La phytoremédiation constitue une nouvelle technologie permettant de dépolluer les sols contaminés par l'utilisation de plantes. Parmi les différents aspects possibles de cette méthode, figure la phytoextraction basée sur l'absorption et l'accumulation du polluant dans les parties aériennes. Pour être efficace, il est nécessaire de disposer de plantes présentant une biomasse élevée. L'objectif de ce travail visait à sélectionner des variétés de moutarde indienne (Brassica juncea L.) tolérantes et accumulatrices de cadmium.<br />La première partie du travail a consisté à mettre au point et à optimiser une méthode de régénération in vitro de plantes de moutarde indienne, à partir de couches cellulaires minces transversales (CCMTs) (influence de l'organe utilisé, de AgNO3 et de la benzylaminopurine). La régénération a été réalisée en appliquant une pression de sélection par le cadmium pour modifier la tolérance au métal. <br />La deuxième partie aborde l'effet des traitements par le cadmium : in vitro et en serre, sur le développement des plants. Une analyse des perturbations physiologiques et biochimiques observées a permis d'évaluer la tolérance des plants vis à vis du cadmium et indiquent que les plantes néoformées en présence de cadmium mettent en place un système d'exclusion du métal.<br />Dans la troisième partie, pour compléter l'étude précédente sur des plantes néoformées, l'effet du cadmium a été testé sur des plantes de B. juncea directement issues de semis. Plusieurs paramètres physiologiques et biochimiques, caractéristiques des stress, ont été étudiés (activité gaïacol peroxydase, peroxydation des lipides, pigments, acides aminés libres, proline glucides, polyamines libres et conjuguées). En raison de leurs propriétés anti-oxydantes, une attention particulière a été portée aux polyamines dont l'application exogène permet d'envisager son utilisation pour améliorer la capacité d'accumulation du cadmium par les plantes.

Chez les spores de bactéries, le photoproduit le plus abondant formé dans l'ADN irradié par les UV est un dimère de thymines appelé Photoproduit des spores (SP, 5-(a-thyminyl)-5,6-dihydrothymine). Au début de la germination, ce photoproduit est spécifiquement réparé par une enzyme, la Spore Photoproduct Lyase (SPL), régénérant les deux résidus thymine originaux. Cette enzyme est une protéine Fe-S qui appartient à la famille des « Radical-SAM ». Les protéines de cette famille d'enzymes possèdent un centre [4Fe-4S], coordiné par 3 cystéines conservées organisées selon le motif CxxxCxxC, et utilisent la SAdénosylméthionine comme cofacteur. Elles fonctionnent toutes selon un mécanisme <br />radicalaire, initié par la formation du radical 5'-désoxyadénosyle issu de la coupure homolytique de la S-Adénosylméthionine par le centre [4Fe-4S] réduit. Dans ce travail, nous avons effectué une caractérisation biochimique et spectroscopique des SPL de Clostridium acetobutylicum et Bacillus subtilis. Par ailleurs, nous avons synthétisé un substrat minimum sous la forme d'un dinucléoside monophosphate appelé SPTpT, pour lequel une caractérisation structurale par RMN a été réalisée. Le SPTpT est reconnu et efficacement réparé par l'enzyme, ce qui nous a permis d'obtenir de nouvelles informations sur le mécanisme enzymatique de réparation. Enfin, la séquence primaire des SPL contient une 4e cystéine conservée, essentielle à la réparation, mais qui n'est pas impliquée dans la coordination du centre [Fe-S]. Nous nous sommes intéressés au rôle de cette cystéine dans le mécanisme de réparation grâce à l'étude biochimique et enzymatique du mutant SPLC141A.

L'émergence du phénotype MDR (« multidrug resistance») des cellules cancéreuses est souvent corrélée à la surexpression de protéines membranaires appartenant à la superfamille ABC (« ATP binding cassette »). Ces protéines couplent l'hydrolyse de l'ATP au transport d'agents chimiothérapeutiques vers l'extérieur des cellules. Chez les bactéries, des transporteurs homologues ont été impliqués dans certains cas de résistance aux antibiotiques.<br />Deux nouveaux transporteurs ABC bactériens, Rv1747 de Mycobacterium tuberculosis et YheI/YheH de Bacillus subtilis, potentiellement impliqués dans la résistance aux antibiotiques, ont été étudiés ici en réalisant une expression hétérologue chez Escherichia coli et en isolant des vésicules de membrane inversées. Ce système s'est avéré inapproprié pour l'étude du transporteur Rv1747, à cause vraisemblablement des différences entre E. coli et M. tuberculosis dans l'usage des codons. En revanche, nous avons obtenu un degré important de surexpression de YheI/YheH qui nous a permis de caractériser son activité de transport et d'hydrolyse de l'ATP. Nous avons ainsi montré que les deux protéines, YheI et YheH, s'associent pour former un exportateur hétérodimérique capable de transporter de multiples drogues, et que le rôle des deux sous-unités n'est pas identique dans le mécanisme catalytique du transporteur. Enfin, nous avons réussi à purifier le transporteur YheI/YheH avec un rendement élevé et dans un état fonctionnel stable, permettant d'approfondir sa caractérisation biochimique ainsi que d'obtenir des cristaux bidimensionnels pour une étude structurale par microscopie électronique.

