séquence d'ADN. Nous avons<br />identifié les protéines liées à l'ADN par spectrométrie de masse MALDI-TOF et Q-TOF MS/MS. Il<br />s'agit de trois protéines Yhr216p, Ylr432p et Yml056p, dont les séquences sont très proches. Cette<br />identification a été confirmée par séquençage par dégradation d'Edman de peptides internes. Les<br />séquences de ces protéines sont similaires (~ 78 %) aux deux inosine 5'-monophosphate<br />déshydrogénases humaines (IMPDH 1 et 2 (masse de ~ 56 kDa)) connues pour leur implication<br />dans le métabolisme des purines. Celles-ci sont habituellement observées sous forme tétramérique<br />(masse > 200 kDa). Malgré la présence dans des extraits nucléaires humains HeLa d'une protéine<br />ayant des caractéristiques de migration natives identiques à celles observées chez la levure, et<br />différentes des protéines ASF/SF2 et hnRNP K déjà identifiées, nous avons montré que les<br />protéines IMPDH 1 et 2 purifiées ne sont pas capables de fixer seules l'ADN télomérique humain.<br />Nous montrons également que les protéines identifiées (Yhr216p, Ylr432p et Yml056p)<br />s'associent au brin complémentaire riche en G. Des migrations électrophorétiques en présence de<br />compétiteurs montrent que cette association est spécifique. A notre connaissance, il s'agit des<br />premières protéines de levures interagissant séparément avec chacun des deux brins télomériques<br />dans des conditions d'incubation où l'on observe la formation de quadruplexes de guanines et de<br />motif i.

Les transporteurs d'ADP/ATP (Ancp) et de phosphate inorganique (PiC) ainsi que la porine VDAC représentent les principaux maillons d'une machinerie de transport d'ADP, d'ATP et de phosphate inorganique à travers la double membrane mitochondrial. Actuellement, les connaissances relatives aux mécanismes moléculaires mis en jeu dans cette machinerie accusent un retard. L'objectif de ce projet de Thèse a été d'amener de nouveaux éléments sur l'état conformationnel de ces protéines étudiées dans la levure Saccharomyces cerevisiae, modèle biologique où la génétique est facilitée. La majeure partie de ce projet a concerné l'Ancp de levure qui assure l'échange d'ADP cytosolique contre de l'ATP matriciel néosynthétisé suite aux processus de phosphorylation oxydative. Il peut être inhibé spécifiquement par deux poisons naturels, le carboxyatractyloside (CATR) et l'acide bongkrékique (BA) qui stabilisent la protéine dans deux états conformationnels distincts adoptés lors du mécanisme de transport. Afin de mieux comprendre cette dynamique, une étude comparative des deux conformères a été réalisée en combinant l'échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse (HDX-MS) aux outils biochimiques directement liés à l'étude des Ancp. Les résultats obtenus corrèlent l'hypothèse d'une structure malléable du transporteur dans laquelle des changements conformationnels importants interviennent. D'autre part, ce projet a permis d'obtenir les premières données d'accessibilité au solvant du PiC. Enfin, l'étude en HDX-MS de VDAC, nous a permis de montrer que son accessibilité au solvant en solution de détergent était en accord avec les données structurales publiées récemment.

Des mutants issus de l'instabilité génétique chez Streptomyces ambofaciens appelés Pig-pap ont été caractérisés. L'analyse du chromosome de la souche 29C1 a révélé un nouveau type de réarrangement associé à la production d'un pigment vert. Les mutants Pig-pap dépigmentés et non sporulants sont issus de papilles sur les colonies. L'introduction du gène whiG codant un facteur sigma permet le retour à la sporulation et à la pigmentation. Ce gène n'est pas muté et est transcrit chez ces mutants. Le gène whiH dont la transcription dépend de WhiG n'est pas transcrit. WhiG ne serait pas fonctionnel et une modification post-transcriptionnelle de whiG aboutirait au phénotype Pig-pap. L'analyse de mutants issus d'un transconjugant a montré que le transgène whiG constitue une cible mutationnelle. De plus, la production de ces mutants est augmentée lors d'une carence en acides aminés et un mutant relA ne produit pas de papille, impliquant la réponse stringente dans ce phénomène.

La Quinolinate synthase (NadA) catalyse la condensation de l'iminoaspartate et de la dihydroxyacétone phosphate aboutissant à la formation d'acide quinolinique, un intermédiaire central dans la biosynthèse du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD). Cette étude a permis de montrer que toutes les quinolinate synthases possèdent un centre [4Fe-4S] essentiel à l'activité et que seulement 3 résidus cystéines coordinent le centre métallique, les cystéines Cys113, Cys200 et Cys297 chez E. coli. Les propriétés spectroscopiques et biochimiques du centre [4Fe-4S] nous ont conduit à proposer que le centre fer-soufre joue un rôle de type aconitase/déshydratase dans la catalyse enzymatique. Deux autres cystéines impliquées dans la formation d'un pont disulfure, sont également essentielles à l'activité quinolinate synthase (Cys291 et Cys294 chez E. coli) en jouant probablement un rôle régulateur. Nous rapportons également une nouvelle hypothèse de mécanisme pour la formation de l'acide quinolinique, incluant l'isomérisation du glycéraldéhyde 3-phosphate en DHAP. Enfin, nous proposons NadA comme une cible potentielle d'agents antibactériens. Sur les différentes molécules testées in vitro, l'acide phosphoglycolohydroxamique (PGH) s'est avérée actif sur la quinolinate synthase d'E. coli et de M. tuberculosis, en agissant comme un inhibiteur compétitif du DHAP.

