Plusieurs études ont clairement démontré l'effet athéroprotecteur de la bilirubine. Par contre, un niveau trop élevé de bilirubine peut causer des effets neurotoxiques. Au niveau de la paroi artérielle, le stress oxydatif entraîne la production des oxystérols qui sont les activateurs endogènes du « Liver X Récepteur » (LXR). Nous avons étudié les effets de l'activation du LXRa sur l'expression de l'enzyme responsable de la glucuronidation de la bilirubine, l'UDP-glucuronosyltransférase (UGT) 1A1 dans le foie. Nous avons identifié de nouveaux éléments de réponse (LXRE) dans le promoteur de l'UGTlAl. Dans des cellules hépatiques, l'activation du LXRa entraîne une augmentation de l'expression et de l'activité de l'UGTlAl. Cet élément de réponse fonctionnel n'est pas conservé chez des rongeurs, ce qui entraîne que cette régulation est limitée aux mammifères supérieurs. En conclusion, nous avons identifié une nouvelle fonction du récepteur nucléaire LXRa qui consistent dans le contrôle de l'expression l'UGTlAl. L'activation du récepteur nucléaire LXRa par les oxystérols permet d'intégrer l'augmentation de la production de la bilirubine au niveau de la paroi d'artère avec une augmentation de l'excrétion hépatique. De plus, l'activation du LXRa par des composantes pharmacologiques, peut être intéressante dans le contexte de l'athérosclérose et de Fhyperbilirubinémie, maladies dans lesquelles la bilirubine joue des rôles importants.

Depuis le début du XXIème siècle, de nombreuses études ont souligné les relations étroites existant entre la voie des récepteurs nucléaires Liver X Receptors (LXRs), leurs gènes cibles et la maladie d'Alzheimer (MA). La stimulation de cette voie est considérée par conséquent comme une approche thérapeutique prometteuse. Cette voie régule de manière complexe et précise l'homéostasie cérébrale du cholestérol et le métabolisme des peptides β-amyloïde (Aβ). Les effets des oxystérols (produits de l'autoxydation du cholestérol) tels que le 24S-hydroxycholestérol (24S-PH-chol) et le 27-hydroxycholestérol (27-OH-chol), tous deux agonistes naturels endogènes des LXRs, sont très largement étudiés à l'échelle neuronale et gliale. Toutefois, peu d'études ont été effectuées sur ces effets au niveau des cellules endothéliales des capillaires cérébraux (CECCs) et des péricytes cérébraux, qui constitue la barrière hémato-encéphalique (BHE), et qui sont d'une part exposées à des flux quotidiens d'oxystérols, et d'autre part impliquées dans les échanges de peptides Aβ entre les compartiments sanguin et cérébral. En utilisant un modèle in vitro de BHE, ces travaux de thèse tendent à mettre en évidence sur l'influence de ces deux oxystérols sur les CECCs et sur les péricytes cérébraux, en se focalisant sur l'expression des gènes cibles des récepteurs LXRs et sur le transport des peptides Aβ. Nos résultats démontrent que le 24S-OH-chol induisent l'expression des transporteurs ATP Binding Cassette sub-familly A member 1 (ABCA1, pour les CECCs et les péricytes) et ABCG1 (seulement au niveau des CECCs), qui corrèle avec une augmentation de l'efflux cellulaire de cholestérol vers les (apo)liprotéines. De plus, ces oxysérols n'exercent aucune influence sur l'accumulation des peptides Aβ dans les péricytes cérébraux, mais diminuent le transport apical-à-basolatéral (influx) des peptides Aβ à travers les CECCs. Cette restriction d'influx est indépendante de la fonction du transporteur ABCA1, et semble être sous l'influence de la P-gp (P-glycoprotéine), pompe d'efflux de la BHE. Ces résultats soulignet l'importance des récepteurs LXRs dans le métabolisme cérébral du cholestérol et les échanges de peptides Aβ, et par conséquent dans la MA. / As several studies have demonstrated a close relationship between Liver X Receptors (LXRs) signalling pathway, their target genes and Alzheimer's disease (AD), stimulation of these nuclear receptors is now considered as a promising therapeutical approach in AD. This pathway strictly regulates brain cholesterol homeostasis and amyloid-β (Aβ) peptide metabolism. Actions of oxysterols such as 24S-hydroxycholesterol (24S-OH-chol) or 27-hydroxycholesterol (27-OH-chol), both known as LXR endogenous agonists, are therefore under intense scrutiny in neurons and glial cells. But little is known in brain capillary endothelial cells (BCECs) and brain pericytes (BPs) which compose the blood-brain barrier (BBB), which are continuously exposed to oxysterols fluxes and are involved in Aβ peptide exchanges between blood and brain. Using an in vitro BBB models, this study aims to highlight the influence of both oxysterols on BCECs and BPs, focusing on their involvement on LXRs target genes expression and on Aβ peptide transport. Our results demonstrate that 24S-OH-chol and 27-OH-chol induced the expression of ATP Binding Cassette sub-family A member 1 (ABCA1, in BCECs and BPs) and ABCG1 (only in BCECs), correlating with an increase of cellular cholesterol efflux to (apo)lipoproteins. Furthermore, these oxysterols do not modify Aβ peptide accumulation in BPs but decrease their influx across the BCECs. This latter process is ABCA1-independent and seems to be mediated by the P-gp (P-glycoprotein) efflux pump. These results highlight the importance of the BBB in the LXR-mediated effects in brain cholesterol metabolism and Aβ peptide clearance and, thus, in AD.

L'athérosclérose est une complication cardiovasculaire majeure des maladies liées à une augmentation du stress oxydatif, comme le diabète de type 2 et le syndrome métabolique. Dans ces situations, les lipoprotéines de faible densité (LDL) subissent une oxydation et leur forte absorption induit une accumulation de cholestérol dans les macrophages sous-endothéliaux. D'autre part, les LDL oxydées sont enrichies en produits d'oxydation du cholestérol appelés oxystérols, dont certains sont impliqués dans la capacité des LDL oxydées à induire un stress oxydant cellulaire et une cytotoxicité, principalement par apoptose. Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP) est un phospholipide unique, localisé préférentiellement dans les endosomes tardifs, compartiment cellulaire clef dans le métabolisme du cholestérol dérivé des LDL. Lors de travaux antérieurs, l'équipe a démontré le rôle prépondérant du BMP dans la régulation de l'homéostasie du cholestérol dans les macrophages. L'objectif de ce travail a été de décrypter les mécanismes moléculaires intervenant dans le trafic intracellulaire du cholestérol. Ainsi, le BMP régule l'efflux de cholestérol par les HDL (high density lipoproteins) grâce à des mécanismes impliquant les LXRs (liver X receptors) et les transporteurs ABCA1/ABCG1 (ATP binding cassette-type A1/G1). De plus, notre étude indique que le BMP exerce également un rôle protecteur contre l'effet pro-apoptotique des LDL oxydées via la réduction de la production intracellulaire d'oxystérols. Comme une partie du trafic intracellulaire des stérols au sein des macrophages est régulé par OSBP (oxysterol binding protein) et ses protéines dérivées, les ORPs (OSBP-related proteins), nous montrons dans ce rapport que l'action de protection du BMP contre les effets cytotoxiques des oxystérols est fortement diminuée dans des cellules où la protéine ORP11 est supprimée, suggérant que le BMP exerce son rôle protecteur via un mécanisme utilisant la fonction d'ORP11 dans le transport intracellulaire de stérols / Atherosclerosis is a major cardiovascular complication in increased oxidative stress-related diseases such as type 2 diabetes and metabolic syndrome. In these situations, the low density lipoproteins (LDL) undergo oxidation and their high uptake induces cholesterol accumulation in subendothelial macrophages. On the other hand, oxidized LDL are enriched in cholesterol oxidation products called oxysterols, some of them are involved in the ability of oxidized LDL to induce cellular oxidative stress and cytotoxicity, mainly by apoptosis. Bis(Monoacylglycero)Phosphate (BMP) is a unique phospholipid localized preferentially in late endosomes, a central cellular compartment of LDL-cholesterol metabolism. In previous work, the team demonstrated the leading role of BMP in regulation of cholesterol homeostasis in macrophages. The aim of this work was to characterize the molecular mechanisms