Dickeya dadantii est une bactérie responsable de pourritures sur un large spectre de plantes. Sa virulence est principalement due à la sécrétion d'enzymes dégradant la paroi végétale. Ce travail de thèse a porté sur l'identification de molécules jouant un rôle de signal dans les interactions entre plantes et bactéries. Divers phytoconstituants sont connus pour être impliqués dans les phénomènes de communication entre plantes et microorganismes. Chez D. dadantii, nous avons caractérisé deux régions génomiques, lfa et lfg, codant des protéines exprimées seulement lors de l'infection de plantes ou en présence d‟extraits végétaux. Leur expression est modulée par des répresseurs agissant différemment en présence ou absence d'inducteur. Ces régulateurs, LfaR et LfgR, contrôlent également l'expression de gènes permettant le transport de l'inducteur dans le cytoplasme bactérien. Après mise au point d'un test de criblage, la recherche de l'inducteur végétal a été réalisée à partir d'extraits de feuilles d'endive et de tubercules de pomme de terre. Plusieurs étapes chromatographiques ont permis d'obtenir plusieurs fractions actives, dont une très fortement. Cette fraction provenant de pomme de terre contient seulement deux composés qui ont été purifiés. Le composé majeur a été identifié comme étant un nucléoside, la guanosine, mais cette molécule pure n'a pas d'activité inductrice. La quantité de l'autre composé était insuffisante pour permettre l'identification de cette molécule active. Les résultats de ce travail montrent l'implication et le mécanisme d'action de petites molécules hydrophiles agissant comme signaux dans l‟interaction entre la plante et D. dadantii.

La plupart des pathologies, qu'elles soient d'origine génétique ou non trouvent leur origine dans l'altération structural et/ou fonctionnelle de protéines d'intérêt. L'agrégation, la glycation et l'oxydation constituent les principaux types de modification protéique fréquemment observées dans de nombreuses maladies tels que le diabète, l'athérosclérose ou encore les maladies neurodégénératives. Généralement, l'altération des activités biologiques de ces protéines est étroitement corrélée avec ses changements conformationnels et structuraux. L'albumine représente la protéine circulante la plus abondante et constitue le plus important antioxydant du plasma sanguin susceptible d'être exposée à un stress glycoxydant accru, et aboutir à la formation de Produits Avancés de Glycation (AGEs) dont les effets peuvent être néfastes au niveau cellulaire et tissulaire. Dans cette étude, je me suis intéressé à l'effet de trois types d'altérations, que sont l'agrégation, la glycation et l'oxydation, sur la structure, le statut redox et l'activité antioxydante de l'albumine ainsi que l'incidence de cette protéine modifiée sur la physiologie de différentes lignées cellulaires. Au cours de ce travail, j'ai abordé les quatre points suivants : 1. Afin de mieux comprendre l'impact de ces processus altératifs sur les propriétés antioxydantes de l'albumine, j'ai étudié, en utilisant des techniques de la Biochimie et de la Biophysique, les modifications structurales de la protéine soumise successivement à la glycation, l'agrégation et aux deux processus simultanément. 2. J'ai mis en évidence et identifié des cibles protéiques sensibles à l'oxydation au niveau d'adipocytes matures humains incubés en présence d'albumine bovine glycoxydée in vitro. 3. J'ai effectué une comparaison de l'action différentielle des modèles in vitro de d'AGEs préparés à partir de l'albumine d'origine bovine ou humaine au niveau de monocytes THP1. 4. Enfin, afin de valider les caractéristiques structurales et biologiques obtenues à partir de nos modèles in vitro d'AGEs dérivés de l'albumine, j'ai étudié sur des modèles purifiés à partir de plasmas de sujets, l'état structural, redox et antioxydant de l'albumine altérée in vivo. Les résultats obtenus lors de ce travail permettent de mettre en avant l'importance de la structure native de la plus abondante des protéines circulantes sur l'intégrité de ses fonctions biologiques et en particulier sur son activité antioxydante. Également, cette étude apporte un nouvel éclairage sur l'implication de l'albumine altérée dans de nombreux désordres métaboliques tels que le diabète.

