Caractériser la structure tridimensionnelle des protéines avec les structures secondaires classiques est assez pauvre structurellement. Nous avons donc développé une nouvelle méthodologie pour concevoir des séries de petits prototypes moyens nommés Blocs Protéiques (BPs) qui permettent une bonne approximation des structures protéiques. L'analyse de la spécificité des blocs protéiques a montré leur stabilité et leur spécificité sur le plan structural. Le choix final du nombre de BPs est associé a une prédiction locale correcte.<br />Cette prédiction se base avec une méthode bayésienne qui permet de comprendre l'importance des acides aminés de maniè;re simple. Pour améliorer cette prédiction, nous nous sommes bases sur deux concepts : (i) 1 repliement local -> n séquences et (ii) 1 séquence -> n repliements. Le premier concept signifie que plusieurs types de séquences peuvent être associes a la même structure et le second qu'une séquence peut-être associée a plusieurs type de repliements. Ces deux aspects sont développés en se basant sur la recherche d'un indice de fiabilité lie a la prédiction locale, pour trouver des zones de fortes probabilités. Certains mots, i.e. successions de blocs protéiques apparaissent plus fréquemment que d'autres. Nous avons donc défini au mieux quelle est l'architecture de ces successions, les liens existants entre ces différents mots.<br />Du fait de cette redondance qui peut apparaìtre dans la structure protéique, une méthode de compactage qui permet d'associer des structures structurellement proches sur le plan local a été mise au point. Cette approche appelée "protéine hybride" de conception simple permet de catégoriser en classes "structurellement dépendantes" l'ensemble des structures de la base de données protéiques. Cette approche, en plus du compactage, peut être utilisée dans une optique différente, celle de la recherche d'homologie structurale et de la caractérisation des dépendances entre structures et séquences.

La famille RecQ des ADN hélicases est impliquée dans la maintenance de la stabilité génomique. Nous nous sommes intéressés, au cours de ce travail, au rôle du doigt de zinc du domaine RecQ Ct de ces hélicases. Les résultats indiquent que le motif à doigt de zinc est impliqué dans la fixation à l'ADN et le repliement correct de la protéine RecQ. Nous avons montré que le domaine hélicase de RECQ5 possède une activité intrinsèque qui tend à favoriser l'hybridation d'ADN et que le doigt de zinc de RECQ5(3 régule la fixation à l'ADN, l'activité ATPase, le déroulement de l'ADN, l'hybridation de l'ADN et l'échange des brins d'ADN. II semble que la présence du doigt de zinc est essentielle pour les activités ATPase et hélicase des hélicases RecQ, mais pas pour l'activité d'hybridation d'ADN. Notre travail sur les hélicase RecQ de Bacillus subtilis soutient aussi cette conclusion.

La protéine Rev du HIV-1 joue un rôle essentiel dans le cycle viral en permettant l'export vers le cytoplasme des ARNm viraux non ou partiellement épissés. Dans la perspective d'inhiber cette fonction, nous avons mis au point des peptides capables de reconnaître Rev et d'inhiber sa fonction, appelés SHPR (Sumo Heptapeptide Protein transduction domain for binding Rev). Nous avons établi que ces peptides sont capables de diffuser à travers les membranes plasmiques pour atteindre ensuite le noyau, où ils induisent la dégradation de la protéine virale, principalement par la voie du protéasome. Des expériences de mutagenèse ont précisé la contribution des différents domaines des SHPR dans l'action antivirale, et ont démontré que peu d'améliorations sont possibles pour optimiser leurs propriétés. Enfin, nous avons montré que Rev n'est pas régulée par sumoylation mais qu'elle peut être modifiée par addition d'une chaîne de polyubiquitine, qui stabilise la protéine mais module son activité