involved in the intracellular trafficking of cholesterol. Thus, BMP regulates cholesterol efflux to HDL (high density lipoproteins) by mechanisms involving liver X receptors (LXRs) and ABCA1/ABCG1 (ATP binding cassette-type A1/G1) transporters. Moreover, we report BMP also exerts a protective role against the pro-apoptotic effect of oxidized LDL via a reduced production of intracellular pro-apoptotic oxysterols.As part of macrophage intracellular sterol traffic is regulated by oxysterol binding protein (OSBP) and OSBP-related proteins (ORPs), we show that protective action of BMP against cytotoxic oxysterol effects in ORP11-silenced cells, was markedly abrogated, suggesting BMP exerts its protective role via a mechanism involving the function of ORP11 in intracellular sterol transport

Le cancer du côlon reste un problème majeur de santé publique puisqu’il constitue en France en 2013 le deuxième cancer en termes de mortalité. La chirurgie, la radiothérapie et les traitements par chimiothérapies classiques secondés par les thérapeutiques ciblées ne constituent pas toujours un arsenal efficace mettant ainsi en évidence la nécessité de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques.Dans ce contexte, nous avons étudié la possibilité soit d’utiliser de nouvelles thérapeutiques (ligands du récepteur Liver X Receptor (LXR)), soit d’améliorer les conditions de traitements classiques (chimiothérapie intrapéritonéale hyperthermique (CHIP)) ainsi que le rôle de la caspase-1 dans ces événements.Nous avons d’abord démontré que les agonistes de LXR, un récepteur nucléaire aux oxystérols, pouvaient activer une mort de type pyroptotique dans les cellules cancéreuses coliques en permettant la construction de l’inflammasome et le clivage de la caspase-1. De plus, nous soulignons le potentiel thérapeutique des agonistes de LXR, puisque nous mettons en évidence une perte de localisation nucléaire du récepteur LXRβ dans les cellules tumorales coliques par rapport aux cellules épithéliales saines qui ne sont pas sensibles à la cytotoxicité des ligands de LXR.Nous démontrons également que la caspase-1 pourrait aussi avoir un rôle dans un modèle in vitro de CHIP lorsque celle-ci associe l’oxaliplatine à l’hypotonie. Cette technique chirurgicale utilisée pour des patients atteints de carcinose péritonéale consiste en l’infusion de chimiothérapie dans la cavité abdominale à 42°C pendant un temps variant généralement de 30 à 60 minutes. Même si cette procédure a permis l’augmentation de la survie chez des patients au pronostic vital sombre, les résultats de notre modélisation in vitro montrent que l’efficacité de la CHIP pourrait être améliorée. / Colon cancer is a major public health matter because it has reached the second rank of cancer mortality in 2013 in France. Surgery, radiotherapy and standard chemotherapies helped by targeted therapies are not often efficient enough, underlying the need of using new therapies.Against this background, we have studied the possibilities to use new therapies (Liver X Receptor (LXR) ligands) or to improve classical treatment conditions (hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (HIPC)) and the implication of caspase-1.We have first demonstrated that the nuclear receptor (LXR) agonists can induce pyroptotic cell death of colon cancer cell lines by inflammasome activation and subsequent caspase-1 cleavage. Moreover LXR agonists can act as a targeted therapy because we show that nuclear localization of LXRβ in normal colon cells turns into a cytoplasmic expression in colon tumor cells leading LXRβ ready to induce pyroptosis by its agonists.We also demonstrated that caspase-1 could have an implication in an in vitro model of HIPC when it associates oxaliplatin and hypotony. This surgery procedure used for patients suffering from peritoneal carcinomatosis involves a 42°C chemotherapy bath inside the abdominal cavity during 30 to 60 minutes. Although HIPC has increased global survival of patients with poor prognosis, the results of our study indicates that HIPC combining oxaliplatin and hypotony could significantly improve the procedure efficacy.