Notre objectif est d'identifier un gène muté responsable d'une forme familiale de bloc de conduction cardiaque. Cette maladie, à transmission autosomique dominante, a été localisée sur le chromosome 19q13.3 dans un intervalle de 10 cM. L'étude de liaison nous a permis de réduire l'intervalle à 7 cM. Par l'approche de gènes candidats nous avons cherché des mutations dans les parties codantes de 9 gènes, mais aucune anomalie n'a été identifiée. Les données du séquençage du génome humain montrent qu'il y a plus de 100 gènes dans cet intervalle. Nous avons donc entrepris l'approche de la RDA (Representational Difference Analysis) afin de sélectionner les gènes spécifiquement exprimés dans les voies de conduction cardiaque, en supposant que le gène responsable de la maladie est exprimé spécifiquement dans ce tissu. Ce travail nécessite l'extraction spécifique des transcrits des voies de conduction cardiaque (impossible chez l'homme). Nous avons donc choisi de travailler sur le coeur de bovin. Nous avons réalisé toutes les étapes jusqu'à l'obtention des clones. Après séquençage et tri informatique, nous avons obtenus une quarantaine de clones correspondants seulement à une quinzaine de gènes dont la fonction et la localisation chromosomique sur le génome humain est connue. Nous avons vérifié la spécificité tissulaire par RT-PCR et la localisation cellulaire des transcrits spécifiques est testée par l'hybridation In Situ, en cours d'optimisation. En parallèle, nous avons localisé le syndrome de Kartagener lié à l'X en Xq21-q24 chez une famille française à un intervalle de 34 cM, et nous avons exclu deux gènes MID2 et AKAP28 comme gènes candidats.

Notre laboratoire a isolé à partir de tissu adipeux provenant de nouveau-né, une population de cellules souches mésenchymateuses, dénommée cellules hMADS (human Multipotent Adipose-tissue Derived Stem cells). Les cellules hMADS présentent à l'échelle clonale les propriétés fondamentales associées aux cellules souches telles que la multipotentialité et l'auto-renouvellement.<br />Après extravasion, in vitro ou consécutive à leur transplantation dans un organe secondaire, les cellules souches mésenchymateuses pourraient se différencier en des types cellulaires inhabituels. Nos résultats antérieurs montraient en effet que les cellules hMADS pouvaient, après transplantation dans le muscle Tibialis anterior de la souris mdx, contribuer à la formation de myofibres contenant des noyaux humains et exprimant la dystrophine humaine.<br />L'objectif de ce travail a été d'élucider le mécanisme par lequel les cellules hMADS contribuent à la formation de myofibre squelettique. Dans ce but, nous avons essayé « d'engager » le programme myogénique en testant sur ces cellules de nombreuses conditions de culture. Seules les expériences de co-cultures avec des myoblastes ont permis de mettre en évidence la contribution des cellules hMADS à la formation de myotubes hybrides. Ces myotubes présentent un phénotype « normale » et expriment de nombreux gènes musculaires dont la dystrophine, codés par les noyaux issus de la fusion de cellules hMADS avec les myoblastes murins ou humains.<br />Enfin, nous avons démontré que la conversion myogénique des cellules hMADS dans ces conditions n'était pas due à un processus de « détermination/différenciation », mais à une programmation subie des noyaux hMADS. Cette programmation se produirait après la fusion et nécessiterait l'action des facteurs de transcription myogénique (Myogenic Regulatory Factors) codés par les noyaux issus des myoblastes.

La bactérie à Gram-negatif Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste impliqué dans les infections nosocomiales et touchant essentiellement les individus immunodéprimés. Parmi les mécanismes de résistance aux antibiotiques, leur efflux actif par un système de transport transmembranaire appelé Mex (Multi-drug Efflux pump) a pris une grande importance clinique. Ces systèmes d'efflux sont constitués d'un assemblage de trois protéines différentes : une porine de la famille OMF (Outer Membrane Factor), un transporteur de la famille RND (Resistance Nodulation Division) localisé dans la membrane interne et un adaptateur périplasmique de la famille MFP (Membrane Fusion Protein) assurant la cohésion du système. Le sujet de thèse porte sur l'étude structurale, essentiellement par cristallographie RX, de la pompe d'efflux MexXY-OprM qui présente la particularité d'être spécifique aux antibiotiques de la famille des aminoglycosides.

