La première partie de mon travail a consisté (i) en une étude génomique des souches de TOSV avec séquençage de 10 nouvelles souches afin i) d’enrichir les données disponibles dans Genbank (au début de ce travail, 6 séquences complètes); (ii) d’utiliser les 16 séquences complètes pour définir et évaluer le premier système de typage par technique de RT-q PCR en temps réel afin de discriminer les souches de LA et de LB. Dans la deuxième partie de ce projet, on s’est intéressée à des études structurales et fonctionnelles de la nucléoproteine (N) de TOSV afin d’élucider le mécanisme d’encapsidation d’ARN virale. La N est une protéine de 28 KD, sont rôle majeur est l’encapsidation de l’ARN génomique et sert en tant que co-facteur de la transciption/replication de TOSV. Les études crystallographique de la protéine N , du complexe protéique (N-ARN) ont été déterminé par Olal D et al 2014 au moment que nous avons obtenu la diffraction de crystal de la N sans ARN à 3,7 Å (code PDB: 5FVA). Ces études montrent la protéine N ainsi le complexe (N-ARN) en forme d’un anneau hexamèrique fermé alors encapside l'ARN dans une organisation filamenteux. Nous avons donc décidé de combiner ces résultats avec des études structurales complémentaires en solution , telles que la microscopie électronique (EM) et des études de « Diffusion des rayons X aux petits angles »(SAXS) pour de proposer un modèle décrivant correctement le mécanisme d'encapsidation en solution . Le protéine N se comporte principalement en pentamère déformé et ouvert, qui met en lumière la façon dont nucléoprotéine peut être organisée en filaments. / The first part of my work consisted (i) of genomic sequencing of 10 TOSV strains to increase the total number of complete sequences (at the outset, 6 complete sequences were accessible in Genbank). (ii) to use the 16 sequences to design and evaluated the first lineage-specific real-time RT-PCR assay (Lisp-TOSV) to discriminate between strains of lineages A and B Complete sequencing of the 10 strains was achieved. The second part of this project was dedicated for structural and functional studies of the TOSV N protein in order to decipher viral RNA encapsidation. TOSV Nucleoprotein (N) is a protein of 28 KD, is encapsidating the viral RNA genome and serves as a co-factor the RNA trancription/replication. The crystal structures of TOSV N protein , and the complex N-RNA were already determined (Olal D and al; 2014) while we just obtained diffracting crystal of the N free RNA at 3,7 Å (PDB code : 5FVA ). Crystallographic structures show an hexameric rings whereas N encapsidates the RNA in a filamentous organization. We therefore decided to combine these results with complementary studies, such as electron microscopy (EM) and samll angle X-ray scattering to build a low resolution structure model in solution describing properly the encapsidation mechanism. The N behaves mainly as an opened, deformed pentamer that shed light on how the N can be organized in filaments.

