L'observation que nous avons faite d'une plus grande fréquence de souches de Staphylococcus aureus hypermutables isolées chez les patients atteints de mucoviscidose que chez un panel de souches témoins nous a amené à étudier les mécanismes de l'hypermutabilité chez cette espèce. L'analyse des gènes du système de réparation des mésappariements, mutS et mutL, a montré pour quatre souches cliniques une relation de cause à effet entre l'altération de ces gènes et leur phénotype hypermutable. Nous avons montré que ces gènes étaient co-transcrits chez S. aureus et que l'invalidation de l'un ou l'autre conduisait à un phénotype hypermutable. Nous avons mis au point un modèle pour l'étude de l'effet de ces gènes sur la recombinaison chez S. aureus, qui semble montrer que tous deux n'ont qu'un rôle limité dans le phénomène chez cette espèce. Cette propriété d'hypermutabilité a aussi un impact sur la résistance aux antibiotiques des souches. En effet, la résistance aux antibiotiques du groupe des macrolides est de plus en plus fréquente chez les souches de S. aureus isolées lors de la mucoviscidose, et nous avons montré qu'elle n'était pas due à des gènes de résistance portés par des plasmides ou des transposons mais, de façon très inhabituelle, à des mutations de la cible ribosomale des macrolides. Nous avons ainsi mis en évidence des mutations dans les gènes rrl (codant l'ARN ribosomal), rplD et rplV (codant respectivement les protéines ribosomales L4 et L22).

Le développement érythrocytaire de Plasmodium falciparum, l'agent du paludisme, est responsable de tous les symptômes liés à la maladie. Les formes sanguines du parasite possèdent plusieurs organites qui se sont révélés essentiels au développement intra-érythrocytaire. Parmi ceux-ci, nous nous sommes intéressés à un compartiment tout à fait original connu sous le nom de structures de Maurer. Ce compartiment, qui présente des caractéristiques de Golgi, est localisé dans le cytoplasme de la cellule hôte et assure le transfert de protéines parasitaires à la membrane érythrocytaire. Les structures de Maurer participent notamment au transport des protéines parasitaires liées au phénomène de cytoadhérence, qui est à l'origine du neuropaludisme. Notre travail a de plus permis de montrer leur rôle dans la libération des mérozoïtes infectieux. Nous avons entrepris une étude protéomique et fonctionnelle de ce compartiment afin de mieux comprendre son rôle biologique et d'identifier des enzymes essentielles au parasite, qui pourraient être validées comme cibles chimio-thérapeutiques. Nos études ont identifié dans ces structures la protéine RhopH2 qui semble présenter une activité sérine protéase dont nous poursuivons la caractérisation. Nous avons également, par une approche protéomique globale, identifié près de 50 protéines parasitaires dans des préparations de fantômes de globules rouges parasités, qui contiennent la membrane plasmique et le squelette sous-membranaire érythrocytaire ainsi que les structures de Maurer. Cette étude, ainsi que la caractérisation de l'interaction entre PfSBP1, protéine intégrale de la membrane des structures de Maurer, et LANCL1, protéine du squelette sous membranaire érythrocytaire, permettent de préciser les modalités d'interaction entre structures de Maurer et membrane plasmique de la cellule hôte du parasite. À terme, notre analyse devrait permettre de mieux comprendre le rôle biologique des structures de Maurer ainsi que les voies d'adressage des protéines parasitaires à ce compartiment extracellulaire tout à fait original.