Le paludisme à P. falciparum constitue le problème de santé publique principal sur l'archipel des Comores. Le présent travail propose une synthèse des informations relatives à son épidémiologie, associée à une application des méthodes récentes d'épidémiologie moléculaire et de génétique des populations plasmodiales à la situation comorienne. Celle-ci apparaît contrastée. Ainsi, Grande Comore, Mohéli et Anjouan sont des îles marquées par une morbidité palustre importante, et leur population plasmodiale est globalement homogène. La morbidité est en revanche beaucoup plus faible à Mayotte, où les cas sont pour moitié d'origine importée depuis les îles voisines, et pour moitié autochtones et concentrés dans le foyer résiduel et génétiquement isolé de Bandraboua selon une distribution microépidémique. Les niveaux de chimiorésistance, globalement élevés, sont également contrastés, du fait de pressions médicamenteuses différentes. En complément des stratégies actuelles de lutte antipaludique, ces informations conduisent donc à recommander : (1) la nécessité d'une surveillance de la chimiorésistance séparée pour chaque île, (2) le principe d'une élimination du paludisme sur les 4 îles à la fois et non pas sur une seule, et (3) un renforcement de la prévention des épidémies sur la commune de Bandraboua. Mais l'arrivée des ACT, la large distribution des moustiquaires imprégnées et le récent traitement de masse sur Mohéli devraient modifier à court terme cette situation épidémiologique. Ils devraient également relancer la pertinence d'une surveillance de la chimiorésistance excentrée à Marseille, où la représentativité génétique des parasites importés est pour l'instant limitée.

Les Escherichia coli entérohémorragiques (EHEC) sont responsables de toxi–infections alimentaires conduisant à des colites hémorragiques pouvant se compliquer d'un syndrome hémolytique et urémique. Le facteur majeur de pathogénicité est la production de Shiga-toxines (Stx), dont la toxine Stx2. Nous avons étudié la production de toxine Stx2 in vitro par des souches STEC provenant de diverses origines (bovine ou clinique), appartenant à divers séropathotypes, et codant pour différents variants Stx2. Nous avons montré que les souches O157:H7 les plus pathogènes possèdent le variant stx2 et produisent de fortes quantité de Stx2 en conditions basales comme en présence d'un inducteur du système SOS. Les souches non-O157 présentant ces caractéristiques pourraient représenter un risque pour la santé humaine. Nous avons ensuite étudié l'effet de molécules présentes dans le tube digestif sur la synthèse de Stx2 par E. coli O157:H7. Les auto-inducteurs AI-2 et AI-3 du quorum sensing, produits par le microbiote intestinal, n'influencent pas la synthèse de Stx2, non plus que l'hormone intestinale norépinéphrine. Cependant, la protéine régulatrice QseA impliquée dans une voie de signalisation par le quorum sensing serait un activateur transcriptionnel de stx2. Enfin, nous avons étudié la production de Stx2 par la souche EHEC O157:H7 EDL 933 dans un milieu se rapprochant le plus possible de celui rencontré in vivo par les EHEC, en particulier grâce à un modèle de rats associés au microbiote intestinal humain. Nous avons ainsi montré que le microbiote humain inhibe la transcription de stx2 par l'inhibition de la transcription de recA même lors de l'induction du système SOS, et que cette inhibition peut être en partie attribuée à l'espèce Bacteroides thetaiotaomicron.

Dans le plasma, la protéine humaine de transfert des esters de cholestérol joueun rôle central dans le métabolisme des lipoprotéines plasmatiques en catalysant le transfert net massique d'esters de cholestérol des HDL vers les lipoprotéines contenant de l'Apo.B, et de triglycérides des VLDL vers les HDL et LDL. Bien que le rôle de la CETP sur l'athérogénicité du profil lipoprotéique reste à l'heure actuelle encore ambigu, l'étude des mécanismes de régulation de cette protéine suscite un intérêt croissant d'un point de vue pharmacologique en particulier en ce qui concerne le développement d'inhibiteurs. <br />Une approche in vitro nous a permis de montrer que des composés amphipathiques (acides gras non estérifiés et rétinoïdes) constitués d'une chaîne carbonée hydrophobe et d'un groupement carboxylique ionisable induisaient une augmentation de l'activité de transfert des esters de cholestérol en augmentant l'électronégativité des particules lipoprotéiques. <br />In vivo, nos études ont permis de mettre en évidence une corrélation significative entre la concentration en acides gras non estérifiés liés aux protéines et l'activité de la CETP plasmatique chez des sujets normolipidémiques. L'effet des acides gras non estérifiés est encore plus marqué dans des situations pathologiques associées à une redistribution des AGNE de l'albumine vers les lipoprotéines plasmatiques (analbuminémie ou syndrôme néphrotique). La mise au point d'une méthode électrophorétique spécifique nous a permis de confirmer que, chez des sujets analbuminémiques, les échanges d'esters de cholestérol s'effectuent préférentiellement avec les lipoprotéines les plus électronégatives dont le contenu en AGNE est le plus élevé.<br />Globalement, les résultats de cette étude montrent que les AGNE constituent des modérateurs potentiels de l'activité de transfert des esters de cholestérol au niveau plasmatique et qu'ils pourraient ainsi influencer l'athérogénicité du profil lipoprotéique.