Les virus Nipah (NiV) et Hendra (HeV) appartiennent au genre Henipavirus au sein de la famille des Paramyxoviridae. Cette famille comporte de nombreux pathogènes tel que le virus de la rougeole (MeV). Les paramyxovirus possèdent un génome de type ARN simple brin encapsidé par la nucléoprotéine (N) au sein d'une nucléocapside hélicoïdale. N interagit avec la phosphoprotéine (P) et cette dernière recrute la polymérase (L) qui assure la transcription et la réplication du génome viral. L'objectif de mon projet de thèse était de caractériser les protéines N et P ainsi que les interactions qui existent entre elles chez les trois virus, NiV, HeV et MeV. A la différence du MeV, qui a été intensivement étudié au cours des dernières années, les données moléculaires et structurales sur les Henipavirus étaient très limitées. A l'aide d'analyses computationnelles, nous avons pu déchiffrer l'organisation modulaire de N et de P, et nous avons montré que les régions, C-terminale de N (NTAIL) et N-terminale de P (PNT), sont prédites comme intrinsèquement désordonnées (RIDs). Les RIDs sont des régions fonctionnelles dépourvues de structures secondaires et tertiaires stables dans des conditions physiologiques. En utilisant des approches biochimiques et biophysiques, nous avons confirmé que NTAIL et PNT sont désordonnées. Elles conservent toutefois des structures secondaires transitoires qui pourraient correspondre à des éléments de reconnaissance moléculaire (ou MoREs) impliqués dans de transitions structurales en présence d'un partenaire. / The Paramyxoviridae family includes many important human and animal pathogens, such as measles virus (MeV), a morbillivirus, and the emerging Nipah (NiV) and Hendra (HeV) viruses, members of the Henipavirus genus. Paramyxoviruses possess a negative-strand RNA genome that is encapsidated by the nucleoprotein (N) into a helical nucleocapsid. N interacts with the phosphoprotein (P), and this latter recruits the polymerase that ensures genome replication and transcription. My PhD project has mainly focused on the characterization of the N and P proteins and on the interactions between these two proteins from the three cognate viruses, namely NiV, HeV and MeV. While MeV has been extensively studied through the past years, structural and molecular information on Henipavirus N and P proteins were rather scarce. Using computational analyses, we deciphered the modular organization of Henipavirus N and P. Intrinsically disordered regions (IDRs) were predicted within these proteins, notably at the C-terminus of N (referred to as NTAIL), and at the N-terminus of P (referred to as PNT). IDRs are functional despite they lack of a well-defined 3-D structure under physiological conditions. Biochemical and biophysical approaches pointed out a mostly disordered state for both NTAIL and PNT, although they were shown to contain short-order prone segments (i.e. molecular recognition elements, MoREs). These latter are involved in partner recognition and in disorder-to-order transitions. The C-terminal domains of the P proteins (referred to as PXD) were found to bind to NTAIL and to induce an α-helical transition thereof.

Le virus de la grippe appartient à la famille des Orthomyxoviridae. Son génome est segmenté en huit ribonucléoprotéines virales (vRNPS) composées chacune d'une molécule d'ARN négatif simple brin recouverte de nucléoprotéines (NP) et associée au complexe de la polymérase. Le virus entre dans<br />la cellule hôte par endocytose, libère dans le cytoplasme ses vRNPs qui gagnent ensuite le noyau cellulaire pour être transcrites et répliquées. Les vRNPs sont importées via l'hétérocomplexe des importines alpha/beta. La NP, composant majoritaire des vRNPs, pourrait être impliquée dans cette étape et serait aussi un candidat idéal dans la mise au point de drogues antivirales. Nous avons voulu déterminer les caractéristiques structurales de <br />NP en complexe avec l'importine alpha 5 humaine. Grâce à la technique de microscopie électronique à transmission, nous avons obtenu un premier <br />modèle à basse résolution du complexe NP/importine alpha.<br />Dans le noyau, les vRNPs sont étroitement liées à la chromatine. En phase tardive du cycle viral, la protéine matricielle M1 se lierait aussi à la chromatine, peut-être pour décrocher les vRNPs. Nous avons pu montrer, par la technique de sédimentation, que les vRNPs se lient aux queues des histones, alors que M1 se fixe sur le domaine globulaire des octamères d'histones.<br />En fin de cycle viral, les vRNPs amplifiées sortent du noyau. Nos tests enzymatiques, d'interaction sur billes et en sédimentation montrent que les protéines virales M1 et NEP servent d'adaptateurs entre les vRNPs et le système d'export nucléaire CRM1/RanGTP. Nous avons aussi obtenu la <br />structure cristallographique du domaine C-terminal de NEP se liant à M1.

Le virus de la grippe est un virus à ARN négatif de la famille des Orthomyxoviridae et représente l'un des rares virus à ARN à se répliquer dans le noyau. Les particules ribonucléoprotéiques (RNP) contiennent l'ARN viral protégé par les nucléoprotéines (NP) et associé à l'ARN polymérase virale (sous-unités PB1, PB2 et PA). Nous avons étudié, par des techniques de biochimie et de biophysique, l'interaction de la nucléoprotéine non seulement avec l'ARN viral mais aussi avec son transporteur nucléaire humain, l'importine alpha 5. D'autre part, nous avons résolu la structure cristallographique d'un domaine de la polymérase (PB2) en complexe avec l'importine alpha 5. L'ensemble des résultats obtenus nous permet de mieux comprendre les interactions mises en jeu entre protéines virales et protéines de l'hôte et ainsi de comprendre pourquoi certains acides aminés présents dans le virus aviaire augmentent la virulence de la grippe chez l'humain.