L'extinction post-transcriptionnelle de gènes ou PTGS (Posttranscriptional Gene Silencing) est un phénomène hautement conservé à travers l'évolution. Retrouvé chez des organismes allant des champignons aux vertébrés, ce système reconnaît spécifiquement les molécules de RNA double brin (db) et les dégrade en fragments de 21-23 nt. Chez les plantes, le PTGS pourrait défendre l'organisme contre les infections virales. En réponse à ce mécanisme de défense, un certain nombre de virus codent pour des protéines capables de supprimer le PTGS. Ces protéines dites "suppresseurs" de PTGS, comme les protéines HCPro des potyvirus et 2b des cucumovirus, ne partagent aucune homologie de séquence ni de structure et jouent des rôles différents dans le cycle de multiplication virale. Les résultats obtenus et décrits dans ce mémoire ont permis l'identification et la caractérisation de nouvelles protéines virales impliquées dans la suppression du PTGS, ceci afin de mieux cerner les mécanismes de suppression. Ainsi, nous avons montré que les protéines P15 et P14 de deux virus apparentés, le PCV (Peanut Clump Virus) et le BNYVV (Beet Necrotic Yellow Vein Virus) sont des suppresseurs de PTGS aux propriétés distinctes. En effet, la protéine P15 se localise dans les peroxysomes et semble être active sous une forme multimérique ; quant à la protéine P14, elle se localise dans le cytoplasme et le nucléole et supprime plus faiblement le PTGS. Par ailleurs, nous avons également découvert que la protéine P0 du BWYV (Beet Western Yellows Virus) est un suppresseur de PTGS très efficace hors de son contexte viral. De manière surprenante, son expression est fortement régulée par le virus au cours de l'infection. Enfin, nous avons confirmé que la protéine P0 jouait un rôle de protection du virus contre le PTGS grâce à l'utilisation de plantes transgéniques exprimant la protéine mineure de capside du BWYV. Ce virus déclenche sur ces plantes un PTGS dirigé contre le transgène, sans être affecté.

Un biocapteur à base de fibre optique en verre de chalcogénures, transparente dans un large domaine du moyen infrarouge (MIR), a été développé. Il permet l'enregistrement de spectres MIR par spectroscopie déportée. Le principe de la mesure est basé sur le concept de la spectroscopie par ondes évanescentes. Pour améliorer la sensibilité, les fibres utilisées sont effilées sur quelques centimètres et ont un profil en diamètre de 450-100-450 µm. La zone effilée sera mise en contact avec l'échantillon à analyser. Différents états métaboliques (physiologique ou pathologique) dans le foie et le sérum ont été analysés. Les coupes de foies et les sérums ont été mis directement en contact avec la partie senseur de la fibre, et des spectres MIR ont ainsi été collectés. L'objectif de ces études est d'identifier deux états métaboliques différents (sain et pathologique) d'un même échantillon. Des modifications spectrales peuvent être mises en évidence et reliées à une ou des altération(s) du métabolisme des lipides, glucides et/ou protides. Ces modifications peuvent être des différences d'intensité et/ou des décalages en nombre d'onde de bandes d'absorption. Tous les résultats sont corrélés avec les dosages sanguins et les colorations histologiques des échantillons analysés. Le développement d'un biofilm bactérien a été suivi in situ et en temps réel. Proteus mirabilis est un micro-organisme pathogène, opportuniste des voies urinaires, qui a développé un comportement multi-cellulaires complexe, corrélé dans l'espace et le temps, ce qui lui permet de coloniser de nouvelles surfaces. Durant le processus de différenciation, le changement de l'état végétatif à celui migrant (pathogène) est accompagné par des modifications des constituants membranaires. Les spectres MIR, enregistrés pendant le développement d'un biofilm à P. mirabilis, permettent de détecter en temps réel une contamination de surface, mais aussi les modifications biochimiques des constituants de la membrane bactérienne. Tous les spectres ont été traités par Analyse en Composantes Principales (ACP), d'une part pour une reconnaissance non-supervisée d'une pathologie, et d'autre part, déterminer la distribution spatiale des phénotypes de P. mirabilis au sein du biofilm