La ciguatéra, ichtyosarcotoxisme majoritairement rencontré dans la zone intertropicale, trouve son origine dans la consommation de poissons tropicaux contaminés par des neurotoxines marines, les ciguatoxines (CTXs). Ces polyéthers polycycliques synthétisés par les micro-algues du genre Gambierdiscus, se fixent de façon privilégiée aux canaux sodiques dépendant du potentiel. Cependant, ce seul mode d'action n'explique pas tous les symptômes observés dans la ciguatéra notamment les manifestations particulières de type inflammatoire. L'effet de deux toxines ciguatérigènes, la P-CTX-1B et la P-CTX-3C, ainsi que l'activité d'un analogue, la brévétoxine PbTx-3, sur la modulation des médiateurs de l'inflammation que sont les cytokines, a été caractérisé sur un modèle d'étude in vitro de cellules de macrophages murins RAW 264.7. Le suivi de l'expression génique au moyen de techniques de PCR quantitative a révélé que la P-CTX-1B est capable d'induire les cytokines pro-inflammatoires interleukine (IL)-1β, IL-6 et le Tumor Necrosis Factor (TNF)-α, et l'anti-inflammatoire IL-10. Par ailleurs, alors que les traitements proposés par la médecine occidentale sont essentiellement symptomatiques, la médecine traditionnelle propose l'utilisation de nombreuses plantes dont certaines sont capables de réduire les effets des CTXs in vitro et in vivo. La nécessité d'enrichir l'arsenal thérapeutique de la ciguatéra ainsi que l'implication probable des mécanismes inflammatoires dans cette pathologie nous ont conduits à caractériser le potentiel anti-inflammatoire de quatre plantes parmi celles traditionnellement employées dans le Pacifique. Les effets d'extraits aqueux de Cerbera manghas, Euphorbia hirta, Heliotropium foertherianum et Vitex trifolia sur la cinétique de synthèse des ARNm ainsi que sur la production des protéines cytokiniques, ont été étudiés sur le modèle d'induction de macrophages murins stimulés par un lipopolysaccharide bactérien (LPS). Les résultats montrent que E. hirta et V. trifolia possèdent les activités anti-inflammatoires les plus intéressantes et cette dernière a été sélectionnée pour de plus amples tests. L'extrait aqueux de V. trifolia montre la capacité à inhiber les cytokines pro-inflammatoires IL-1β, IL-6 et TNF-α et à induire l'anti-inflammatoire IL-10 dépendant du LPS. La finalité du projet doit permettre l'étude de principes actifs isolés des plantes sélectionnées et les composés d'intérêt pourront être testés sur modèle animal avant d'être validés sur l'homme. Ainsi de nouveaux traitements thérapeutiques de la ciguatéra pourront-ils être proposés. Mots clés : ciguatéra, ciguatoxine, cytokine, PCR quantitative, ELISA, physiopathologie, remèdes traditionnels, Vitex trifolia, Euphorbia hirta, Cerbera manghas, Heliotropium foertherianum.

