Ce mémoire de thèse est divisé en deux chapitres, le premier aborde l'impact des osmolytes sur la dihydrofolate réductase (DHFR) et le second a pour objet l'étude structurale de pseudopeptides antimicrobiens en présence de modèles membranaires. Les osmolytes organiques sont de petites molécules accumulées dans les cellules et les tissus de nombreux organismes lors d'une contrainte hyperosmotique pour maintenir le volume cellulaire. Ces solutés ont également un rôle essentiel dans la sauvegarde de l'intégrité cellulaire et dans la stabilisation des macromolécules contre l'effet de divers stress environnementaux. Les osmolytes peuvent néanmoins induire une inhibition significative des enzymes et les bases moléculaires de leurs effets sur les propriétés des protéines sont au centre de nombreuses études. Nous avons étudié la DHFR, une enzyme clé du métabolisme, en présence de divers solutés. Après avoir vérifié que les osmolytes ne modifiaient pas la structure globale de la DHFR, nous avons montré qu'ils étaient capables de stabiliser la structure et d'inhiber l'activité de cette enzyme. L'inhibition de la DHFR est liée à la diminution de la vitesse de sortie (koff) du produit, que nous avons mesurée en présence d'osmolytes. L'étude de la dynamique interne de la DHFR, sur plusieurs échelles de temps apporte des réponses sur l'origine de l'inhibition de la DHFR en présence d'osmolytes. La seconde partie présente nos travaux sur la relation structure-activité de plusieurs peptides antimicrobiens. Ce projet s'inscrit dans la course au développement de nouvelles molécules actives pour palier la résistance croissante des pathogènes contre les antibiotiques conventionnels. Nous avons déterminé les structures et étudier le comportement de différents peptides et pseudopeptides en environnement membranaire modèle, micelles de SDS et phospholipides afin de proposer un mode d'action pour chacun d'eux.

L'entrée des cellules en mitose se caractérise par l'augmentation d'expression de la kinase Aurora A. Nous avons caractérisé l'effet du sn38, métabolite actif de l'irinotecan utilisé dans le traitement du cancer colorectal sur l'expression de cette kinase. En absence de traitement, le facteur de transcription c-myc se lie au promoteur d'Aurora A et l'active. Cependant, le traitement des cellules avec du sn38 induit l'inhibition de c-myc et son absence du promoteur d'Aurora A s'accompagnant de l'induction du processus de sénescence. Nous avons également étudié l'effet de l'oncogène Ras sur la kinase Aurora A. Cet oncogène induit une diminution d'expression d'Aurora A par une modulation de l'activité des cofacteurs transcriptionnels de c-myc. En résumé, nos résultats indiquent qu' Aurora A est une cible des traitements de chimiothérapie et des mécanismes de contrôles oncogéniques. Le blocage de son expression constitue certainement une protection contre le développement tumoral.

Ce travail cherche à apporter un éclairage sur les relations séquence-structure-fonction des alpha1,3/4-fucosyltransférases, avec un accent particulier sur les core alpha1,3-fucosyltransférases des plantes. La fucosylation de type Core alpha1,3 est une caractéristique des oligosaccharides N-liés des plantes et invertébrés, avec une fonction biologique qui n'est pas encore élucidée. L'activité Core alpha1,3-fucosyltransférase est responsable d'allergies alimentaires, au pollen, et aux insectes chez l'homme. Dans le cadre de ce travail sont présentés des résultats de caractérisation biochimique (effet de cations divalents sur l'activité, Km de substrat donneur), des expériences de troncation des différents domaines (ex: suppression du domaine C-terminal spécifique aux core alpha1,3-fucosyltransférases des plantes), et de mutagenèse dirigée, en utilisant comme protéine modèle, la core 1,3-fucosyltransferase A (FucTA) d'Arabidopsis thaliana qui a été exprimée sous forme recombinante chez Pichia pastoris. Ces expériences ont été dictées sur la base de nos résultats d'analyses bioinformatiques des séquences de alpha1,3/4-fucosyltransférases et de la modélisation par homologie du domaine de liaison au nucléotide-sucre de l'enzyme FucTA. La mutagenèse des résidus clé identifiés par cette approche a permis de confirmer l'importance de certains acides aminés dans le mécanisme catalytique. Enfin la protéine FucTA étant elle-même glycosylée quand elle est produite chez P. pastoris, nous avons étudié l'impact de cette glycosylation sur la production et l'activité de la protéine, par des expériences de mutagenèse, de Western blotting et de spectrométrie de masse.

