The aim of this thesis is to study the energy fluctuations (leading to thermal fluctuations) during thermal and enzymatic denaturation of biological molecules and to study the variation in fluctuations between simple molecules like the DNA (which have only a secondary structure) to molecules with higher order structures and packaging. We have developed a new technique - Thermal Fluctuation Spectroscopy (TFS) to study these fluctuations. The technique of Thermal Fluctuation Spectroscopy (TFS) is a combination of microcalorimetry and noise measurement techniques. The combination of these two powerful techniques has never been exploited before. In this technique any energy exchange between sample and the substrate is reflected as a thermal fluctuation of the substrate. The system resolution is few parts per billion (ppb) and fluctuations in energy ~ 100nJ (which correspond to temperature fluctuations ~ K) can be measured. Chromatin is the basic building block of chromosome and this thesis focuses on the constituents this fundamental building block - DNA, histones and nucleosomes. Heteropolymeric dsDNA shows extremely large non-Gaussian fluctuation around its melting temperature. For homopolymeric DNA the fluctuations during denaturation are smaller. The thermal fluctuation during denaturation of a heteropolymer in buffer is several orders larger than when the DNA is on a substrate while that for a homopolymer is comparable in both cases. Our measurements established that heteropolymeric dsDNA denaturation occurs in two stages. Initially, at around 330 K, bubbles are formed in the AT rich regions. At higher temperatures, the GC rich regions binding them denature in a cooperative transition causing extremely large fluctuations. TFS on histone monomers showed that H1 monomer shows an increase in thermal fluctuation in the temperature range studied, while the core histones did not. We infer that this is due to the fact that the core histones may not be properly folded when they exist as monomers. It was seen that H1 crosses an energy barrier of 17 kcal/mol to go from its native to denatured state. The transition was kinetically driven with a fixed barrier till 352 K. At 352K, the barrier softened by ~ 1 kcal/mol leading to faster denaturation. The core histones when assembled as dimers/oligomers showed an increase in fluctuation at temperatures below 350 K. The assembling of these histones and DNA into a mononucleosome causes a very large increase in fluctuation over the entire temperature range studied. TFS showed that the fluctuation during mononucleosome denaturation was much larger than a simple sum of the fluctuations of its constituents. From the data we were able to identify that the denaturation starts with dissociation and unfolding of the core histones and the denaturation of AT rich regions of the DNA which leads to the breaking of some of the histone-DNA contacts. At higher temperatures the linker histone H1 and the GC rich regions of the DNA denature, leading to a collapse of the entire nucleosome structure. The broadness of the transition region (the fact that the fluctuation is large over the entire temperature range) was attributed to the presence of different types of contacts and interactions (with different energies) stabilizing the nucleosome structure. The nucleosome was found to favour large energy jumps over smaller ones indicating that the denaturation has an element of cooperativity involved. Using TFS we have been able to determine the fluctuations involved in the denaturation of biomolecules like DNA, histones and nucleosomes. The energy barriers to denaturation have been determined. We have also been able to give models for the denaturation of these biomolecules. We have also shown that it is possible to study enzymatic digestion using TFS. Thus, the technique of TFS is a viable tool for the study of fluctuations in reactions, in biomolecules, during transitions and in any process where there is an energy exchange involved.