Longtemps considéré comme un composé toxique, le sélénium est maintenant<br />largement reconnu comme oligo-élément essentiel. Des carences alimentaires ont été<br />associées à de nombreuses pathologies.<br />La sélénocystéine est la forme biologique principale du sélénium. Cet acide aminé particulier<br />est spécifiquement incorporé dans les sélénoprotéines grâce à une machinerie traductionnelle<br />dédiée en réponse à un codon UGA, traditionnellement reconnu comme un codon stop.<br />A ce jour, la fonction moléculaire de la plupart des sélénoprotéines demeure inconnue. Parmi<br />celles-ci figure la sélénoprotéine N (SePN), une nouvelle protéine à sélénium identifiée en<br />1999 dans notre laboratoire par une approche bioinformatique.<br />En 2001, il a été démontré que des mutations dans le gène SEPN1 codant pour SePN étaient<br />responsables de différentes pathologies musculaires regroupées dorénavant sous le terme de<br />myopathies apparentées à la sélénoprotéine N.<br />Au début de ma thèse, peu de choses étaient connues sur la fonction de SePN. Pour<br />comprendre son rôle, nous avons entrepris son étude selon différentes approches.<br />Dans un premier temps, j'ai contribué à montrer que SePN est une glycoprotéine de 65kDa,<br />associée aux membranes du réticulum endoplasmique. Ensuite, des approches biochimiques<br />successives ont permis de mettre en évidence son interaction avec différentes protéines de la<br />membrane, et dont l'identification est en cours.<br />Dans un deuxième temps, nous avons mis au point deux modèles animaux des pathologies<br />musculaires associées à un dysfonctionnement de SePN. Par une approche antisens, il a été<br />observé que l'inhibition de l'expression de SePN au cours du développement embryonnaire<br />chez le poisson zèbre entraînait une altération de l'organisation du tissu musculaire.<br />Parallèlement, tirant avantage du système Cre-Lox, nous avons obtenu des souris invalidées<br />pour SEPN1 dans tout l'organisme ou de façon tissu spécifique dans le muscle. De façon<br />surprenante, les animaux ainsi obtenus ne présentent pas de phénotype apparent, même si les<br />analyses histologiques préliminaires permettent d'observer un profil dystrophique classique<br />des fibres musculaires. En outre, les animaux semblent présenter une sensibilité accrue au<br />stress oxydatif induit. L'exploration fonctionnelle de ce modèle est poursuivie au laboratoire<br />et fait l'objet de plusieurs collaborations.<br />Enfin, une autre étude entreprise au cours de ma thèse concerne une mutation pathologique du<br />gène SEPN1 conduisant à l'apparition de myopathies chez l'homme. Par une approche<br />originale déduite du mécanisme atypique de traduction des sélénoprotéines, une stratégie qui<br />pourrait aboutir à terme à une thérapie génique pour certains patients a été mise au point.<br />L'ensemble de ces travaux va permettre d'augmenter nos connaissances sur le rôle de<br />la sélénoprotéine N dans le muscle ainsi que sur la fonction biologique de l'oligo-élément<br />sélénium dans ce tissu. Le but ultime de l'ensemble de ces travaux est de développer des<br />outils de diagnostic ainsi que des approches thérapeutiques ciblées.

Application aux calculs radiocristallographiques des algorithmes de transformation de Fourier rapide (Fast Fourier Transform (FFT)).

L'alimentation en eau constitue le principal facteur limitant la croissance, voire la survie des<br />plantes. Les modèles climatiques prévoient pour les 50 à 100 années à venir une baisse des<br />précipitations et des températures estivales accrues dans la moitié sud de la France. La durée<br />de vie d'une forêt de pin maritime, de sa plantation jusqu'à la coupe d'exploitation est<br />justement de 50 ans. Il est donc important de savoir si ces organismes pourront faire face à ces<br />brusques changements climatiques ; en d'autres termes si les variétés améliorées plantées<br />aujourd'hui pourront maintenir le niveau actuel de productivité dans un milieu plus pauvre en<br />eau, et tolérer des épisodes de sécheresse intense. La capacité de ces organismes à faire face à<br />ces perturbations brutales dépendra à la fois de leur plasticité phénotypique et de leur diversité<br />génétique. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié la plasticité moléculaire du système<br />racinaire de jeunes plants de pin maritime élevés en milieu hydroponique et soumis à un stress<br />osmotique par ajout de polyéthylène glycol. Un plan factoriel croisant deux écotypes (France<br />et Maroc) par cinq niveaux de stress a permis d'analyser les réponses du transcriptome et du<br />protéome à court et long terme. Nos investigations ont porté sur l'accumulation des transcrits<br />de 7000 gènes et de 1200 protéines. L'analyse statistique des données a permis d'identifier<br />des gènes dont la plasticité moléculaire est génétiquement contrôlée, révélant des stratégies de<br />réponse différentes de chaque écotype. La valeur adaptative de ces gènes pourra alors être<br />confirmée par l'interprétation des patrons de diversité nucléotidique de ces gènes candidats.