Dans ce travail, nous avons étudié en détails l'interaction de l'histone H1 avec l'ADN nucléosomal afin de comprendre comment cette interaction conduit à l'organisation en fibre nucléosomale. Nous avons pu résoudre ce problème ancien par l'utilisation de : (i) l'incorporation de H1 par une chaperonne d'histone physiologique, NAP-1, (ii) la reconstitution de nucléosomes parfaitement homogènes sur une matrice d'ADN contenant la séquence 601 fortement positionnante, (iii) une combinaison de cryo-microscopie électronique (EC-M) et de technique d'empreinte aux radicaux OH°, (iv) une modélisation mécanique du polymère ADN de type « coarse-grain ». Notre « cartographie » par empreinte OH° de résolution d'un nucléotide montre que le domaine globulaire de H1 (GH1) interagit à travers le petit sillon avec des « patch » d'ADN de 10 pb de part et d'autre de la dyade du nucléosome. De plus, GH1 organise environ un tour d'hélice d'ADN de chaque ADN de liaison du nucléosome. En même temps, une suite de 7 acides aminés (120-127) de la partie COOH-terminale est requise pour la formation de la structure en tige de l'ADN de liaison.

La réponse au stress génotoxique met en jeu de nombreux facteurs cellulaires impliqués dans un réseau complexe de mécanismes visant à assurer le maintien de l'intégrité génétique de l'organisme. Ces mécanismes incluent la détection et la réparation des lésions de l'ADN, la régulation de la transcription et de la réplication et le déclenchement éventuel de la mort cellulaire. Parmi les protéines nucléaires participant à cette réponse, les protéines kin17 sont des protéines à doigt de zinc conservées au cours de l'évolution et activées par les ultraviolets (UV) et les radiations ionisantes (RI). Nous avons montré que la protéine kin17 humaine (HSAkin17) est présente dans la cellule sous une forme soluble et sous une forme ancrée aux structures nucléaires. Une fraction de la protéine HSAkin17 est directement associée à la chromatine. La protéine HSAkin17 est recrutée sur les structures nucléaires 24 heures après traitement par différents agents induisant des cassures double-brin de l'ADN (DSB) et/ou un blocage des fourches de réplication. Par ailleurs, la réduction du niveau total de protéine HSAkin17 sensibilise les cellules RKO aux RI. Nous présentons également des résultats impliquant la protéine HSAkin17 dans la réplication de l'ADN. Cette hypothèse a été confirmée par la démonstration biochimique de son appartenance au complexe de réplication. La protéine HSAkin17 pourrait donc assurer le lien entre réplication et réparation de l'ADN, un défaut de la voie HSAkin17 entraînant une augmentation de la radiosensibilité. Dans un deuxième temps, nous avons étudié les interactions entre deux mécanismes de réparation de l'ADN : la réparation par excision de nucléotides (NER) et la recombinaison non homologue (NHEJ). Le NER prend en charge une grande variété de lésions provoquant une distortion de la double hélice d'ADN dont les dimères de pyrimidines induits par les UV. Le NHEJ assure la réparation des DSB par jonction directe des extrémités d'ADN. Nous avons utilisé un modèle syngénique de défaut de la réparation basé sur l'interférence ARN développé au laboratoire. En effet, les vecteurs dérivés du virus d'Epstein-Barr (pEBV) permettent l'expression à long terme de siRNA et l'extinction spécifique du gène cible. La réduction de l'expression de gènes impliqués dans le NER (XPA et XPC) ou le NHEJ (DNA-PKcs et XRCC4) entraîne les phénotypes attendus. Nous avons montré que la réduction du niveau de protéine XPC sensibilise les cellules HeLa à l'étoposide, un inhibiteur de la topoisomérase II qui induit des DBS, et affecte leur activité NHEJ in vitro. Ces résultats suggèrent que la protéine XPC pourrait être requise pour la réparation de certains types de cassures ou participer à un système global de régulation de la réponse cellulaire aux lésions de l'ADN. Notre modèle ouvre donc des perspectives intéressantes pour l'étude des relations entre les différentes voies de réparation de l'ADN dans des cellules humaines.

