Pseudomonas aeruginosa et Yersinia pestis sont responsables d'infections graves chez les individus immunodéprimés et de la peste, respectivement. Leur pathogénicité repose sur de nombreux facteurs de virulence dont le système de sécrétion de type III (SST3) qui a une action prépondérante lors d'infections aiguës. Le SST3 est composé d'une base ancrée dans la double membrane bactérienne, d'une aiguille creuse érigée à la surface et d'un pore de translocation inséré dans la membrane de la cellule hôte permettant à la bactérie d'y injecter des toxines. L'objet de cette thèse est l'étude de l'interactome de l'antigène protecteur V, PcrV chez P. aeruginosa et LcrV chez Y. pestis. Celui-ci est situé au sommet de l'aiguille et est nécessaire au processus de translocation des toxines. L'étude des propriétés biochimiques de la protéine in vitro nous a permis de mettre en évidence sa capacité à former des oligomères présentant une structure en forme d'anneaux. Les multimères ont été observés par chromatographie d'exclusion de taille, gel natif, spectrométrie de masse native et MET. Leur formation est dépendante de la présence de l'hélice α12 C terminale de PcrV et de l'intégrité de ses résidus hydrophobes. Le processus d'assemblage de la protéine est nécessaire à sa fonction in vivo : des mutants qui sont incapables d'oligomériser perdent leur cytotoxicité envers les cellules eucaryotes. <br />Puis, l'interaction directe entre PcrV et la sous unité formant l'aiguille, PscF, a été mise en évidence in vitro par co-purification. De plus, deux mutants ponctuels de PscF dont le phénotype présente un défaut de translocation se sont montrés défectueux pour la liaison avec PcrV. Enfin, l'hélice C terminale de PscF est échangeable avec l'hélice α12 C terminale de PcrV comme l'atteste la capacité de polymérisation d'un hybride créé entre ces deux protéines, suggérant un rôle de celle-ci dans la formation du complexe F-V. L'ensemble de ces études montre que l'assemblage multimérique des antigènes V ainsi que leur position au sommet de l'aiguille sont des éléments essentiels à leur fonction, avec un rôle prépondérant de l'hélice α12 C terminale de PcrV. Ces conclusions pourraient permettre de mieux cibler les développements futurs de nouveaux vaccins ou agents antimicrobiens.

Cette thèse propose une nouvelle approche de découverte de signatures de familles de protéines. Etant donné un échantillon (non-aligné) de séquences appartenant à une famille structurelle ou fonctionnelle de protéines, cette approche infère des automates fini s non déterministes (NFA) caractérisant la famille.<br>Un nouveau type d'alignement multiple nommé PLMA est introduit afin de mettre en valeur les similarités partielles et locales significativement similaires. A partir de ces informations, les modèles de type NFA sont produits par un procédé relevant du domaine de l'inférence grammaticale. Les modèles NFA, présentés ici sous le nom de Protomates, sont des modèles graphiques discrets de forte expressivité, ce qui les distingue des modèles statistiques de type profils HMM ou des motifs de type Prosite.<br>Les expériences menées sur différentes familles biologiques dont les MIP et les TNF, montrent un succès sur des données réelles.