La NADPH oxydase (NOX) est un complexe multienzymatique responsable de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) que l'on retrouve dans un grand nombre de types cellulaires. La NOX des neutrophiles est composée de deux protéines transmembranaires (gp91phox et p22phox), qui constituent le site catalytique, et de trois facteurs cytosoliques (p47phox, p67phox et p40phox). Lors de son activation, p47phox subit des changements conformationnels que nous tâchons de définir, afin de mieux comprendre la régulation de ce complexe impliqué dans un grand nombre de pathologies. Dans les neutrophiles, les ROS sont responsables de la destruction de pathogènes phagocytés. Il paraît donc primordial de bien comprendre les bases moléculaires du mécanisme d'activation de la NOX pour envisager sa régulation future. Au cours de ce travail, des changements conformationnels ont été identifiés sur p47phox par protéolyse ménagée et échange H/D couplés à la spectrométrie de masse (DXMS). Le relargage de l'AIR, entraînant une meilleure accessibilité du site d'interaction avec p22phox, a été confirmé et caractérisé d'un point de vue structural et fonctionnel sur protéine entière. De plus, une surface inédite contrôlant l'état autoinhibé a été mise en évidence. La mutagénèse dirigée au sein de cette surface a permis de confirmer cette hypothèse en identifiant deux résidus clés (R162 et D166) responsables de cette autoinhibition et donc susceptibles d'être de futurs candidats de cibles thérapeutiques. Les propriétés d'interactions relatives des divers mutants avec GST-p22phoxCter et des liposomes ont été testées par BiacoreTM et cosédimentation, respectivement. L'identification de ces résidus a permis de mieux comprendre le mécanisme d'activation de p47phox, et notamment comment le démasquage de l'AIR phosphorylée entraîne celui du domaine PX. Enfin, une étude méthodologique a montré que la plasmepsine 2 de P. falciparum était un nouvel outil susceptible d'améliorer la résolution du DXMS.

Les protéines de la membrane nucléaire interne ainsi que les lamines, filaments intermédiaires nucléaires, jouent un rôle majeur dans l'assemblage et l'architecture du noyau. Ils interviennent aussi probablement dans le positionnement des chromosomes et influencent ainsi l'expression des gènes. Récemment, il a été montré que ces protéines sont mutées dans plusieurs pathologies. Notre objectif est de déterminer la structure tridimensionnelle des protéines de l'enveloppe nucléaire en complexe avec leurs partenaires biologiques afin de proposer des mécanismes moléculaires pour les pathologies correspondantes. Pendant ma thèse je me suis focalisée sur certaines protéines de l'enveloppe nucléaire : les lamines de type A, l'émerine et MAN1. Afin de comprendre les caractéristiques de l'interaction MAN1-R-Smads, j'ai caractérisé la région C-terminale de MAN1, responsable de la liaison. Cette région est composée d'un domaine N-terminal qui adopte un repliement structural de type WH qui lie l'ADN. La modélisation du complexe WH-ADN montre que les régions impliquées dans la liaison à l'ADN sont distinctes de celles prédites pour l'interaction avec les R-Smads. MAN1 peut donc lier simultanément les R-Smads et l'ADN. En parallèle, j'ai essayé de caractériser des interactions directes entre la partie C-terminale de la lamine de type A et l'émerine ou SREBP1. Nous n'avons pu confirmer ces interactions. J'ai aussi travaillé sur une nouvelle mutation de l'Ig fold de la lamine A, R439C, à l'origine d'une FPLD avec des symptômes progéroides. A un niveau moléculaire, la structure tridimensionnelle et la stabilité thermique de l'Ig fold sont similaires. Par contre, l'introduction d'une cystéine provoque la formation d'oligomères de l'Ig fold par les ponts disulfures qui affecte les propriétés d'interaction avec l'ADN. En conclusion, cette mutation pourrait être à l'origine d'un nouveau mécanisme pathologique des laminopathies.

Les RCPG sont exprimés dans tous types de tissus et sont impliqués dans la régulation de nombreux processus biologiques et ont pour rôle de capter un vaste panel de stimuli extracellulaires qu'ils transmettent à l'intérieur de la cellule. Récemment, le laboratoire a identifié une nouvelle famille de dix protéines, les GASP, qui interagissent avec les RCPG et moduleraient leur trafic intracellulaire. Alors que GASP-1 est le membre de cette famille le mieux caractérisé et que son interaction avec de nombreux RCPG soit documentée, peu d'informations sont disponibles sur les modalités d'interaction de cette protéineavec les RCPG au niveau moléculaire. La première partie de ce projet de thèse a consisté à étudier les modalités d'interaction entre les GASPs et les RCPG au niveau moléculaire. Nous avons ainsi pu montrer à l'aide de techniques biochimiques et biophysiques, l'importance d'un motif répété et conservé de 15 acides aminés pour l'interaction de GASP-1 avec divers RCPG. Par la suite, les résultats obtenus ont été exploités pour mettre en place un essai de criblage qui nous a permis d'identifier des petites molécules capables de perturber l'interaction entre GASP-1 et le récepteur beta-2 adrénergique. Enfin, l'absence de données structurales sur les protéines de la famille GASP nous a ensuite poussé à la réalisation d'études structurales de ces protéines à la fois par cristallographie et par RMN. Bien que les résultats obtenus ne nous aient pas encore permis d'obtenir la structure de ces protéines, des expériences préliminaires de RMN ont permis deconfirmer l'implication des acides aminés tryptophanes présents au sein des motifs GASP dans l'interaction avec les RCPG.