La Dystrophie Myotonique de type I (DM1) est une maladie génétique à transmission autosomique dominante. Elle est due à une expansion pathologique de triplets CTG au sein de la région 3'UTR du gène DMPK. Les individus atteints de DM1 souffrent d'une atteinte multi-systémique, qui se caractérise, sur le plan moléculaire, par une altération de l'épissage alternatif de plusieurs transcrits privilégiant l'expression d'isoformes foetales. L'hypothèse physiopathologique majeure de la DM1 repose sur un gain de fonction toxique des ARNm mutés conduisant à des altérations de facteurs régulateurs d'épissage des familles Mbnl et CELF. Dans le cerveau de patients atteints de DM1, un défaut d'épissage alternatif du transcrit de Tau conduit à la surexpression de l'isoforme foetale avec, notamment, une exclusion préférentielle des exons 2 et 3. Ce défaut s'accompagne d'une agrégation de la protéine, signe d'une dégénérescence neuronale. Ainsi, le premier objectif de ce travail a été de mieux connaître les mécanismes moléculaires responsables du phénotype d'épissage pathologique de Tau dans la DM1. Nous nous sommes également intéressés au transcrit de la Troponine T cardiaque (cTNT), transcrit exprimé dans le coeur et dont l'altération d'épissage avec la DM1 conduit à un profil d'épissage de type foetal. Concernant Tau, nos résultats montrent que le profil d'épissage foetal., et en particulier, l'exclusion des exons 2 et 3, est un phénotype qui peut être obtenu par différentes voies moléculaires impliquant différents éléments cis régulateurs. Dans la DM1, ce phénotype résulte d'un mécanisme bien spécifique. Pour l'exon 2, celui-ci semble impliquer un « silencer » intronique situé dans une région relativement loin en aval de l'exon. Cette même région semble également médier l'effet du facteur d'épissage ETR-3, facteur appartenant à la famille CELF et qui favorise l'exclusion des exons 2 et 3. Pour ce qui est de la régulation de l'exon 5 de cTNT, celle-ci met en cause plusieurs éléments cis régulateurs, tous localisés dans les 150 nucléotides introniques encadrant l'exon. Parmi ces éléments, on identifie un « silencer » et un « enhancer » en amont de l'exon et deux « enhancers » en aval. Nos résultats montrent qu'une région intronique en amont est indispensable à l'effet des expansions de CTG. De plus, dans cette région, nous avons identifié de nouveaux sites fonctionnels de fixation du facteur d'épissage Mbnl1 par rapport à ceux décrits dans la littérature. En conclusion, nos travaux mettent en évidence plusieurs éléments cis régulateurs d'épissage alternatif de Tau et cTNT. Pour ces transcrits, les régions introniques en jeu dans l'effet des expansions de triplets CTG le sont également dans l'effet des facteurs Mbnl ou CELF. Ces résultats confortent l'hypothèse physiopathologique des mécanismes de dérégulation de l'épissage alternatif dans la DM1. Ils montrent également la spécificité des mécanismes mis en jeu dans la pathologie, fournissant ainsi des cibles thérapeutiques