L'éventail thérapeutique utilisé en chimiothérapie antitumorale fait appel à des molécules ayant un indice thérapeutique limité dû à leur faible sélectivité d'action. C'est pourquoi nous développons au laboratoire de nouvelles approches pour guider la conception d'agents antitumoraux plus sélectifs. Cette approche s'intègre dans un design rationnel de ligands de l'ADN qui inhibent l'activité de liaison à l'ADN de facteurs de transcription afin de réguler l'expression de certains gènes.<br />Les dérivés DB, retenus pour cette étude, sont des molécules synthétisées par les Prs David Boykin et David Wilson (Atlanta) qui se fixent sur des séquences spécifiques dans le petit sillon de l'ADN. Ainsi, le composé diphényl-furane DB75 se lie en monomère à des séquences riches en paires de bases AT, alors que le dérivé phényl-furane-benzimidazole DB293 reconnaît la séquence 5'-ATGA en dimère. Cette reconnaissance «séquence-spécifique» pourrait cibler spécifiquement des interactions ADN-facteurs de transcription impliquées dans la régulation des gènes et la prolifération cellulaire.<br />Dans cette optique notre travail a été de déterminer la spécificité d'interaction à l'ADN de nouvelles molécules et d'en évaluer leur distribution cellulaire afin de pouvoir, dans un second temps, étudier la modulation de la liaison à l'ADN de facteur de transcription après fixation des dérivés.<br />Ainsi, nous nous sommes tout d'abord intéressés à la distribution cellulaire des composés DB dérivant du DB75 et du DB293 afin de déterminer s'ils pénètrent efficacement dans la cellule et se dirigent vers l'ADN nucléaire. Les résultats obtenus valident ceux publiés précédemment (Lansiaux et al., 2002a, 2002b) et montrent le faible impact des modifications du corps polycyclique sur la distribution des composés DB. Ainsi, les composés diphényl-furanes substitués sur le cycle furane, pénètrent efficacement dans le noyau alors que seules certaines substitutions sur les groupements phényles empêchent la molécule de pénétrer dans le noyau. Les conséquences cellulaires sont surprenantes puisque ces derniers composés présentent une très bonne cytotoxicité. Dans un second temps, nous avons étudié la spécificité et l'affinité de ces dérivés pour l'ADN. Nous avons ainsi découvert de nouveaux ligands des sites riches en paires de bases AT et des séquences ATGA qui ont permis de compléter nos connaissances des relations structure/affinité de ces composés.<br />Afin de déterminer si cette famille de ligands peut moduler sélectivement l'activité de liaison à l'ADN de facteurs de transcription, un criblage en mode compétitif de l'activité de 54 facteurs de transcription a été réalisé avec le DB293. Pour cela nous avons utilisé une approche innovante basée sur le principe des macroarrays : les membranes Transignal/Protein/DNA array I. Nous avons mis en évidence l'inhibition de la fixation de Pit-1 et Brn-3, deux facteurs de transcription à domaine POU dont les sites consensus contiennent un site riche en paires de bases AT et la séquence 5'-ATGA. Cependant, la seule présence d'un site 5'-ATGA ne prévient pas l'inhibition de l'activité de liaison à l'ADN par le DB293 puisque le facteur de transcription IRF-1 présentant aussi un site 5'-ATGA dans son site consensus n'est pas inhibé par le DB293. Nous avons montré que le DB293 interagit en dimère aux séquences 5'-ATGA des sites consensus Brn-3 et Pit-1 mais pas sur celui de IRF-1.<br />En parallèle, un ciblage de facteurs de transcription associés de manière privilégiée à un cancer donné et se liant au même type de séquence que les composés DB a orienté notre étude sur le complexe de transcription PBX/HoxA9. Ce complexe protéique se lie à une séquence nucléotidique à la fois riche en paire de base AT et contenant un site ATGA. Les membres de ce complexe sont sur-exprimés ou transloqués dans bon nombre de leucémies aiguës myéloïdes, lymphoïdes ou de syndromes myéloprolifératifs. Des tests d'interaction protéine/ADN nous ont permis de sélectionner des composés empêchant la fixation de HoxA9 sur sa séquence ADN cible. Les premiers résultats prometteurs dans la cellule montrent une toxicité induite par nos dérivés sur des cellules dont la prolifération est dépendante de l'activité de HoxA9 alors que cette toxicité est moindre dans des cellules n'exprimant pas HoxA9. Des tests clonogéniques effectués sur des cellules de moelle osseuse transformées par HoxA9 montrent un effet antiprolifératif du composé sélectionné qui est plus important sur les progéniteurs les moins engagés dans les voies de différentiation hématopoïétique.<br /><br />De plus, le criblage de nouvelles séries de molécules dicationiques a permis d'identifier 3 nouveaux composés, les dérivés DB1255, DB1242 et RT-29 qui se lient à des séquences originales riches en paires de base GC. Il s'avère que le composé DB1255 inhibe efficacement la fixation du facteur de transcription Erg sur son site consensus EBS.<br /><br />Cette étude montre pour la première fois l'inhibition de la fixation de facteurs de transcription par les composés DB et ouvre ainsi de nombreuses pistes prometteuses dans l'inhibition spécifiques de facteurs de transcription impliquées dans des processus de tumorogenèse.