Le virus de la rougeole est un virus à ARN négatif, membre de la famille des Paramyxoviridae. Le complexe de réplication viral comprend trois protéines principales : la polymérase à ARN ARN-dépendante (L), la nucléoprotéine (N) et la phosphoprotéine (P). Cette thèse présente une étude structurale, par des méthodes biochimiques et biophysiques, de la phosphoprotéine et de la nucléoprotéine produites dans la bactérie Escherichia coli. J'ai étudié les déterminants de la polymérisation de N et identifié un variant intéressant pour l'étude de N par cristallographie aux rayons X. J'ai aussi mis au point la purification d'un complexe de N et P, prélude à son étude structurale. Par ailleurs, j'ai montré que la partie N-terminale de P est intrinsèquement désordonnée. J'ai pu étendre ce résultat aux protéines P de nombreux virus apparentés par une étude bio-informatique. J'ai ensuite démontré l'importance du désordre structural au sein du complexe réplicatif des Paramyxoviridae #à la fois par son abondance et d'un point de vue fonctionnel#. Au-delà de leur intérêt pratique immédiat, ces résultats indiquent que la machinerie réplicative de ces virus pourrait constituer un système modèle pour l'étude du désordre structural dans les protéines. De plus, ils soulèvent de nombreuses questions et sont donc un prélude à une refonte de notre vision du complexe réplicatif de ces virus dont l'étude revêt une importance majeure en santé humaine.

Le virus de la rage appartient à l'ordre des Mononegavirales. Ces virus sont enveloppés, et leur génome est<br />composé d'une seule molécule d'ARN de polarité négative. Dans le cas du virus de la rage, cet ARN encode<br />cinq protéines virales dont la nucléoprotéine (N) qui est fortement impliquée dans la réplication et la<br />transcription du virus. L'objectif de mon travail de thèse consistait à obtenir des informations structurales à<br />la meilleure résolution possible sur la nucléoprotéine (N) du virus de la rage, ceci afin de mieux comprendre<br />les mécanismes impliqués dans la multiplication virale. La nucléoprotéine existe sous deux formes : en<br />complexe « soluble » avec la phosphoprotéine (P), ou associée à l'ARN viral. Le complexe N-ARN viral est<br />la matrice utilisée par l'ARN-polymérase pour effectuer la transcription et la réplication. Il est possible de<br />produire de manière recombinante des complexes N-ARN en forme d'anneaux composés d'un nombre de<br />nucléoprotéines allant de 9 à 15 sous-unités par complexe. La mise au point d'une technique biochimique<br />pour purifier ces différentes espèces suivie d'études en microscopie électronique et en cristallographie aux<br />rayons X ont conduit à l'obtention d'un modèle atomique à une résolution de 3.5 Å. L'ultrastructure du<br />complexe dont la structure a été résolue est formée par l'association entre 11 nucléoprotéines et un brin<br />d'ARN de 99 bases. Il s'agit de la première structure de nucléoprotéine d'un virus à ARN négatif associée à<br />son substrat, l'ARN. Cette structure permet de constater que la nucléoprotéine séquestre étroitement l'ARN<br />limitant ainsi la formation d'ARN double brin et le protégeant de la réponse immunitaire innée. Pour devenir<br />accessible à la polymérase virale, l'ARN génomique du virus de la rage doit être dissocié localement de<br />quelques protomères de nucléoprotéine. Ce mode de fonctionnement spécifique existe probablement pour<br />d'autres virus comme celui de la rougeole, Ebola ou la grippe, responsables eux aussi de pathologies<br />humaines graves. La nucléoprotéine est une cible antivirale intéressante puisqu'elle n'existe qu'au sein des<br />virus.