Deux échelles d'observations sont traditionnellement utilisées pour étudier le métabolisme des microorganismes: d'une part, à l'échelle locale, la caractérisation individuelle des réactions ayant lieu dans la cellule et d'autre part, à l'échelle globale, l'étude de la physiologie de la cellule. Ces deux échelles ont bénéficié de progrès technologiques récents : l'analyse des génomes séquencés permet d'identifier une large fraction des enzymes catalysant les réactions ; la physiologie des microorganismes peut être étudiée à haut débit pour de nombreux environnements et perturbations génétiques. Cependant, l'exploitation conjointe de ces deux échelles demeure complexe car le comportement physiologique global de la cellule résulte de l'action coordonnée de nombreuses réactions. Les approches de modélisation mathématique ont toutefois récemment permis de relier ces deux échelles à l'aide de modèles globaux du métabolisme. <br />Dans cette thèse, nous explorerons l'utilisation de ces modèles pour compléter la connaissance des réactions à l'aide d'une catégorie particulière de données d'échelle globale : les essentialités de gènes déterminées en observant les phénotypes de croissance de mutants de délétion. Nous nous appuierons pour cela sur la bactérie Acinetobacter baylyi ADP1 pour laquelle une collection complète de mutants de délétion a été récemment constituée au Genoscope. <br />Après avoir présenté les étapes clés et les développements que nous avons effectués pour reconstruire un modèle global du métabolisme d'A. baylyi, nous montrerons que la confrontation entre phénotypes observés et phénotypes prédits permet de mettre en évidence des incohérences entre les deux échelles d'observations. Nous montrerons ensuite qu'une interprétation formelle de ces incohérences permet de corriger le modèle et d'améliorer la connaissance du métabolisme. Nous illustrerons ce propos en présentant les corrections que nous avons réalisées à l'aide des phénotypes de mutants d'A. baylyi. Enfin, dans une dernière partie, nous proposerons une méthode permettant d'automatiser la correction des incohérences causées par des erreurs d'association entre gènes et réactions.

Les télomères sont des structures nucléoprotéiques particulières conférant une stabilité aux extrémités de chromosomes. La plupart des mécanismes télomériques sont conservée chez les eucaryotes supérieurs notamment chez l'homme. Parmi les fonctions exercées, les télomères développent des stratégies visant à limiter la recombinaison impropre aux télomères afin de préserver l'intégrité chromosomique. Au cours de ma thèse, j'ai étudié les mécanismes de maintenance et de protection des télomères chez l'homme, et plus particulièrement le rôle de la recombinaison homologue et recombinaison illégitime. Je me suis plus particulièrement intéressé au rôle de P53 dans le maintien des télomères, à travers sa fonction dans la recombinaison. Bien que son rôle soit établi dans la maintenance des télomères des cellules ALT, sa fonction est en revanche moins bien décrite dans les cellules présentant une activité télomérase. Dans cette perspective, nous avons établi des clones télomèrase (+) exprimant de manière stable le transgène P53R175H, décrit comme stimulant la RH. Cependant, la surexpression de P53R175H ne modifie pas le profil télomérique des ces cellules, se révélant ainsi incapable de stimuler la recombinaison télomérique. L'absence de phénotype pourrait être en fait la conséquence d'une interférence de la télomérase dans la mise en place d'un processus de recombinaison télomérique. Le deuxième volet de notre étude nous amené à préciser le rôle la recombinaison dans le maintien des télomères. Pour cela, nous avons construit des lignées isogéniques invalidées pour les deux voies majeures de la recombinaison grâce à une nouvelle famille de vecteurs ARNi basée sur des vecteurs EBV (brevet CEA N° 0501483) développé par Biard D. Ce système permet d'obtenir une réduction importante, spécifique et à long terme (plus de 300 jours en culture) de l'expression d'un gène cible. Plusieurs partenaires du NHEJ (DNA-PKcs, XRCC4, LigIV, Ku70), ou de la RH (RAD54, RAD51, RAD52) ou du complexe MRN ont été inhibés dans la lignée HeLa (adénocarcinome cervical). Dès les premiers jours d'invalidation du gène cible, des altérations de la stabilité des télomères sont constatées. Ces altérations se maintiennent au cours de la sélection (de 100 à 300 jours selon les clones). Ainsi, il semble que l'invalidation du NHEJ conduise à une instabilité télomérique associée à un raccourcissement de la taille des télomères dans le cas de XRCC4 et LigaseIVKD. Malgré une instabilité télomérique prononcée, les cellules RHKD se distinguent pourtant des clones NHEJKD par des altérations télomériques particulières. En effet, la dérégulation du RH mène à des signaux hétérogènes au sein du même bras chromosomique. En revanche, les anomalies dites de structure (perte associée à des cassures) sont plus abondantes dans les cellules déficientes pour le NHEJ. Ces résultats suggèrent que le NHEJ jouerait un rôle de protection alors que le RH serait plutôt impliqué dans l'élongation et la réplication des télomères. Cette étude s'est poursuit avec l'examen de clones MRE11KD, RAD50KD, NBS1KD permettant de clarifier dans un premier temps le rôle de du complexe dans les différentes voies de recombinaison puis sur la maintenance des télomères. A l'image des autres protéines de la recombinaison, RAD50 préserverait l'intégrité télomérique. L'invalidation des protéines NBS1 et MRE11 initie une élongation des télomères, probable manifestation de l‘activation de la recombinaison télomérique, absente des cellules RAD50KD. Ainsi, la présence de cercles télomériques extrachromosomiques dans le clone NBS1KD vient étayer cettehypothèse. Le complexe MRE11/RAD50/NBS1 constituerait alors un répresseur de la RH aux télomères.