Les océans couvrent plus de 70% de la surface de la Terre (planète bleue) et la productivité primaire nette (PPN) marine est équivalente à celle terrestre. Alors qu‟il ne représente que 1% de la biomasse totale d‟organismes photosynthétiques de la planète, le phytoplancton est responsable d‟environ 45% de la PPN globale. Le terme phytoplancton décrit un assemblage polyphylétique comprenant des eucaryotes et procaryotes photosynthétiques dérivant avec les courants. Dans les océans contemporains, les diatomées constituent un groupe d‟eucaryotes unicellulaires autotrophes très abondant, responsable de 40% de la PPN marine. Les diatomées appartiennent à la lignée des straménopiles qui sont issus d‟un évènement d‟endosymbiose entre une algue rouge et un hôte hétérotrophe. Elles sont classifiées en deux groupes majeurs : les centriques qui son apparues il y a environ 200 millions d‟années (Ma), et les pennées qui ont évolué il y a environ 90 Ma. Deux génomes de diatomées ont récemment été séquencés : celui de la diatomée centrique Thalassiosira pseudonana (32 Mb), et celui de la diatomée pennée Phaeodactylum tricornutum (27 Mb). Mon sujet de doctorat s‟est focalisé sur l‟étude de différents aspects de la régulation de l‟expression génique ainsi que sur la dynamique et l‟évolution de ces génomes. L‟expression des gènes est régulée à différents niveaux: trancriptionel, post-transcriptionel, et épigénétique. Dans le cadre de mon doctorat, une étude de la régulation transcriptionelle chez les diatomées a été effectuée et comprend l‟identification et l‟analyse in silico des facteurs de transcription (FT). Cela a permis par exemple d‟établir qu‟une classe spécifique de FT, les Heat Shock Factors, sont particulièrement abondants chez les diatomées par rapport aux autres eucaryotes. L‟analyse de la représentation des FT identifiés dans différentes librairies d‟EST élaborées à partir de cultures ayant subi divers stress a permis de détecter certaines spécificités d‟expression. L‟évolution des génomes eucaryotes est largement impactée par les effets directs et secondaires des éléments transposables (ET) qui sont des éléments génétiques mobiles se trouvant dans le génome de la plupart des organismes. Dans le but d‟étudier la dynamique des génomes de diatomées, la recherche de différents types d‟ET a permis d‟établir qu‟une certaine classe, les rétrotransposons de type Copia, est la plus abondante dans ces génomes et constitue un part significativement plus importante du génome de P. tricornutum (5,8%) par rapport à T. pseudonana (1%). D‟autre part, des analyses phylogénitiques ont montré que les rétrotransposons de type copia forment deux classes distinctes et éloignées de la lignée Copia. L‟analyse de leurs niveaux d‟expression a montré que la transcription de deux éléments s‟active en réponse à des stress spécifiques comme la limitation en nitrate dans le milieu de culture. Cette activation est accompagnée par un hypométhylation de l‟ADN et l‟analyse de profils d‟insertions chez différents écotypes de P. tricornutum ainsi que l‟étude d‟autres phénomènes suggèrent que les rétrotransposons de type Copia ont joué un rôle important dans l‟évolution des diatomées. Mon grand intérêt pour les ET m‟a ensuite amené à chercher à les caractériser dans d‟autres génomes récemment séquencés tels celui de l‟algue brune Ectocarpus siliculosus. La recherche in silico de différents gènes codant des protéines capables d‟introduire ou de stabiliser des états épigénétiques telle que la modification des histones et la méthylation de l‟ADN a montré leur présence chez P. tricornutum ainsi que leurs particularités. La présence de certaines modifications d‟histones spécifiques d‟une conformation compacte ou ouverte de la chromatine dans le proteome de P. tricornutum a été montrée. De plus, la mise au point de la technique d‟immunoprécipitation de la chromatine chez P. tricornutum a permis d‟établir que les nucléosomes enrobés d‟éléments transposables étaient marqués par des modifications spécifiques. D‟autres expériences ont permis d‟établir que l‟ADN de différents types d‟éléments transposables est marqué par la méthylation de cytosines chez P. tricornutum. Une expérience permettant l‟analyse du profil de méthylation à l‟échelle de génome en utilisant une puce à ADN a été lancée et permettra de découvrir si certains gènes portent aussi des traces de méthylation. Enfin, les ARN interférents constituent un troisième mode de régulation de l‟expression se situant à l‟interface de la régulation transcriptionelle, post-transcriptionelle et épigénétique. Les mécanismes d‟interférences chez les diatomées ont été étudié par la recherche in silico d‟enzymes clés impliquées dans ce processus ainsi qu‟en établissant expérimentalement un lien direct avec la méthylation de l‟ADN.