Le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) et le virus Nipah (NiV) appartiennent respectivement aux familles des Rhabdoviridae et des Paramyxoviridae. VSV est un modèle du virus de la rage tandis que NiV est un virus émergeant, appartenant à la sous-famille des Paramyxovirinae, pour lequel les données moléculaires et structurales sont limitées. Ces sont des virus enveloppés dont le génome code pour cinq à neuf protéines. Le complexe de réplication de ces virus est constitué de trois protéines : la phosphoprotéine (P), la nucléoprotéine (N) et la polymérase virale (L). La N encapside le génome viral et l'ensemble N-ARN sert de matrice pour la transcription et la réplication. La P joue deux rôles : elle sert de cofacteur pour la polymérase et forme le complexe N0-P qui maintient la N sous une forme soluble, compétente pour l'encapsidation des génomes néo-synthétisés. Un premier objectif de mon travail de thèse consistait à étudier la structure et la dynamique des protéines P de VSV et de NiV. Ce sont des protéines modulaires qui contiennent des domaines structurés, séparés par des régions flexibles. A mon arrivée au laboratoire un travail important avait été déjà réalisé sur la P de VSV et j'ai participé à l'achèvement de cette étude. Je me suis ensuite intéressé à la protéine P de NiV. J'ai cristallisé et résolu par diffraction des rayons X les structures du domaine C-terminal et du domaine central (codes PDB : 4F9X et 4GJW). La combinaison de ces modèles cristallographiques avec des données de SAXS sur la P entière et des données de résonance magnétique nucléaire (RMN, collaboration IBS) va permettre d'obtenir un modèle atomique de la P entière sous la forme d'un ensemble de conformères. Un deuxième objectif était d'étudier les complexes N0-P. J'ai activement participé au développement de la méthode de reconstitution et à la caractérisation structurale du complexe N0-P de VSV, entre un mutant de la N (NΔ21) et un peptide N-terminal de la P (code PDB : 3PMK). J'ai ensuite reconstitué, cristallisé et résolu la structure de complexe N0-P de NiV entre la N (tronquée de son domaine C-terminal) et la partie N-terminale de la P. Ces structures montrent par quel mécanismes moléculaires la P maintien la N sous forme monomérique, en empêchant sa polymérisation et son interaction avec l'ARN. Les résultats présentés ici ont permis de générer de nouvelles hypothèses pour expliquer les mécanismes d'encapsidation et d'initiation de la synthèse d'ARN chez ces virus. Le complexe N0-P étant essentiel pour la réplication du virus, l'information structurale obtenue au cours de ce travail devrait permettre d'envisager l'utilisation de ce complexe comme cible pour le développement de composés antiviraux. / Abstract Vesicular stomatitis virus (VSV) and Nipah virus (NiV) belong to the Rhabdoviridae and Paramyxoviridae families, respectively. VSV serves as model system for rabies virus while NiV is an emerging pathogen of the Paramyxovirinae subfamily, for which molecular and structural data are scarce. Both viruses are enveloped and their genomes encode five to nine proteins. Three proteins form their replication complex: the phosphoprotein (P), the nucleoprotein (N) and the viral polymerase (L). N encapsidates the viral genome and this N-RNA complex serves as template for transcription and replication. P has two functions: it serves as a polymerase cofactor and forms an N0-P complex, which keeps the N protein in a soluble and monomeric state, competent for the encapsidation of the newly synthesized genomes. The first goal during the PhD work was to study the structure and dynamics of the VSV and NiV P proteins. These proteins are modular, containing structured domains separated by flexible regions. Before my arrival, a large amount of work was already done on the VSV P protein in the lab and I was involved in the final stages of this work. Then this I studied the NiV P protein, crystallizing and solving the structures of its Central and C-terminal domains by X-ray crystallography (PDB codes: 4F9X and 4GJW). Combining these structures with small angle X-ray scattering (SAXS) and nuclear magnetic resonance (NMR, collaboration with IBS group) data obtained for the entire protein will allow the construction of an atomic model of the phosphoprotein in the form of a conformational ensemble. The second goal was to study the N0-P complex. I actively participated in the development of the method which permitted the reconstruction of the VSV N0-P complex, using a truncation mutant of the N protein (NΔ21) and an N-terminal peptide from P, and to its structural determination (PDB code: 3PMK). Then I reconstructed, crystallized and solved the structure of the NiV N0-P complex using a C-terminally truncated N protein and the N-terminal region of the P protein. Both structures yielded insights into the molecular mechanisms used by the phosphoproteins in order to maintain the corresponding nucleoproteins in their monomeric state, thus inhibiting their polymerization and interaction with RNA. The results presented here also offered new hypothesis about mechanisms of encapsidation and of RNA synthesis initiation. Given that the N0-P complex is an essential component of the replication complex, the structural information gained from this work allow us to consider this complex as a potential antiviral target.