Le travail retranscrit dans cette thèse regroupe l'étude de différents processus biologiques impliquant les ARN de transfert. Premièrement, dans le cadre de l'étude du rôle de la protéine de nucléocapside (NC) dans la formation du complexe d'initiation de la transcription inverse du VIH-1, un site de fixation fort et spécifique de la NC a été identifié sur le bras D de l'ARNtLys3 — l'ARNt servant d'amorce à la transcriptase inverse lors de la synthèse du brin d'ADNc(-). Cette fixation permet d'une part la fusion des interactions tertiaires entre les bras T et D de l'ARNtLys3 et pourrait d'autre part être l'un des facteurs déplaçant l'équilibre vers la formation de l'hybride ARNtLys3/ARN viral. L'étude structurale par RMN du complexe NC/bras D s'est heurtée à des problèmes d'échange chimique dans la gamme intermédiaire–rapide de l'échelle de temps spectrale. L'utilisation de séquences de type CPMG–HSQC a permis d'améliorer le rapport signal/bruit des expériences RMN, et particulièrement celui des signaux des résidus de l'interface. Ceci nous a permis d'identifier les résidus de la NC impliqués dans la reconnaissance du bras D. Deuxièmement, la structure de la m1A58 méthyltransférase de T. thermophilus (TrmI) — une enzyme de modification des ARNt — a été résolue par cristallographie et affinée à 1.7 Å. Ceci a permis d'identifier trois résidus potentiellement impliqués dans la catalyse et/ou la reconnaissance du substrat ARNt (D170, Y78 et Y194). La production de variants de TrmI au niveau de ces résidus ainsi que des études d'amarrage moléculaire d'une adénine au site actif ont permis de confirmer cette hypothèse et de proposer un rôle catalytique pour chacun d'eux. Parallèlement, des études par gel natif et par spectrométrie de masse en conditions non dénaturantes ont montré une stoechiométrie 1/2 pour le complexe entre l'enzyme TrmI tétramérique et le substrat ARNt. Troisièmement, la résolution de la structure cristallographique de l'ARNtfMet initiateur d'E. coli a révélé une conformation unique de la région de l'anticodon. Cette conformation unique est associée au paires GC de la tige anticodon, caractéristiques des ARNt initiateurs. Cette conformation particulière — dans laquelle la base A37 ne vient pas s'empiler entre les bases 36 et 38, comme dans tous les ARNt élongateurs — permet de mettre en lumière de nombreux résultats biochimiques de la littérature et suggère un mécanisme par lequel la machinerie de l'initiation de la traduction pourrait discriminer l'ARNt initiateur de tous les ARNt cellulaires.

Les réarrangements chromosomiques sont des mutations qui modifient la structure et l'organisation des génomes. Ils sont ici étudiés dans le cadre de l'évolution des génomes de mammifères. L'objectif de ces travaux est de caractériser les régions du génome qui ont subi de tels évènements; elles sont appelées des points de cassure. Dans un premier temps, nous avons développé une méthode permettant d'identifier précisément ces régions sur un génome par comparaison avec un génome d'espèce différente. Nous montrons qu'elle améliore nettement la résolution par rapport aux méthodes existantes. Cela permet, dans un deuxième temps, d'analyser le contenu des séquences de points de cassure et leur répartition le long du génome. Plusieurs caractéristiques de séquences ont ainsi été identifiées dans les points de cassure chez l'homme, comme la perte de similarité avec les génomes comparés et la présence de duplications et d'éléments transposables. Enfin, nous montrons que les points de cassure ne sont pas répartis uniformément le long du génome, mais leur localisation serait fortement influencée par l'organisation des gènes et la structuration du génome en isochores.