Un photosensibilisateur est un composé chimique capable de générer, sous l'effet d'une irradiation lumineuse, des espèces réactives de l'oxygène (ROS) et donc d'induire directement ou indirectement l'altération d'autres composés. La rétention sélective de ces molécules, dites photo-activables, par les tissus en prolifération leur confère des applications en thérapie anti-tumorale (Photo-Chimio-Thérapie, PDT). La plupart des photosensibilisateurs sur le marché sont des dérivés structuraux de porphyrines et sont généralement fluorescents. Cette propriété est utilisée pour déterminer leur localisation, tant au niveau systémique que cellulaire. Certains composés sont ainsi utilisés pour le diagnostic par fluorescence de certain cancers (FD). Au niveau intracellulaire, un certain nombre de ces photosensibilisateurs se localisent dans les membranes des vésicules d'endocytose. Ils peuvent ainsi induire, sous irradiation lumineuse, la libération dans le cytosol du contenu de ces vésicules, y compris des molécules exogènes incorporées dans la cellules par endocytose et dont la cible intracellulaire est cytosolique ou nucléique (ADN, protéines, nombreux médicaments...). Ces phénomènes sont à la base d'une approche permettant l'activation de macromolécules, l'Internalisation Photo-Assistée (PCI). Cette méthode potentialise considérablement l'activité biologique d'un très large spectre de molécules d'intérêt.Tant la sélectivité de ces photosensibilisateurs pour les tissus en prolifération que leur localisation intracellulaire sont à mettre en relation avec les propriétés physico-chimiques et biologiques du micro-environnement. Leur interaction avec les lipoprotéines de basse densité (LDL) peut favoriser leur entrée dans les cellules du fait de la surexpression par les cellules néoplasiques des récepteurs aux LDL. Cependant, pour certaines molécules photo-activables, un passage transmembranaire par diffusion passive a été mis en évidence. L'incorporation cellulaire est alors facilitée par l'acidification du pH stromatique. Nous nous sommes donc attaché à déterminer l'importance de tels paramètres. Notre objectif a été de définir des caractéristiques structurales déterminant le comportement cellulaire des photosensibilisateurs.Dans un premier temps, afin d'élucider les mécanismes impliqués, les interactions de photosensibilisateurs avec des LDL et des liposomes (SUV, utilisés comme modèles simples de membranes) ont été étudiées à l'équilibre et de façon dynamique. Trois photosensibilisateurs ont été utilisés : la deuteroporphyrin (DP), une porphyrine dicarboxylique et la phtalocyanine d'aluminium disulfonnée (AlPcS2). Ces études ont été menées en nous attachant tout particulièrement aux effets liés au pH. Il faut noter ici que seuls les composés carboxyliques sont susceptibles de subir une neutralisation, ne serait-ce que partielle, de leurs chaînes latérales dans une gamme de pH correspondant à des valeurs physiologiques. Les données obtenues sur ces systèmes simples nous ont ensuite permis de comprendre la localisation sub-cellulaire des photosensibilisateurs sur une lignée humaine de fibroblastes. Enfin, bien que les LDL soient des vecteurs importants des photosensibilisateurs et facilitent leur entrée dans les cellules, la localisation sub-cellulaire semble être directement liée à la dynamique du transfert des photosensibilisateurs par des membranes. En conclusion, les paramètres physico-chimiques déterminés en solutions sont des outils efficaces pour concevoir des photosensibilisateurs, prédire leur capacité d'incorporation cellulaire ainsi que leur localisation sub-cellulaire.

La question se pose de l'existence de domaines membranaires permettant de regrouper les différentes protéines nécessaires à la transmission du signal par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Nous avons donc analysé l'organisation dynamique du récepteur mu opioïde humain (hMOR) en relation avec ses paramètres pharmacologiques et les contraintes de son environnement. Après avoir vérifié la fonctionnalité de T7-EGFP-hMOR dans les SH-SY5Y, sa dynamique latérale a été étudiée par retour de fluorescence après photoblanchiment à rayon variable (FRAPrv) et par suivi de particule unique (SPT). A 22°C ces analyses ont révélé une double compartimentation des récepteurs : dans des domaines perméables de près de 1 µm de rayon et dans des domaines de rayon inférieur à 200 nm. De plus, près d'un tiers des récepteurs présente une diffusion dirigée. Les effets de la variation de température, de la déstabilisation du cytosquelette d'actine et du blocage de l'interaction protéine G/récepteur ont été observés afin de mieux comprendre l'origine de ces domaines. Bien que tous les paramètres qui y participent ne soient pas encore déterminés, les résultats indiquent que les protéines G ainsi que le cytosquelette influencent l'organisation membranaire de hMOR. La fixation d'antagonistes ne modifie pas la diffusion du récepteur. Au contraire celle des agonistes entraînent une diminution de la taille des domaines et un ralentissement des récepteurs en lien avec la transmission du signal et l'internalisation. Nos résultats soulignent l'importance de plusieurs paramètres sur l'organisation dynamique de hMOR et confortent l'intérêt de l'utilisation conjointe du FRAP et du SPT.