Les petites protéines G sont des protéines capables de fixer du GDP ou du GTP, ce qui va induire des changements de conformation au sein de la protéine qui lui permettront d'interagir avec des partenaires cellulaires distincts, et ainsi de jouer un rôle "d'interrupteur moléculaire". Le cycle GDP/GTP des petites protéines G ne fonctionne pas seul, il est régulé par un facteur d'échange GDP/GTP (GEF) et une protéine activatrice de la GTPase (GAP). Les petites protéines G sont impliquées dans des processus cellulaires fondamentaux et divers, comme la différentiation et la prolifération cellulaire, l'organisation et la dynamique du cytosquelette, et les transports intracellulaires. Un certain nombre de structures de petite protéine G sont maintenant connues, et ont permis de définir le repliement général des petites protéines G et les changements de conformation au cours du cycle GDP/GTP. Le premier projet porte sur l'étude structurale par diffraction des rayons X de la petite protéine G Rap2A, homologue de l'oncogène Ras dans un complexe non catalytique avec le GTP. Cette étude a permis de mettre en évidence la présence d'une nouvelle interaction au niveau du site nucléotidique entre la tyrosine 32 et le phosphate gamma du GTP. Et, nous avons montré que les changements de conformation de Rap2A au cours de son cycle GDP/GTP sont caractérisés par deux transitions désordre/ordre. Le second projet porte sur l'étude structurale par diffraction des rayons X de la petite protéine G Arf6 en complexe avec du GDP. Cette étude a montré que deux protéines qui possèdent une forte homologie de séquence peuvent avoir des structures assez différentes pour être distinguées. Les principaux partenaires des formes GDP des petites protéines G sont les GEF, ce qui suggère une base structurale pour la spécificité des GEF. En conclusion, nous discutons des bases structurales qui permettent aux petites protéines G d'être distinguées les unes des autres.

La famille des protéines MIPs est composée de canaux hydriques et de facilitateurs de glycérol. Parmi les canaux hydriques, certains sont sélectivement perm&ables à l'eau, les aquaporines (AQP1, AQP2,...), et les autres sont également perméables aux petits solutés comme le glycérol: les aquaglycéroporines, dont AQP3 fait partie. Nous avons montré dans un premier temps que la perméabilité au glycérol du globule rouge était due à la présence d'AQP3. Dans l'intention de mieux connaître quels étaient les éléments protéiques impliqués dans la sélectivité des protéines MIPs, nous avons construit des chimères entre AQP2 et AQP3. L'une d'entre elle, AQP3-AQP2 Cter, après expression dans l'ovocyte de Xénope, a permis de montrer que la partie C terminale cytoplasmique est impliquée dans le transport d'eau mais pas dans le transport de glycérol d'AQP3. Nous avons également montré que les ovocytes de xénope non matures possédaient des perméabilités à l'eau et au glycérol supérieurs à celles des ovocytes matures suggérant l'expression d'un canal ou d'un transporteur endogène. Enfin, nous avons envisagé de déterminer pour la première fois la structure quaternaire d'une aquaglycéroporine: AQP3. Alors qu'AQP1 dévoile sa forme tétramérique sur gradient de saccharose, après solubilisation en conditions non dénaturantes, AQP3 sédimente dans des fractions plus légères sous forme d'un monomère et d'un dimère très résistant au SDS et aux agents réducteurs hydrophiles. Nous n'avons pu conclure quant à son organisation dans les membranes du fait de son éventuelle sensibilité spécifique aux détergents non dénaturants utilisés. Nous avons donc engagé des études de microscopie électronique de cryofractures de membranes d'ovocytes exprimant AQP1 et AQP3. Nous en avons déduit que la taille d'AQP3 n'était pas suffisamment différente de celle d'AQP1 pour suggérer une organisation membranaire également différente.