L'intégration de l'ADN viral dans le génome des cellules hôtes est une étape obligatoire du cycle de réplication des rétrovirus. L'intégrase (IN) catalyse le processus global d'intégration en deux étapes distinctes et consécutives. La première des deux réactions, le 3'-processing, consiste en une coupure spécifique d'un dinucléotide au niveau des deux extrémités 3'-OH de l'ADN viral. L'IN transfère ensuite de manière concertée ces deux extrémités au sein de l'ADN cible. Nous avons, par des techniques basées sur l'anisotropie de fluorescence, caractérisé les paramètres structuraux et cinétiques du 3'-processing catalysé par l'IN du VIH-1. Nous avons montré d'une part que cette activité dépend de la taille des complexes IN / ADN. Nous avons trouvé que le dimère d'IN est la forme multimérique la plus active tandis que les complexes de haut poids moléculaire sont relativement peu efficaces. D'autre part, la structuration du domaine N-ter joue un rôle clé dans l'assemblage coopératif de ce dimère en présence de Mg2+ comme cofacteur cationique. Ce rôle n'est pas essentiel en présence de Mn2+. L'étude de l'IN de PFV-1, un spumavirus, plus soluble, nous a permis de mettre en évidence une reconnaissance préférentielle de l'extrémité processée de l'ADN viral par cette IN, cette propriété n'avait jamais été observée pour l'IN du VIH-1 car elle était masquée par sa propension à l'agrégation. Nous avons également montré que ces deux IN rétrovirales réalisent le 3'-processing suivant un mécanisme catalytique lent de type « single turn-over ».

Le virus de la grippe est un virus à ARN négatif de la famille des Orthomyxoviridae et représente l'un des rares virus à ARN à se répliquer dans le noyau. Les particules ribonucléoprotéiques (RNP) contiennent l'ARN viral protégé par les nucléoprotéines (NP) et associé à l'ARN polymérase virale (sous-unités PB1, PB2 et PA). Nous avons étudié, par des techniques de biochimie et de biophysique, l'interaction de la nucléoprotéine non seulement avec l'ARN viral mais aussi avec son transporteur nucléaire humain, l'importine alpha 5. D'autre part, nous avons résolu la structure cristallographique d'un domaine de la polymérase (PB2) en complexe avec l'importine alpha 5. L'ensemble des résultats obtenus nous permet de mieux comprendre les interactions mises en jeu entre protéines virales et protéines de l'hôte et ainsi de comprendre pourquoi certains acides aminés présents dans le virus aviaire augmentent la virulence de la grippe chez l'humain.

L'objectif de cette étude était de comprendre l'influence des saisons sur la variabilité des propriétés mécaniques des papiers recyclés impliquant l'adjonction de charges en amidon importantes, phénomène ayant des répercussions économiques et environnementales défavorables. Plusieurs voies de recherche ont été explorées comme les conditions de stockage des papiers récupérés après collecte, l'influence des températures des eaux de circuit et l'influence du taux et du type d'éléments fins.<br />Pour atteindre ces objectifs, plusieurs outils permettant une observation à l'échelle de la microfibrille de cellulose (10nm) ont été développés ou adaptés (coloration, immunomarquage, PATAg, marquage fluorescent...) couplés à des techniques de microscopie conventionnelle (optique, transmission, balayage, confocal...) afin de mieux comprendre les modifications de la micromorphologie et de l'ultrastructure des fibres en fonction des différents traitements appliqués et d'établir des corrélations avec les variations des propriétés mécaniques des papiers correspondants. Des techniques d'analyse des fibres de bois et de ses composants ont également été utilisées afin d'étudier la morphologie des fibres (analyseur MorFi) ainsi que d'évaluer de manière plus quantitative leurs différents composants (analyse des sucres, chromatographie en phase gazeuse, 13C RMN). La première partie du projet a permis de mettre en place une démarche méthodologique permettant de corréler les observations au niveau ultrastructural et morphologique des fibres et les propriétés mécaniques des papiers fabriqués à partir de celles-ci. L'application de cette méthode nous a permis dans un second temps de montrer que les papiers récupérés par la collecte devaient être stockés de manière plus protégée en hiver par les centres de tri. De même, nous avons pu mettre en évidence la nécessité de réfrigérer les eaux de circuit dans la machine à papier lorsque la fabrication a lieu en été. Enfin, le dernier chapitre a souligné, par la mise en place d'une nouvelle méthode de marquage (PARA-Gold), le fait que le recyclage entraîne la production d'éléments fins aux propriétés de liaison aux fibres diminuées et des solutions pour réactiver ces derniers ont été proposées aux papetiers.