L'athérosclérose est une pathologie artérielle complexe à évolution lente définie par un remodelage de la paroi vasculaire, associée à des réactions inflammatoires, à des processus de prolifération, de mort cellulaire et à une accumulation de lipides oxydés tels que les oxystérols (dérivés oxydés du cholestérol) dont le rôle est fortement suspecté dans le développement de l'athérome.<br /><br />Le travail réalisé a été effectué sur des cellules monocytaires humaines U937 et THP-1, aortiques de rat A7R5 et carcinomateuses humaines MCF-7 (déficientes en caspase-3). Différents oxystérols, présents en quantité importante dans les lésions athéromateuses, ont été utilisés (7-cétocholestérol (7KC), 7Β-hydroxycholestérol, 25-hydroxycholestérol, cholestérol-5Α, 6Α-epoxide, cholestérol-5Β, 6Β-epoxide) ainsi que du cholestérol.<br /><br />La première partie du travail a montré que la mort cellulaire induite par le 7KC est un phénomène complexe présentant des caractéristiques apoptotiques accompagnées d'une synthèse de structures multilamellaires cytoplasmiques appelées corps myéliniques visualisés par microscopie électronique à transmission. La synthèse rapide de ces structures précède les effets cytotoxiques : chute du potentiel membranaire mitochondrial, augmentation de la perméabilité à l'iodure de propidium et modifications de la morphologie nucléaire (condensation, fragmentation, gonflement des noyaux). L'isolement de ces structures par ultracentrifugation après coloration à la monodansylcadavérine (fluorochrome lysosomotropique acide) ou au Nile Red (fluorescence jaune en présence de lipides neutres et rouge en présence de lipides polaires) a permis de montrer qu'elles sont riches en lipides polaires (sphingomyéline, phosphatidylcholine) et en cholestérol et qu'elles accumulent le 7KC. Au sein de ces corps myéliniques, une co-localisation du 7KC avec les lipides polaires a été démontrée par la technique de FRET réalisée par microscopie confocale mono- et bi-photonique. Les caractéristiques morphologiques et biochimiques des figures myéliniques ont permis d'établir que le 7-cétocholestérol est un puissant inducteur de phospholipidose.<br /><br />Compte tenu des modifications lipidiques spatiotemporelles, quantitatives et qualitatives, induites par le 7KC et révélé par le Nile Red, la seconde partie du travail a précisé les relations entre la mort cellulaire, la synthèse de corps myéliniques, l'accumulation de lipides polaires et l'activité caspase. Avec les différents oxystérols étudiés, les corps myéliniques ne sont observés qu'avec des composés cytotoxiques (7KC, 7Β-hydroxycholestérol, cholestérol-5Β, 6Β-epoxide) et leur synthèse est indépendante d'activité caspase. En revanche, l'accumulation de lipides polaires induite par le 7KC est inhibée en présence de z-VAD-fmk (inhibiteurs de caspases large spectre) et de z-VDVAD-fmk (inhibiteur de caspase-2). Certaines caspases et en particulier la caspase-2 pourraient contribuer à l'accumulation de lipides polaires.<br /><br />La troisième partie du travail a conduit à étudier les effets de la Vitamine-E (VitE) sur la mort cellulaire induite par le 7KC en raison de ses propriétés anti-apoptotiques et anti-oxydantes. La VitE protège de la mort cellulaire induite par le 7KC. Les effets protecteurs pourraient en partie être dus à la capacité de la VitE à maintenir fonctionnelle la voie PI3-K/c-Akt en s'opposant aux déphosphorylations de PDK-1 et de c-Akt, et en préservant l'activité PI3-K. Par ailleurs, la VitE s'oppose aux modifications lipidiques au niveau de la membrane cytoplasmique et à l'accumulation de lipides polaires. La VitE réduit aussi la dégradation de la pro-forme de la caspase-2L et augmente les taux d'ARNm correspondants.<br /><br />Ces travaux montrent des relations entre la mort cellulaire induite par des oxystérols et le métabolisme des lipides. Ils révèlent aussi que la VitE protège de la mort induite par le 7KC en agissant au niveau de la voie PI3-K/c-Akt. Par ailleurs, la VitE s'oppose aux modifications lipidiques membranaires et cytoplasmiques associées à la mort cellulaire induite par le 7KC.