La Polyarthrite Rhumatoïde, caractérisée par une synovite à l'origine de lésions progressives ostéo-articulaires, est le plus fréquent des rhumatismes inflammatoires. Les formes réactives de l'oxygène (ROS) produites par la NADPH oxydase des polynucléaires neutrophiles (PMN) infiltrant le pannus rhumatoïde, sont responsables de lésions tissulaires. La NADPH oxydase des phagocytes, est formée d'un centre catalytique membranaire, le cytochrome b558, sur lequel vient s'associer des protéines cytosoliques régulatrices (p67phox, p47phox, p40phox et Rac1/2). L'étude du complexe NADPH oxydase isolé et constitutivement actif, à partir de PMN activés, a révélé la présence de deux enzymes impliquées dans la régulation du métabolisme du glucose. Il s'agit de la PFK2 (6-phosphofructokinase 2) et de la 6PGDH (6-phosphogluconate déshydrogénase) [Paclet et al. 2007]. De plus, l'étude des protéines cytosoliques retenues sur une matrice d'affinité ciblant p47phox, a établi que les protéines S100A8 et S100A9, constituant 40% des protéines cytosoliques du PMN, participent à l'activation de l'oxydase [Berthier et al. 2003]. L'hétérocomplexe S100A8/A9, augmente l'activité de la NADPH oxydase phagocytaire et induit un changement conformationnel du cytochrome b558. Au regard de l'importance de la stimulation du PMN dans la physiopathologie de la PR, notre objectif, à terme, est d'analyser les mécanismes de l'activation de la NADPH oxydase dans cette pathologie. D'une part, nous avons étudié la spécificité de l'interaction entre la 6PGDH ou la PFK2 et la NADPH oxydase des PMN. D'autre part, nous avons caractérisé les domaines de l'hétérocomplexe S100A8/A9 impliqués dans l'activation de la NADPH oxydase phagocytaire. Par ailleurs, une étude de la signature protéique dans le liquide synovial a été menée afin de rechercher l'empreinte de l'activation du PMN dans la PR et de caractériser des biomarqueurs spécifiques de cette pathologie. Après stimulation par le PMA, la 6PGDH et la PFK2 co-imunoprécipitent avec les facteurs cytosoliques p67phox, p47phox and p40phox. Les expériences de microscopie confocale suggèrent une co-localisation de ces deux enzymes du métabolisme du glucose avec la NADPH oxydase, dans des micro-domaines membranaires : les radeaux lipidiques. La 6PGDH est impliquée dans l'activation de la NADPH oxydase phagocytaire en élevant la concentration du NADPH cytosolique mais également en augmentant l'affinité de cette enzyme pour son substrat, le NADPH. PFK2 est l'enzyme majeure de la régulation de la glycolyse. Dans les neutrophiles, cette voie est essentielle pour la production d'ATP disponible, d'une part, pour la phosphorylation des facteurs cytosoliques de la NADPH oxydase et d'autre part, pour la NDP Kinase. Cette dernière enzyme pourrait, secondairement, activer Rac en formant du GTP à partir d'ATP. Les protéines S100A8/A9 sont directement impliquées dans les mécanismes de régulation de la NADPH oxydase. L'utilisation du complexe S100A8/A9 et de protéines chimères de fusion nous a permis de révéler que la partie C-terminale de S100A8 est impliquée dans la liaison avec le cytochrome b558 et l'activation de la NADPH oxydase phagocytaire. In vivo, le profil protéique du liquide articulaire de PR a mis en évidence l'empreinte de l'activation du PMN dans cette pathologie. Les protéines S100A8, S100A9 permettraient de différencier le liquide synovial rhumatoïde de celui de patients arthrosiques ou souffrant d'arthrites non rhumatoïdes. De manière intéressante, une production ectopique de S100A8/A9 par les synoviocytes de type fibroblastique a été mise en évidence, suggérant une implication potentielle de ces protéines dans la physiopathologie de la PR. En conclusion, la 6PGDH, la PFK2 et l'hétérodimère S100A8/A9 sont de nouveaux partenaires d'activation de la NADPH oxydase des phagocytes. Dans la Polyathrite Rhumatoïde, l'activation des PMNs conduit à la sécrétion de S100A8/A9 qui semblent constituer à la fois des biomarqueurs pertinents, mais également des cibles thérapeutiques potentielles.