Le virus respiratoire syncytial humain (hRSV) est le principal agent pathogène responsable des bronchiolites. Le complexe ARN polymérase (RdRp), du hRSV, nécessaire à la réplication de son génome, est composé a minima de la sous-unité catalytique (L), de son principal cofacteur qu’est la phosphoprotéine (P) et de la nucléoprotéine (N) qui assure l’encapsidation du génome viral. Le cœur de mon projet doctoral a été l’étude dynamique et structurale de domaines des protéines N et P du hRSV ainsi que leurs interactions avec certaines protéines cellulaires principalement par résonance magnétique nucléaire.Dans un premier temps j’ai étudié une potentielle interaction entre 2 domaines appartenant à la protéine N et à la protéine cellulaire Tax1BP1 impliquée notamment dans la régulation de l’autophagie. Ensuite, j’ai entrepris une étude structurale et dynamique de hRSV-P isolée notamment dans le but de déterminer des contacts transitoires au sein de la protéine et d’obtenir la structure tridimensionnelle du domaine d’oligomérisation de P. Enfin, j'ai participé à la caractérisation de l’interaction entre la protéine hRSV-P et le cofacteur de transcription du hRSV hRSV-M2-1, puis entre hRSV P et la phosphatase cellulaire PP1α, afin d’en cartographier les régions de contacts. / Human respiratory syncytial virus (hRSV) is the main pathogen responsible for bronchiolitis. The RNA polymerase complex (RdRp) of hRSV, necessary for the replication of its genome, is composed at least of the catalytic subunit (L), its main cofactor phosphoprotein (P) and nucleoprotein (N), which encapsidates the viral genome. At the heart of my doctoral project was the dynamic and structural study of domains of the proteins N and P of the hRSV as well as of their interactions with several cellular proteins, mainly by nuclear magnetic resonance.Firstly, I studied a potential interaction between 2 domains belonging to the N protein and to the Tax1BP1 cellular protein involved notably in regulation of autophagy. Secondly, I undertook a structural and dynamic study of isolated hRSV-P in order to determine transient contacts within the protein and to obtain the three-dimensional structure of the P oligomerization domain. Last, I participated in the characterization of the interaction between the hRSV-P protein and the hRSV transcription cofactor hRSV-M2-1, and between hRSV P and the cellular phosphatase PP1α to map the contact regions.