L’infarctus du myocarde représente un problème de santé publique dont le traitement de choix consiste à restaurer le flux sanguin (reperfusion) à travers le tissu ischémié dans les plus brefs délais, cependant cette procédure s’accompagne de lésions supplémentaires dont les mécanismes ne sont pas totalement connus. Notre laboratoire a observé que la reperfusion du myocarde s’accompagne d’une accumulation de cholestérol et d’oxystérols dans les mitochondries qui sont impliquées dans l’apparition de ces lésions. L’objectif de ce projet de thèse a donc été d’identifier les mécanismes responsables de cette accumulation. L’utilisation de stratégies cardioprotectrices (statines, exercice physique, ligand de la protéine translocatrice (TSPO)), visant à réduire la concentration cellulaire ou mitochondriale de cholestérol ou le stress oxydant, a tout d’abord permis de mettre en évidence une relation entre l’effet cardioprotecteur et l’inhibition de l’accumulation des stérols mitochondriaux. Cette relation persiste en présence d’une hypercholestérolémie. Par ailleurs, nous avons montré que l’accumulation mitochondriale de cholestérol et d’oxystérols est due à la translocation de la protéine StAR (Steroidogenic Acute Regulatory protein) du cytosol à la mitochondrie dans les premières minutes de la reperfusion et que ce phénomène est modulé par le TSPO. L’inhibition de l’expression mitochondriale de la protéine StAR pourrait représenter une stratégie intéressante afin de protéger le myocarde ischémié de la reperfusion et ce notamment en cas d’hypercholestérolémie. / Myocardial infarction represents a serious public health issue which requires the restoration of the blood flow (reperfusion) in the ischemic tissue as soon as possible; however cardiac reperfusion also induces additional injuries whose mechanisms are not completely established. Our laboratory showed that myocardial infarction induces the accumulation of cholesterol and oxysterols in the mitochondria which are involved in the induction of reperfusion injury. The objective of this thesis project was to identify the mechanisms responsible for this accumulation. The use of cardioprotective strategies (statin, physical exercise, translocator protein (TSPO) ligand), aiming at reducing the cellular and mitochondrial cholesterol concentrations or the oxidative stress, showed the relation between the cardioprotective effect and the inhibition of the mitochondrial sterol accumulation. This relation persists in hypercholesterolemic animals. Furthermore, we showed that the mitochondrial cholesterol and oxysterol accumulation is caused by the translocation of StAR (Steroidogenic Acute Regulatory protein) from cytosol to mitochondria during the first minutes of the reperfusion and this phenomenon is regulated by the TSPO. The inhibition of the mitochondrial expression of StAR could be an interesting approach in order to protect the ischemic myocardium from reperfusion injury, especially in a hypercholesterolemic context.