L'appareil de Golgi est un organite central du réseau des voies de transport intracellulaire des cellules eucaryotes. L'étude de son fonctionnement dynamique complexe nécessite le développement de nouveaux outils. J'ai donc suivi plusieurs stratégies en parallèle pour proposer de nouvelles approches d'étude de l'appareil de Golgi. <br />Tout d'abord, j'ai utilisé la technique d'Interférence ARN, qui permet d'inhiber l'expression d'une protéine d'intérêt, et ainsi révélé la complexité de la régulation du transport golgien par la GTPase Rab6. <br />Ensuite, j'ai suivi une stratégie reposant sur l'imagerie in vivo du désassemblage et du réassemblage de l'appareil de Golgi au cours de la mitose, et ainsi mis en évidence une étape particulière du désassemblage golgien. <br />Enfin, le cœur de ma thèse a consisté en la production d'anticorps recombinants dirigés contre des protéines golgiennes par Phage Display, et le développement de leur utilisation pour tracer le comportement des protéines-cibles in vivo.

La protéine kinase CK2 est un complexe moléculaire dynamique composé de 2 sous-unités catalytiques α et d'un dimère de sous-unités régulatrices β. La structure cristallographique du dimère de CK2β suggère qu'il représente une plate-forme moléculaire, plaçant la protéine au cœur d'un réseau de voies de signalisation.<br />L'invalidation du gène CK2β chez la souris conduit à un défaut de viabilité des cellules souches embryonnaires (ES). Nous avons pu étudier la fonction de différents domaines fonctionnels in vitro dans un modèle cellulaire reposant sur une stratégie d'invalidation conditionnelle du gène CK2β dans les cellules ES murines. L'abolition de l'expression du gène endogène est létale pour les cellules ES et leur viabilité est restaurée par l'expression exogène de la protéine CK2β sauvage. Ce modèle nous permet d'étudier l'implication de divers domaines de CK2β dans la survie, la prolifération et la différenciation des cellules souches embryonnaires, en remplaçant la protéine endogène par diverses formes mutées de la protéine. <br />Parallèlement, l'invalidation conditionnelle du gène chez la souris ciblée dans les précurseurs neuraux a montré que CK2β est un élément clef dans les voies de signalisation qui contrôlent l'oligodendrogenèse. La différenciation des cellules ES nullizygotes exprimant la protéine exogène sauvage nous a permis de montrer que celle-ci restaure la lignée oligodendrocytaire. Nous avons aussi montré que certains domaines de CK2β, impliqués dans la fonction régulatrice du dimère, sont des déterminants structuraux cruciaux pour la prolifération des cellules souches neurales et leur progression dans la lignée oligodendrocytaire.

Durant cette thèse, nous avons travaillé sur l'adaptation des algorithmes d'inférence grammaticale pour la recherche des propriétés communes à un ensemble de protéines. L'inférence grammaticale positive cherche à générer, à partir d'un ensemble de mots appartenant à un langage cible particulier inconnu, une représentation grammaticale qui est "optimale" par rapport à ce langage, c'est-à-dire qui rassemble et organise les particularités des mots du langage. Nous avons utilisé le diagramme de Taylor, qui classe les acides aminés suivant leurs propriétés physico-chimiques, pour construire, sous forme de treillis, un ordre sur les groupes d'acides aminés. Nous avons aussi développé une méthode d'inférence (SDTM) qui calcule les meilleurs alignements locaux entre les paires de protéines suivant un score fondé à la fois sur cet ordre et sur les propriétés statistiques de l'ensemble de protéines donné. Le résultat est une machine séquentielle proche de celle de Mealy avec des sorties réduites à "accepte" et "rejette". L'algorithme commence par construire le plus grand automate reconnaissant exactement les mots du langage et le généralise par fusions successives des paires de transitions correspondant aux acides aminés appariés dans les alignements sélectionnés. Les expérimentations ont montré l'intérêt de cette combinaison de méthodes importées de la découverte de motifs et de l'inférence grammaticale.