Les virus Nipah (NiV) et Hendra (HeV) sont des paramyxovirus zoonotiques appartenant au genre Henipavirus. Les paramyxovirus possèdent un génome ARN simple brin de polarité négative encapsidé par la nucléoprotéine (N) au sein d’une nucléocapside hélicoïdale. Cette dernière sert de substrat pour la transcription et la réplication, réalisées par la polymérase virale qui consiste en un complexe entre la protéine L et la phosphoprotéine (P). A l’aide d’approches biophysiques, j’ai établit une cartographie de l’interaction entre la région C-terminale désordonnée de N (NTAIL) et la région C-terminale de P (PXD) chez NiV, HeV et MeV. L’observation à l’échelle atomique par RMN a confirmé l’intervention d’un élément de reconnaissance moléculaire (MoRE) qui subit un repliement α-hélical au contact de PXD. J’ai également montré la capacité des domaines NTAIL et PXD des henipavirus à former des complexes hétérologues soulignant leur proximité structurale. L’interaction NTAIL-PXD, cruciale pour le recrutement de la polymérase virale constitue une cible idéale pour des approches antivirales. Ainsi, un test de criblage à haut débit par HTRF a été mis en place dans le but d’identifier des inhibiteurs. Enfin, une approche structurale a révélé une organisation trimérique de la protéine P de NiV et HeV en solution. La résolution de la structure cristalline de la région de tétramérisation de P du virus de la rougeole montre la présence d’une région désordonnée à proximité du site putatif de recrutement de L. Collectivement, ces résultats représentent une étape clé vers l’élucidation du l’impact fonctionnel de l’oligomérisation de la protéine P sur le cycle réplicatif des paramyxovirus. / Nipah (NiV) and Hendra (HeV) viruses are zoonotic paramyxoviruses that belong to the Henipavirus genus. Paramyxoviruses possess a single-stranded negative-sense RNA genome that is encapsidated by the nucleoprotein (N) into a helical nucleocapsid. This latter is the substrate for both transcription and replication that are carried out by the polymerase, consisting of a complex between the large protein (L) and the phosphoprotein (P). Using various biophysical approaches, I was able to map the interaction between the C-terminal disordered region of N (NTAIL) and the C-terminal region of P (PXD) in NiV, HeV and MeV. Atomic resolution description of the HeV NTAIL-PXD interaction by NMR confirms the involvement of a molecular recognition element (MoRE) of α−helical nature in binding to PXD. I also showed that Henipavirus NTAIL-PXD form heterologous complexes, involving a structural similarity. As this interaction is crucial for the recruitment of the viral polymerase, it is a promising target for antiviral approaches. This prompted me to set up a protein-protein interaction (PPI) assay based on the HTRF technology to identify inhibitors. Finally, I provided the first experimental evidence of a trimeric organization of P proteins in NiV and HeV. We also solved the crystal structure of two different forms of MeV P tetramerization domain who unveiled the presence of a disordered region located near the putative L-binding site and reveal significant structural variations in coiled-coils organization. Collectively, these results represent a key step towards the elucidation of the functional impact of P protein oligomerization on the replicative cycle of paramyxoviruses.

Le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) sert de modèle pour l'étude de la multiplication des virus (Mononegavirales) alors que la rage(RV) reste un sérieux problème de santé publique. Le génome de VSV et RV code notamment la nucléoprotéine (N) et la phosphoprotéine (P). N s'associe étroitement à l'ARN viral. Ce complexe N-ARN sert de matrice pour la réplication et la transcription virale. P est le cofacteur de la polymérase virale (L) et chaperonne N. En interagissant avec N-ARN (domaine C-terminal) et avec L (domaine N-terminal), P assure le lien physique entre l'ARN viral et L. La stœchiométrie de P, sa structure et son rôle exact pendant la transcription et la réplication restent incertains. Mon travail a consisté à une caractérisation biophysique et structurale de P et des complexes N-ARN-P pour mieux comprendre la dynamique du complexe de réplication de ces virus.<br />L'analyse biophysique montre que P RV & VSV existent sous forme de dimère allongé en solution. L'analyse bioinformatique a révélé une organisation modulaire, confirmé par des études biochimiques et biophysiques de mutants de P RV. La structure du domaine C-terminal de P VSV a été résolue par RMN et montre une homologie celle du C-ter de P RV. La caractérisation de l'interaction entre P et les anneaux N-ARN a révélé l'existence de deux types de complexes N-ARN-P (contenant un et 2 dimères de P par anneau). L'étude par ME des complexes nucléocapsides-P a permis de mettre en évidence un changement de conformation important.<br />Pour devenir accessible à L, l'ARN viral doit se dissocier localement de N. L'interaction N-ARN-P représente potentiellement une nouvelle cible pour le développement d'antiviraux.