Les plantes perçoivent et enregistrent les stimuli environnementaux. Du fait de leur immobilité, elles y répondent principalement par des modifications de leur croissance et de leur morphogenèse. La modification transitoire de la concentration du calcium libre dans divers compartiments cellulaires semble avoir un rôle fondamental dans les mécanismes de perception. Les systèmes de transduction des signaux font aussi intervenir des kinases pour véhiculer l'information jusqu'au noyau cellulaire et générer une réponse spécifique. Dans ce travail nous avons étudié l'effet de stimuli abiotiques (stress mécaniques, de froid ou exposition à des micro-ondes de fréquence 0.9 et 105 GHz à une puissance non thermique) chez le lin (Linum usitatissimum L.) et Arabidopsis thaliana. Chez le lin, le modèle de la production de méristèmes épidermiques hypocotylaires nous a permis d'analyser les effets des différents stimuli en l'absence ou en présence d'inhibiteurs de canaux calciques et de chélateur du calcium. En parallèle nous avons développé l'analyse protéomique de l'hypocotyle de lin. Ainsi, nous avons établi un critère statistique permettant d'améliorer la fiabilité de détermination des changements observés sur une carte protéique obtenue par 2-DE. De plus, afin de déterminer si certains changements observés correspondent à des phosphorylations, nous avons mis au point une nouvelle technique d'analyse par spectrométrie de masse d'ions secondaires permettant de détecter directement la présence de phosphore dans un spot après une séparation électrophorétique et qui pourrait permettre la mise en évidence de phosphorylations difficiles à observer par les méthodes conventionnelles. L'analyse protéomique chez le lin a révélé que 4 protéines au moins interviennent dans la réponse rapide aux stimuli mécaniques, 7 à un choc de froid et 3 à une irradiation à 0.9 GHz. Les effets des inhibiteurs de canaux calciques et de l'EGTA portent sur 5 protéines et ceux d'une déplétion calcique (nécessaire pour induire la formation de méristèmes) sur 7. Cependant 5 parmi ces protéines sont affectées de la même façon par deux à quatre de ces stimuli et ont probablement un rôle fondamental dans le traitement des signaux abiotiques chez le lin. Parmi ces protéines une seule impliquée dans la réponse à un choc de froid a été identifiée comme étant la saccharopine déshydrogénase. L'absence de bases de données sur le lin rend difficile l'identification des protéines modifiées par les stimuli. Ainsi en utilisant le modèle Arabidopsis thaliana nous avons mis en évidence des modifications concernant quatre protéines après un choc de froid et outre ces quatre, deux autres après une irradiation de 2 h à 0.9 GHz. Parmi les protéines modifiées par ces deux stimuli, 2 ont été identifiées : l'anhydrase carbonique et la spermidine synthase. De plus l'une des protéines affectées spécifiquement par le rayonnement à 0.9 GHz est une protéine homologue aux phérophorines. Nous avons ainsi apporté des données nouvelles permettant d'avancer dans la compréhension des phases précoces du traitement des signaux abiotiques chez les plantes. En particulier nous avons montré que, de façon inattendue, les plantes perçoivent le rayonnement électromagnétique dans le domaine des GHz en utilisant probablement les voies de transduction des signaux abiotiques.

Les Lémuriformes utilisés dans cette étude comprennent des représentants de la plupart des genres de Lemuridae (Eulemur, Hapalemur, Varecia), d'Indriidae (Indri, Propithecus, Avahi), de Lepilemuridae, de Cheirogaleidae (Cheirogaleus, Microcebus, Mirza), de Daubentonia. Un sub fossile (Megaladapis edwardsi) est également inclus dans l'analyser, ainsi que deux espèces de Tupaia. Les reconstructions phylogénétiques sont effectuées à partir, soit d'un fragment de 357 bp issu du cytochrome b, soit à partir d'un fragment de 393 bp du 12S rRNA, soit à partir d'une combinaison des deux fragments précédents, en utilisant différentes méthodes (Neighbor-Joining, Maximum Likelihood, Maximum Parsimony, Parsimony Ratchet, Quarter Puzzeling). Ces reconstructions sont comparées par des tests LTR (Likelihood Test Ratio) et des tests 'quatre clusters'. L'arbre phylogénétique les plus 'crédible' est alors: ((Cheirogaleidae, (Indriidae, (Lepilemuridae, Megaladapis)), ((Eulemur, Hapalemur), Varecia)), (Daubentonia, Tupaia)) L'association trouvée entre Daubentonia et Tupaia peut indiquer l'existence de deux colonisations distinctes de Madagascar par les Lemuriformes, l'une ayant donné naissance à la lignée des Daubentonia et l'autre à l'ensemble des autres Strepsirhini malgaches. Le sub fossile Megaladapis edwardsi se trouve groupé avec les Lepilemuridae et cet ensemble apparaît comme le cluster frère de celui formé par les Indriidae. Il a également été possible de montrer que les différentes séquences étudiées évoluaient sous des horloges moléculaires locales. Enfin les dates de divergence des principaux groupes ont pu être déterminées. La séparation la plus ancienne (voisine de 60 millions d'années) est trouvée pour la divergence entre Daubentonia et Tupaia; alors que la plus récente (voisine de 11 millions d'années) est celle impliquant le Megaladapis et les Lepilemuridae. Pour les autres groupes les dates de divergence se répartissent entre 48 et 29 millions d'années.