Comprendre les modes d'interaction des rayonnements ionisants avec la matière vivante, notamment lors de l'exposition à de faibles doses telles que celles que l'on peut trouver dans un environnement industriel ou dans la nature, reste un enjeu majeur pour l'évaluation du risque associé. Il s'agit d'un problème de société qui n'a pu malheureusement trouver de réponse dans les études épidémiologiques classiques dans la mesure où les quelques données fiables concernent plutôt des expositions accidentelles à des doses beaucoup plus élevées. L'exposition naturelle représente pourtant la première source dans la vie courante juste devant les sources d'origines médicales (radiologie, radiothérapie). Ce type d'exposition est très difficile à reproduire en laboratoire sur des lignées cellulaires. La méthode principalement utilisée, basée sur l'irradiation aléatoire de populations cellulaires, consiste à calculer le nombre moyen de particules ayant interagi par cellule et repose ainsi sur des lois de distribution statistique (loi de Poisson). En plus des inévitables impacts multiples, la variété des cibles intracellulaires touchées (noyau, cytoplasme), les effets indirects induits par les impacts sur les cellules voisines ou simplement extracellulaires sont autant de phénomènes qui compliquent alors sérieusement l'interprétation des données.<br /><br />Dans ce contexte, un microfaisceau de particules  a été développé au CENBG pour réaliser des irradiations ciblées à l'échelle sub-cellulaire avec une précision de quelques micromètres. Il est ainsi possible de contrôler le nombre exact de particules délivrées par cellule (jusqu'à la dose ultime d'un ion par cellule), de prédéterminer avec précision le point d'impact et d'irradier certaines cellules tout en vérifiant la réponse de cellules voisines.<br /><br />La validation de ce dispositif a été réalisée au cours de ce travail de thèse, sur des kératinocytes humains exprimant une protéine recombinante nucléaire fluorescente (histone H2B-GFP) en mettant en évidence des dommages nucléaires radio-induits spécifiques et dose-dépendant. La combinaison de techniques telles que le microfaisceau d'ions, la microscopie confocale et l'analyse quantitative numérique a permis de mesurer, in situ et à l'échelle de la cellule unique, la cinétique de phosphorylation de la protéine histone H2A.X et d'aborder ainsi l'étude des processus de réparation de l'ADN et d'induction de l'apoptose. Les résultats expérimentaux ont validé la méthodologie développée en démontrant la reproductibilité du tir et le contrôle de la dose grâce à la mise en évidence d'une relation dose-effet qui a été également étudiée en fonction du temps.

Les biocapteurs ampérométriques décrits dans ce travail sont basés sur l'immobilisation d'enzymes oxydo-réductases dans un polymère conducteur déposé à la surface des électrodes. Les performances des biocapteurs sont conditionnées par la méthode d'immobilisation mise en œuvre ainsi que les caractéristiques de la matrice qui en résulte. Une technique de polymérisation électrochimique a été utilisée pour fixer l'enzyme dans un dérivé du polythiophène, le poly(3,4 éthylènedioxythiophène) (PEDT). Les potentialités de cette technique ont été démontrées pour deux enzymes différentes : la glucose oxydase et la polyphénol oxydase. L'optimisation des paramètres opérationnels a été conduite d'abord en système batch, puis étendue au système d'analyse en flux continu (FIA). Ce système biocapteur-FIA est très adapté pour des mesures en continu de glucose dans les échantillons biologiques. La sélectivité de ce biocapteur en présence de composés interférents a été améliorée par la platinisation de l'électrode, qui rehausse la réponse au glucose, ou l'utilisation des médiateurs rédox. Un biocapteur à polyphénol oxydase exploitant l'amplification enzymatique mise en jeu a permis la détection des polluants phénoliques jusqu'à 50nM.