Le bon fonctionnement de notre organisme repose sur de nombreux réseaux de communication intercellulaires (neurotransmetteurs, hormones, facteurs de croissance, lymphokines, molécules d'adhésion, etc.) prolongés par les voies de signalisation intracellulaires. Les signaux moléculaires sont des ligands reconnus par des récepteurs exprimés à la surface des cellules cibles. La fixation du ligand à son récepteur déclenche des voies de signalisation intracellulaires qui commandent la réponse fonctionnelle. Mes travaux scientifiques m'ont conduit à étudier diverses voies de signalisation intracellulaires qui seront évoquées dans cette HDR avec une emphase particulière sur les études les plus récentes.<br />Les cellules de la réponse immune cellulaire, les lymphocytes T, reconnaissent leur antigène spécifique à l'aide d'un récepteur multi-protéique, le complexe TCR/CD3. Le contrôle de son expression de surface est essentiel car le nombre de récepteurs stimulés par l'antigène et la durée de cette interaction déterminent la réponse fonctionnelle. Au cours de ma thèse au Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy, j'ai participé à l'étude des mécanismes qui contrôlent l'expression de surface du récepteur et son internalisation suite à l'interaction avec l'antigène. Ces travaux ont permis 1) de corroborer que l'expression de surface du complexe TCR/CD3 est dépendante de l'assemblage complet de toutes les sous-unités qui le composent, 2) et surtout d'aborder le lien entre voies de signalisation associées au complexe TCR/CD3 et son internalisation stimulées par la liaison d'un ligand spécifique.<br />Le récepteur aux poly-immunoglobulines (pIgR) exprimé à la surface des cellules épithéliales qui tapissent la cavité interne de nos organes transcytose les anticorps sécrétés dans le milieu basal vers le lumen. Ainsi, ce récepteur approvisionne-t-il continuellement les sécrétions mucosales en anticorps (pIgA et pIgM). La forte augmentation de la quantité d'anticorps produits en réponse à une infection nécessite un transport accru de ces anticorps vers les surfaces mucosales à protéger. Pendant mon stage post-doctoral à UCSF (University of California, San Francisco) j'ai contribué 1) à montrer que la liaison des pIgA au pIgR stimulait une voie de signalisation, 2) à décrire au niveau moléculaire le fonctionnement de cette voie de signalisation, 3) à montrer in vivo que cette voie de signalisation stimule fortement la transcytose des pIgAs.<br />Les épithéliums représentent une barrière à la pénétration d'agents pathogènes mais également une surface d'échange avec le milieu extérieur. Pour accomplir leurs fonctions les cellules épithéliales maintiennent un phénotype polarisé avec un coté orienté vers les tissus sous-jacents (pôle basal) et un autre tourné vers le milieu extérieur (pôle apical). Ces cellules doivent établir entre elles des contacts physiques pour maintenir la cohésion de l'ensemble du tissu qu'elles constituent. Les contacts cellulaires sont assurés par des molécules d'adhésion (E-cadhérine) qui se comportent comme des récepteurs couplés à des voies de signalisation transduisant notamment des signaux qui participent au maintien de la polarité épithéliale. Depuis mon arrivée à l'IPMC (Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire), j'ai mis au jour une nouvelle voie de signalisation associée aux molécules de E-cadhérine qui comprend un facteur d'échange (EFA6) et son substrat la petite protéine G Arf6. Cette voie de régulation contrôle notamment la mise en place de la structure moléculaire, appelée jonction étroite, qui régule les échanges paracellulaires de l'épithélium et contribue à la polarité épithéliale. EFA6, connecté à deux voies de signalisation qui agissent de façon coordonnée, participe à l'organisation du cytosquelette d'actine qui soutient la jonction étroite. Par ailleurs, nous avons trouvé que le niveau d'expression d'EFA6 est étroitement régulé pendant le développement de la polarité. Cette régulation post-traductionnelle est assurée par la machinerie de dégradation cytosolique appelée système ubiquitine-protéasome. Nous avons identifié certains acteurs de cette voie de régulation et commencé de montrer son importance pour le développement et le maintien de la polarité épithéliale. Les résultats les plus récents pointent vers un rôle de ces protéines dans les cancers épithéliaux qui se caractérisent toujours par une perte de la polarité cellulaire.