Détecter des similarités et des homologies entre protéines est une étape cruciale du processus d'annotation des génomes. Afin de détecter des homologies, les alignements de séquences, globaux ou locaux, sont couramment utilisés. Néanmoins, dans la "zone d'ombre", nous devons utiliser les méthodes de reconnaissance de repliements. Dans ce domaine, le problème du "Protein Threading" (PTP) utilise des paramètres pairés pour aligner globalement une séquence de protéine avec une structure de protéine. À notre connaissance, il n'existe pas de méthode d'alignement local utilisant des paramètres pairés. À partir du PTP, nous proposons cinq modélisations mathématiques de ces alignements locaux qui ont été implémentées et testées grâce au logiciel CPLEX 10.0. Nous avons ensuite développé un algorithme dédié permettant de résoudre un de ces modèles. Cet algorithme utilise des techniques connues en recherche opérationnelle : la séparation-évaluation, la descente de sous-gradient et la relaxation lagrangienne. Bien que les alignements locaux soient d'une plus grande complexité, nous montrons qu'ils sont réalisables et qu'ils améliorent la qualité des alignements.

Les cancers du sein sont la première cause de mortalité chez les femmes occidentales. Ces tumeurs solides présentent une grande hétérogénéité associée à une résistance aux traitements et un taux de rechute important à long terme. Ainsi, les cliniciens doivent personnaliser la prise en charge des patientes, ce qui est rendu possible par une meilleure connaissance des causes moléculaires qui participent à l'apparition et à la progression des tumeurs mammaires. Pour ce projet, nous avons choisi d'étudier, dans ces cancers, les éventuelles valeurs pronostique et diagnostique de dicer, gène codant pour la ribonucléase clef du mécanisme d'interférence ARN. Il a été montré une implication de Dicer dans la mise en place de l'hétérochromatine de novo des régions péricentromériques. Encore peu étudiée chez l'homme, les données disponibles chez la levure nous ont permis d'envisager que Dicer pourrait être impliquée dans la régulation de la stabilité chromosomique. Nous avons donc testé les valeurs pronostique et diagnostique de dicer (en PCR quantitative et en Tissue Microarray) dans une centaine d'échantillons de tumeurs, dans des lignées cellulaires et dans des modèles de progression tumorale et métastatique. Parallèlement, nous avons étudié les conséquences d'une inhibition de l'expression de dicer sur le cycle cellulaire et sur la réponse à un stress réplicatif. Nos résultats ont montré que l'expression de dicer est un facteur pronostique indépendant de rechutes métastatiques et est associé avec l'expression des récepteurs hormonaux. Par ailleurs, des cellules n'exprimant pas dicer ont montré des dérégulations du cycle cellulaire et de la voie de réponse aux cassures de l'ADN. En conclusion, l'altération de l'expression de dicer pourrait jouer un rôle dans l'apparition de l'instabilité chromosomique des cancers du sein et son analyse pourrait permettre une meilleure prise en charge des patientes à risque pour une rechute métastatique.