Les acides dicarboxyliques (DCA) sont des composés de base pour la production de polymères, plastiques, lubrifiants, antibiotiques et parfums. Bien que de grand intérêt, les DCA qui comportent une chaîne aliphatique supérieure à douze atomes de carbone sont difficilement synthétisables par la voie chimique. L'objet de cette étude est de développer un procédé biotechnologique pour produire ces composés par bioconversion de matières premières renouvelables (huile de tournesol oléique) via la levure Yarrowia lipolytica. <br />Chez les souches sauvages, les acides gras sont principalement dégradés par la voie de la Β-oxydation. Nous avons bloqué la première étape de la Β-oxydation par disruption séquentielle des six gènes codant les acyl-CoA oxydases permettant ainsi de réorienter le flux d'acides gras vers l'ω-oxydation qui conduit à la production de DCA. L'amélioration de la production des DCA a été obtenue par l'augmentation de l'activité d'hydroxylation, impliquée dans l'ω-oxydation, en surexprimant les gènes codant la NADPH cytochrome P450 réductase et les 12 cytochromes P450. Néanmoins, la moitié du substrat s'accumule dans les corps lipidiques. Ce stockage a été réduit, par disruption de gènes, entraînant ainsi une augmentation du rendement de bioconversion.<br />Enfin, l'étude de mutants d'insertion a révélé l'implication de 5 ABC transporteurs PDR qui confèrent la résistance aux drogues. L'étude fonctionnelle de cette famille a démontré que le transporteur Abc1p serait un exporteur membranaire spécifique des alcanes à longue chaîne carbonée, constituant le premier ABC transporteur PDR responsable de l'export de molécules physiologiques. <br /> Ces travaux ont permis de développer une souche améliorée de Y. lipolytica pour la production de DCA à partir d'huiles végétales.

Depuis leur commercialisation en 1996, les surfaces de cultures de plantes transgéniques Bt ont considérablement augmentées, représentant en 2007 près de 42 millions d'hectares. Ces plantes produisent en continu une protéine insecticide (issue de Bacillus thuringiensis) leur permettant de lutter contre les insectes ravageurs tels que la pyrale du maïs. La toxine est introduite dans les sols par exsudation racinaire et dégradation des tissus végétaux. Les interactions de la toxine avec les particules de sol peuvent modifier sa mobilité, sa biodisponibilité, sa persistance et sa toxicité. Il est donc important d'étudier le rôle du sol dans le devenir de cette toxine. Ce travail de thèse a permis de mieux comprendre les interactions physicochimiques entre la toxine et les composantes du sol et en particulier avec les argiles, surfaces très réactives. L'adsorption de la toxine sur les argiles est une interaction de faible affinité, fortement dépendante du pH et difficilement réversible. La différence de quantité maximale de toxine adsorbée sur la montmorillonite et sur la kaolinite était fortement liée à leurs surfaces spécifiques respectives, plutôt qu'à leur charge de surface spécifique. Une analyse de la mobilité de la toxine à l'état adsorbé sur la montmorillonite par Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) a montré que cette protéine est immobilisée par son adsorption sur l'argile. Ces résultats suggèrent que le risque de transfert de la toxine dans le sol se limite aux transports facilités par les colloïdes et aux processus de bioturbation. Par ailleurs, des études de persistance de la toxine dans le sol ont montré que plus de 50 % de l'immuno-réactivité de la toxine est perdue en moins d'une semaine. Les processus biotiques (dégradations microbiennes) semblent peu impliqués dans ce phénomène. Il semblerait que la toxine ne soit pas dégradée mais plutôt inactivée par des changements de conformations suite à son interaction avec les composants du sol. Les processus abiotiques (interactions physicochimiques) sont donc fortement impliqués dans la persistance de la toxine dans le sol, avec une contribution significative des interactions hydrophobes. Dans ce travail de thèse, un effort important a été consacré à l'élaboration d'une méthode de détection in situ de la toxine dans le sol. Deux stratégies ont été envisagées, basées à la fois sur la spectroscopie de fluorescence et l'immunologie, mettant en jeu la reconnaissance soit de deux épitopes de la toxine par deux anticorps marqués (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET), soit la reconnaissance d'un épitope par un anticorps marqué après présaturation des surfaces (sites protéiques). Les résultats, encore préliminaires, sont encourageants et nécessitent d'être poursuivis.