La thyroperoxydase humaine (hTPO) est l'enzyme clé de la biosynthèse des hormones <br />thyroïdiennes, impliquées dans de nombreux processus biologiques. Cette hémo- <br />glycoprotéine membranaire de type I est exprimée à la surface apicale des thyrocytes où elle <br />exerce ses fonctions d'iodation de certains résidus de tyrosine de la thyroglobuline et de <br />couplage de ces iodotyrosines pour former les hormones thyroïdiennes T3 et T4. <br />Lors de sa biosynthèse, la hTPO subit des modifications post-transcriptionnelles par <br />épissage alternatif du précurseur de l'ARNm. Trois isoformes de l'enzyme étaient connues : <br />la TPO1 (ADNc complet), la TPO2 et la TPO3 engendrées par épissage alternatif des exons <br />10 et 16 du précurseur de l'ARNm de la TPO. Dans cette thèse, nous avons identifié et <br />quantifié par PCR, cinq nouvelles isoformes toutes induites par des épissages alternatifs : la <br />TPO4 (sans exon 14), la TPO5 (sans exon 8), la TPO6 (sans exons 10, 12, 13, 14 et 16), la <br />TPO2/4 (sans exons 10 et 14), et la TPO2/3 (sans exons 10 et 16). Ces isoformes sont plus ou <br />moins stables, actives ou non et transportées correctement ou non jusqu'à la membrane <br />plasmique. <br />Nous avons également démontré, comme pour d'autres cas de pathologie cancéreuse, <br />l'augmentation des phénomènes d'épissage alternatif de la hTPO en association avec une <br />diminution globale du taux d'expression transcriptionnel de la protéine dans les différents <br />types de cancers thyroïdiens. <br />La hTPO subit également des modifications co- et post-traductionnelles. Elle interagit <br />en particulier avec les « protéines chaperons » du réticulum endoplasmique (RE), qui aident <br />les protéines nouvellement synthétisées à se replier correctement et font partie du “contrôle de <br />qualité” du RE. On sait que la hTPO est largement retenue au niveau du réticulum <br />endoplasmique et subissait un processus de dégradation faisant intervenir d'une part le <br />protéasome et d'autre part des protéases du RE. Le repliement correct de la hTPO nécessite <br />des interactions avec la calnexine (CNX) et la calreticuline. Dans cette thèse, nous montrons <br />que la co-surexpression de la CNX et de ERp57, impliquée dans la formation des ponts <br />disulfures des protéines interagissant avec la CNX, n'augmente pas la proportion des formes <br />correctement repliées, ce qui suggère l'implication d'autres protéines chaperons et/ou de <br />catalyseurs de repliement dans le processus de maturation de la hTPO. Nous montrons qu'à <br />l'inverse de la CNX, l'interaction avec une autre protéine chaperon appelée BiP, diminue le <br />repliement de la hTPO et entraîne la protéine vers la dégradation, suggérant ainsi que BiP <br />pourrait être un des senseurs de la dégradation de la hTPO. <br />Nous avons aussi montré que la thyroperoxydase purifiée à partir de thyroïde humaine <br />ou exprimée dans les CHO subit un clivage endoprotéolytique dans sa partie N-terminale. <br />L'enzyme impliquée dans ce clivage appartient vraisemblablement à la famille des protéines <br />convertases, endoprotéases impliquées dans la maturation de nombreux précurseurs de <br />pro-récepteurs et glycoprotéines de surface. A l'instar d'une autre protéine de la famille des <br />peroxydases, la myéloperoxydase humaine, la proséquence de la hTPO agit comme une <br />protéine chaperon interne en facilitant le repliement correct de la protéine. <br />Ces résultats éclairent davantage notre connaissance des mécanismes impliqués dans la <br />maturation de la hTPO et expliquent l'hétérogénéité de la TPO exprimée dans la thyroïde <br />humaine.