Déterminer la structure 3D des protéines expérimentalement est une tâche très lourde et coûteuse, qui peut s'avérer parfois impossible à réaliser. L'arrivée massive de données provenant des programmes de séquençage à grande échelle impose de passer d'une approche biochimique à une approche bioinformatique, et nécessite en particulier de développer des méthodes de prédiction sur des séquences.<br />Cette thèse propose l'exploration de deux nouvelles pistes pour progresser dans la résolution de prédiction de ponts disulfures dans les protéines. Cette liaison covalente stabilise et contraint fortement la conformation spatiale de la protéine et la connaissance des positions où elle intervient peut réduire considérablement la complexité du problème de la prédiction de la structure 3D. Pour cela, nous utilisons dans un premier temps, l'inférence grammaticale et plus particulièrement les langages de contrôle introduit par Y. Takada, puis dans un deuxième temps, la programmation logique inductive.<br />Diverses expériences visent à confronter un cadre théorique d'apprentissage et des algorithmes généraux d'inférence grammaticale régulière à une application pratique de prédiction d'appariements spécifiques au sein d'une séquence protéique. D'autres expérimentations montrent que la programmation logique inductive donne de bons résultats sur la prédiction de l'état oxydé des cystéines en inférant des règles interprétables par les biologistes. Nous proposons un algorithme d'induction heuristique dont l'idée est d'effectuer plusieurs phases d'apprentissage en tenant compte des résultats obtenus aux phases précédentes permettant ainsi de diminuer considérablement la combinatoire dans les espaces d'hypothèses logiques en construisant des règles de plus en plus discriminantes.

Notre projet porte sur l'étude fonctionnelle du facteur de transcription GATA2 qui contrôle la mise en place de certaines populations neuronales. Mon travail de thèse est basé sur l'étude de sa fonction dans la moelle épinière.<br />Dans la moelle épinière ventrale embryonnaire, les motoneurones et 4 classes d'interneurones V0, V1, V2 et V3 sont générés dans des territoires distincts. Les V2 sont spécifiés dans un territoire adjacent à celui des motoneurones et sont subdivisés en V2a et V2b. Notre but est de déterminer le rôle de Gata2 durant la spécification des V2 et son l'influence sur la prolifération des progéniteurs neuraux.<br />Par une approche de perte et gain de fonction, nous avons montré que :<br />1. Gata2 inhibe la prolifération des progéniteurs neuraux avec un effet cellulaire-non autonome, en induisant un inhibiteur du cycle et en réprimant la voie Notch. Ce contrôle peut être découplé de la différenciation neuronale et ne nécessite pas d'activité proneurale.<br />2. Gata2 joue favorise l'émergence des V2 et réprime la différenciation des motoneurones, par la modulation des voies Shh et TGF-Β. Gata2 participe à la dichotomie des V2 car il favorise la différenciation des V2b et inhibe celle des V2a. Nous avons montré que les V2a sont glutamatergiques et les V2b sont GABAergiques.<br />Cette étude a mis en évidence la complexité des mécanismes moléculaires à l'origine de la diversité neuronale.

La voie de l'aspartate a été étudiée chez le maïs au travers de l'expression des gènes ask1, ask2, akh1 et akh2 codant pour des aspartates kinases, le dosage des acides aminés et le suivi isotopique de l'incorporation du 15N, issu de l'asp-15N, dans les acides aminés dérivés. Il apparaît que la voie de l'aspartate diffère entre deux lignées (lente et rapide) de maïs : une vitesse de germination lente serait associée à un effet inhibiteur de l'accumulation de lysine ou à un contenu limité en thréonine et méthionine. L'étude de l'effet de la lysine, par une recherche de QTLs (T50) en présence d'acides aminés, met en évidence un QTL spécifique à la germination en présence de lysine qui co-localise avec un QTL spécifique à la germination en condition de stress « froid ». L'ensemble des résultats obtenus indique que la teneur en lysine du grain serait en partie responsable de la vitesse de germination