Des substances toxiques générées par les activités portuaires, urbaines et industrielles sont déversées à certains niveaux du milieu marin côtier marocain. Les mollusques peuvent concentrer les polluants et avoir des effets néfastes sur la santé humaine par l’intermédiaire de la chaîne alimentaire. Malgré le renforcement des mesures de sécurité alimentaire, l’implication de la pollution chimique des aliments dans les troubles métaboliques n’est pas à exclure. Pour prédire l’impact des polluants sur l’écosystème aquatique et sur la santé humaine, le développement d’outils de biosurveillance est nécessaire.Nous avons quantifié les métaux lourds (Cd, Cr et Pb) chez les moules (Mytilus galloprovincialis) issues de la côte atlantique marocaine (site industriel Jorf Lasfar (JL) et site touristique d’Oualidia (OL)) en raison de la proximité d’une plateforme d’extraction de phosphate puis caractérisé leurs profils lipidiques (acides gras, cholestérol, oxystérols, phytostérols et phospholipides). Les extraits lipidiques totaux de moules ont été testés in vivo sur des rats pour déterminer leurs effets sur les paramètres biochimiques plasmatiques et in vitro sur une lignée de cellules β pancréatiques murine (MIN-6) en conditions normo et hyperglycémique. Les effets des extraits de moules JL et OL ont été comparés par rapport à ceux de moules d’origine espagnole (ES) destinées à la consommation en France.Les métaux lourds dans les moules JL dépassent les normes internationales. Les concentrations métalliques dans tous les extraits lipidiques sont à l’état de trace. Les moules JL et OL sont moins riches en acides gras insaturés, plus riches en oxystérols et en phospholipides par rapport aux moules ES, suggérant un stress environnemental. Les extraits lipidiques des moules JL et OL administrés à des rats, ont provoqué une perturbation des paramètres plasmatiques, notamment des taux de glucose, créatinine, triglycérides et transaminases avec une augmentation de cholestérol-HDL. In vitro seuls les extraits lipidiques JL et OL induisent la mort des cellules MIN-6 par un processus non apoptotique. Ce processus est associé à une dépolarisation mitochondriale, une déstabilisation lysosomale et une augmentation de la perméabilité de la membrane cytoplasmique, paramètres mesurés par cytométrie en flux dans une démarche cytomique. Ils provoquent aussi une surproduction de H2O2, une augmentation d’activité catalase, une diminution du glutathion réduit, une peroxydation lipidique et une forte stimulation de la sécrétion d’insuline avec un effet plus marqués en présence des extraits lipidiques JL.Globalement, les lipides de moules JL induisent des effets néfastes in vivo et in vitro par rapport à ceux provenant de OL et ES. Une étude épidémiologique à large échelle dans le contexte des maladies métaboliques pourrait être pertinente chez les populations consommatrices de ces moules. / Toxic substances generated by various human activities are spilled on different area of the Moroccan coast. Shellfishes can concentrate pollutants and have some adverse effects on human health through the food chain. Despite the strengthening of food safety rules, the involvement of chemical pollution of food on metabolic disorders is not known. To predict the impact of pollutants on the aquatic ecosystem and human health, the development of appropriate biomonitoring tools is required.We quantified heavy metals (Cd, Cr and Pb) in mussels (Mytilus galloprovincialis) from two sites of Moroccan Atlantic coast (industrial site Jorf Lasfar (JL) and touristic site Oualidia (OL)) due to the proximity of a phosphate extraction platform, and further characterized their lipid profiles (fatty acids, cholesterol, oxysterols, phospholipids and phytosterols). Total lipid extracts of mussels were tested in vivo in rats to determine their effects on biochemical plasmatic parameters and in vitro on a β pancreatic murine cell line (MIN-6) in normo-and hyperglycemic conditions. The effects of JL and OL mussel extracts were compared to mussels from Spain (ES) used for human consumption in France. Heavy metals in JL mussels exceed international standard level. Metal concentrations in all lipid extracts are present in small quantity. JL and OL mussels are less enriched in unsaturated fatty acids, oxysterols and contain higher levels of phospholipids than ES mussels, suggesting an environmental stress. The lipid extracts of JL and OL mussels administered to rats induce a disruption of plasmatic parameters (glucose, creatinine, transaminases and triglycerides) with an increase of HDL-cholesterol. In vitro, only JL and OL lipid extracts induce MIN-6 cell death by a non-apoptotic process. This process is associated with mitochondrial depolarization, lysosomal destabilization and an increase of the cytoplasmic membrane permeability, parameters measured by flow cytométrie in a cytomic context. They also induce an overproduction of H2O2, an increase of catalase activity, a decrease of reduced glutathion, lipid peroxidation and a strong stimulation of insulin secretion with a more marked effect in presence of JL lipid extracts.Overall, JL mussel lipids induce various side effects in vivo and in vitro, which are more pronounced that those observed with OL and ES. A large-scale epidemiological study could be of interest to confirm the potential side effects of these mussels to favor metabolic disorders.