L'objectif de mon travail de doctorat était une caractérisation fonctionnelle des gènes TCTP et TSAP6. Ces gènes sont impliqués dans la réversion tumorale et forment un complexe protéique. <br />Tpt1, codant pour la protéine TCTP, est le gène le plus sous-exprimé lors de la réversion tumorale. L'analyse du cristal de TCTP humain montre une forte homologie entre ses hélices H2-H3 et les hélices H5-H6 de Bax. Grâce à ses hélices, TCTP inhibe l'apoptose induite par Bax au niveau des mitochondries. En effet, nous démontrons que TCTP, entre autres par le biais de ces hélices, empêche la dimérisation de Bax. <br />Nous avons aussi développé une lignée de souris TCTP knockout qui présentent une létalité embryonnaire précoce.<br />En parallèle, nous avons étudié TSAP6, qui encode pour une protéine à 6 domaines transmembranaires et qui est une cible transcriptionnelle directe de la p53. Nous avons établi une lignée murine TSAP6 knockout présentant une anémie microcytaire avec une splénomégalie. Les réticulocytes issus des souris knockout présentent un retard de maturation et une anomalie de sécrétion du Récepteur à la Transferrine par les exosomes. De manière plus générale, les résultats obtenus montrent, in vivo, que TSAP6 contrôle la sécrétion des exosomes induite par activation de la P53. Nous montrons aussi que la Sertraline et la Thioridazine empêchent la formation du complexe TSAP6-TCTP.

Une réponse antitumorale suite à l'induction de lymphocytes T cytotoxiques peut être générée après transfert in vitro ou directement in vivo d'ARNm d'antigènes tumoraux dans les cellules dendritiques (DCs). Cependant, peu de vecteurs permettent une introduction efficace d'ARNm dans les DCs. Nous avons élaboré des nanoparticules d'ARNm avec des polymères cationiques histidylés (polyplexes), des lipides cationiques histidylés (lipoplexes) ou un mélange des deux (lipopolyplexes). Ces vecteurs deviennent fusiogènes en milieu acide et favorisent la délivrance de l'ARNm dans le cytosol lors de son endocytose. Une optimisation de l'ARNm en ajoutant en 5' une coiffe 3'-O-méthyl-m75'GpppS'G (ARCA) et en 3' une queue de 100 adénosines (A 100) a permis la synthèse d'un transcrit ARCA-ARNm-A 100 qui permet une bonne expression de l'antigène dans les DCs. La polyéthylèneimine hisidylée a été identifiée comme étant un bon agent de transfert de l'ARNm de l'antigène du mélanome MART-1 dans les DCs matures in vitro. Pour une vaccination par injection directe de l'ARNm codant l'antigène, nous avons développé de nouvelles nanoparticules tripartites (lipopolyplexes) correspondant à des polyplexes d'ARNm ARCA-MART1-A100 avec un dérivé PEGylé de la polylysine histidylée encapsulés dans des liposomes histidylés. Par injection systémique, ces lipopolyplexes induisent un effet protecteur spécifique et significatif contre la progression tumorale cutanée et métastatique pulmonaire du mélanome murin B16F10. La mise en place d'une réponse immune de type Thl avec une forte sécrétion d'IFN-y et une activité T cytotoxique a pu être mise en évidence montrant ainsi l'intérêt des lipopolyplexes histidylés.