L'acquisition du phénotype de résistance des cancers est souvent corrélée à l'expression de transporteurs membranaires appartenant à la superfamille des transporteurs ABC (« ATP-Binding Cassette »). Un de ces transporteurs, MRP1 (« Multidrug Resistance Protein 1 »), permet l'efflux de nombreux substrats, de type anioniques, conjugués au GSH, glucuronates ou sulfates, ou en co-transport avec le GSH.<br />Dans un premier temps, ce travail a porté sur l'étude des domaines de fixation des nucléotides isolés. Une étude biochimique a montré leur caractère fonctionnel asymétrique concernant les nucléotides, prouvant que seul la séquence primaire de ces NBD est responsable de cette fonctionnalité différentielle. L'étude de la fixation de substrats sur les NBD, a montré que ceux-ci pourraient, de part leur proximité avec les domaines transmembranaires, avoir un rôle dans la fixation des substrats.<br />La deuxième étape de ce travail a concerné la caractérisation de l'activité des énantiomères du vérapamil. Les résultats ont montré que le S-vérapamil est l'isomère responsable de la stimulation du transport du GSH, conduisant à la mort des cellules surexprimant MRP1. Le R-vérapamil est caractérisé comme un inhibiteur de MRP1. Ces résultats ont des répercussions importantes en terme de thérapie.<br />Deux études préliminaires de relation structure/fonction ont été menées en ce qui concerne des dérivés du vérapamil et des dérivés de flavonoïdes, afin de trouver des molécules plus efficaces contre MRP1.

Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire qui appartient au phylum des Apicomplexa. Il est l'agent pathogène de la toxoplasmose. Ce parasite opportuniste est responsable de la toxoplasmose cérébrale chez les individus immunodéprimés et le fœtus. L'interconversion du parasite de la forme tachyzoïte virulente à la forme bradyzoïte quiescente est au centre de la pathogénèse de cette infection. Ce processus repose sur une régulation fine de l'expression des gènes. Des études suggèrent un contrôle transcriptionnel de l'interconversion avec l'expression exclusive de certains gènes dans un stade donné de différenciation parasitaire. Cependant, ce parasite et son phylum se distinguent des autres eucaryotes par un nombre limité de facteurs spécifiques de transcription. Nous avons émis l'hypothèse que le niveau d'expression des gènes de Toxoplasma gondii est étroitement régulé par la structure physique et la nature chimique de la chromatine. Au début de ma thèse, peu de choses étaient connues sur le remodelage de la chromatine chez Toxoplasma gondii. L'ensemble de nos résultats et ceux d'autres équipes, convergent vers l'idée de l'existence d'un « code histone parasitaire » hautement sophistiqué. Pendant ma thèse, nous avons identifié et caractérisé une histone lysine méthyltransférase de la famille de SET8 responsable de la méthylation de H4K20. Le rôle de H4K20-me dans la stabilité du génome est considérée comme une fonction apparue précocement dans l'évolution tandis que son rôle dans l'hétérochromatine est considérée comme une fonction apparue plus tardivement avec la complexification des génomes. Chez Toxoplasma gondii, TgSET8 est capable de mono-, di-, et triméthyler H4K20 ; ce qui la distingue de son homologue humain SET8 qui catalyse exclusivement la monométhylation. La différence d'activité entre les deux enzymes semble reposer sur un seul résidu du site catalytique. TgSET8 et sa marque H4K20-me1 sont régulées au cours du cycle cellulaire et localisent au niveau des régions d'hétérochromatine péricentriques et télomériques chez T. gondii et P. falciparum. L'ensemble de nos résultats montrent que la fonction de SET8 et H4K20 dans l'hétérochromatine n'est pas restreinte aux métazoaires. Nous avons également étudié le rôle de KMTox, une autre histone lysine-méthyltransferase de Toxoplasma gondii. Localisée dans le noyau, elle possède un domaine HMG capable de se lier à l'ADN. Cette enzyme catalyse la méthylation des histones H4 et H2A in vitro, avec une augmentation de l'activité en conditions réductrices. KMTox interagit spécifiquement avec une 2-cys peroxiredoxine-1 typique et l'interaction semble être favorisée en condition oxydative. Parmi d'autres fonctions cellulaires, KMTox semble réguler majoritairement les gènes impliqués dans la réponse antioxydante et le maintien de l'homéostasie cellulaire. Elle pourrait réguler l'expression des gènes chez Toxoplasma gondii par la mis en place d'un remodelage rapide de régions chromatiniennes et contribuer à la mise en place de la réponse antioxydante via son interaction avec le senseur redox TgPrx1.