L'athérosclérose est une pathologie artérielle complexe à évolution lente définie par un remodelage de la paroi vasculaire, associée à des réactions inflammatoires, à des processus de prolifération, de mort cellulaire et à une accumulation de lipides oxydés tels que les oxystérols (dérivés oxydés du cholestérol) dont le rôle est fortement suspecté dans le développement de l'athérome.<br /><br />Le travail réalisé a été effectué sur des cellules monocytaires humaines U937 et THP-1, aortiques de rat A7R5 et carcinomateuses humaines MCF-7 (déficientes en caspase-3). Différents oxystérols, présents en quantité importante dans les lésions athéromateuses, ont été utilisés (7-cétocholestérol (7KC), 7Β-hydroxycholestérol, 25-hydroxycholestérol, cholestérol-5Α, 6Α-epoxide, cholestérol-5Β, 6Β-epoxide) ainsi que du cholestérol.<br /><br />La première partie du travail a montré que la mort cellulaire induite par le 7KC est un phénomène complexe présentant des caractéristiques apoptotiques accompagnées d'une synthèse de structures multilamellaires cytoplasmiques appelées corps myéliniques visualisés par microscopie électronique à transmission. La synthèse rapide de ces structures précède les effets cytotoxiques : chute du potentiel membranaire mitochondrial, augmentation de la perméabilité à l'iodure de propidium et modifications de la morphologie nucléaire (condensation, fragmentation, gonflement des noyaux). L'isolement de ces structures par ultracentrifugation après coloration à la monodansylcadavérine (fluorochrome lysosomotropique acide) ou au Nile Red (fluorescence jaune en présence de lipides neutres et rouge en présence de lipides polaires) a permis de montrer qu'elles sont riches en lipides polaires (sphingomyéline, phosphatidylcholine) et en cholestérol et qu'elles accumulent le 7KC. Au sein de ces corps myéliniques, une co-localisation du 7KC avec les lipides polaires a été démontrée par la technique de FRET réalisée par microscopie confocale mono- et bi-photonique. Les caractéristiques morphologiques et biochimiques des figures myéliniques ont permis d'établir que le 7-cétocholestérol est un puissant inducteur de phospholipidose.<br /><br />Compte tenu des modifications lipidiques spatiotemporelles, quantitatives et qualitatives, induites par le 7KC et révélé par le Nile Red, la seconde partie du travail a précisé les relations entre la mort cellulaire, la synthèse de corps myéliniques, l'accumulation de lipides polaires et l'activité caspase. Avec les différents oxystérols étudiés, les corps myéliniques ne sont observés qu'avec des composés cytotoxiques (7KC, 7Β-hydroxycholestérol, cholestérol-5Β, 6Β-epoxide) et leur synthèse est indépendante d'activité caspase. En revanche, l'accumulation de lipides polaires induite par le 7KC est inhibée en présence de z-VAD-fmk (inhibiteurs de caspases large spectre) et de z-VDVAD-fmk (inhibiteur de caspase-2). Certaines caspases et en particulier la caspase-2 pourraient contribuer à l'accumulation de lipides polaires.<br /><br />La troisième partie du travail a conduit à étudier les effets de la Vitamine-E (VitE) sur la mort cellulaire induite par le 7KC en raison de ses propriétés anti-apoptotiques et anti-oxydantes. La VitE protège de la mort cellulaire induite par le 7KC. Les effets protecteurs pourraient en partie être dus à la capacité de la VitE à maintenir fonctionnelle la voie PI3-K/c-Akt en s'opposant aux déphosphorylations de PDK-1 et de c-Akt, et en préservant l'activité PI3-K. Par ailleurs, la VitE s'oppose aux modifications lipidiques au niveau de la membrane cytoplasmique et à l'accumulation de lipides polaires. La VitE réduit aussi la dégradation de la pro-forme de la caspase-2L et augmente les taux d'ARNm correspondants.<br /><br />Ces travaux montrent des relations entre la mort cellulaire induite par des oxystérols et le métabolisme des lipides. Ils révèlent aussi que la VitE protège de la mort induite par le 7KC en agissant au niveau de la voie PI3-K/c-Akt. Par ailleurs, la VitE s'oppose aux modifications lipidiques membranaires et cytoplasmiques associées à la mort cellulaire induite par le 7KC.