Les séquences satellites III (SATIII) représentent la majeure partie de l'hétérochromatine du<br />chromosome X de drosophile et jouent un rôle dans la variégation d'effet de position du gène<br />white dans l'inversion white-mottled. Leurs caractéristiques structurales dues à leur richesse en<br />dA•dT sont ciblées par des ligands synthétiques du petit sillon de l'ADN, outils qui ont permis de<br />caractériser la fonction des SATIII dans l'assemblage de l'hétérochromatine. Nous avons mis en<br />évidence un rôle de D1, qui reconnaît spécifiquement les SATIII, mais aussi de la topoïsomérase<br />II, dans l'initiation de l'assemblage de l'hétérochromatine. Nos résultats suggèrent que les<br />SATIII pourraient constituer un réservoir de protéines servant à la régulation de la transcription<br />du locus des gènes ribosomiques (rDNA) adjacent aux SATIII. Enfin, nous avons pu identifier un<br />élément frontière qui contrôle le cloisonnement de l'hétérochromatine et jouerait un rôle dans la régulation de l'expression du rDNA

Des génomes entiers de bactéries sont séquencés en nombre croissant. Parallèlement sont mis en place des programmes d'analyse systématique de l'expression des gènes et des protéines dans différentes conditions. La compréhension du fonctionnement d'un organisme nécessite une annotation des fonctions des gènes et l'intégration de ces données dans des schémas fonctionnels. Les voies métaboliques constituent une classe de fonctions permettant d'aborder ce problème d'intégration, elles sont bien répertoriées chez de nombreux organismes et sont accessibles à l'expérimentation.<br />Dans un premier temps, nous avons développé une méthode automatique de prédiction de fonction spécifique des enzymes. Cette méthode nommée PRIAM (PRofils pour l'Identification Automatique du Métabolisme) repose sur la nomenclature des enzymes et sur la construction automatique d'un jeu de profils spécifiques des fonctions enzymatiques. Puis, cette méthode permet d'identifier les enzymes dans un génome complet et de visualiser les résultats obtenus sur les graphes des voies métaboliques de la base de données KEGG. <br />Dans un second temps, cette méthode a été appliquée sur le génome de la bactérie fixatrice d'azote Sinorhizobium meliloti et nous a permis l'analyse des voies métaboliques spécifiques de cet organisme symbiote.

Certaines espèces de Staphylocoques à Coagulase Négative (SCN) sont naturellement présentes ou employées comme ferments de salaison. La diversité de cette flore au niveau des ateliers de salaisons reste mal connue en raison notamment de la difficulté à identifier les espèces de SCN. Nous avons développé une PCR spécifique pour identifier Staphylococcus xylosus, principale espèce présente dans les produits carnés fermentés. Une PCR multiplex ciblant S. xylosus et trois espèces de staphylocoques pathogènes opportunistes a été développée permettant l'identification de ces espèces et du genre Staphylococcus. Ces méthodes et des méthodes complémentaires basées sur la caractérisation des souches par analyse en PFGE après restriction de l'ADN, par séquençage du gène sodA et par hybridation avec des sondes spécifiques ont permis l'étude de la diversité des SCN d'ateliers de salaisons traditionnelles, artisanales ou industrielles. Nous avons pu montrer que, dans un atelier traditionnel n'utilisant aucun ferment, S. equorum et S. succinus ont colonisé majoritairement les produits et l'environnement alors que les espèces S. xylosus et S. carnosus habituellement utilisées comme ferments sont minoritaires et n'ont pas été retrouvées au niveau des produits finis. Le suivi de S. carnosus et S. xylosus, utilisés comme ferments dans un atelier artisanal et un industriel, a révélé qu'ils ne colonisent pas l'environnement et que S. xylosus devient dominant dans les produits. Il pourrait être intéressant de développer de nouveaux ferments appartenant aux espèces S. equorum ou S. succinus qui semblent adaptées à l'environnement carné.