Une altération de l’épissage alternatif est impliquée dans certaines pathologies telles que la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1). La DM1 est une maladie génétique multisystémique appartenant à la famille des maladies à expansion de triplets. En effet, bien que non traduites, les expansions CUG localisées en 3’ des transcrits DMPK répriment l’exportation nucléaire de ces transcrits. Ce phénomène entraine notamment une dérégulation de l’activité de plusieurs facteurs régulateurs d’épissage parmi lesquels les familles CELF (CUGBP and ETR-3 like factor) et MBNL (MuscleBlind like). Cette dérégulation aboutit à un défaut d’épissage alternatif de nombreux transcrits, en particulier dans les muscles squelettiques, le cœur et le cerveau. On compte parmi ces transcrits dérégulés celui du gène MAPT codant pour les protéines Tau. Six isoformes de Tau, issues de l’épissage alternatif des exons 2, 3 et 10, sont principalement exprimées dans le cerveau adulte humain. Dans le cerveau DM1, ces exons sont préférentiellement exclus.La régulation et la dérégulation de l’épissage alternatif de l’exon 2 de Tau dans la DM1 peuvent être étudiées via l’utilisation de minigènes. Ces minigènes sont constitués de séquences Tau plus ou moins délétées insérées dans un vecteur plasmidique. Nous avons démontré que la nature de ce vecteur a une influence sur l’épissage. La construction de différents minigènes a donc permis de sélectionner celui le plus adapté à la recherche des séquences cis régulatrices de Tau. L’étude de ces minigènes démontre l’existence d’éléments cis répresseurs éloignés de l’exon, entre les nucléotides +500 et +2100 en aval de l’exon 2. Par contre, les éléments ciblés par les répétitions CTG dans la DM1 sont proximaux à l’exon 2, dans les 250 pb de part et d’autre de l’exon. Dans ces expansions CTG peuvent être séquestrés certains facteurs d’épissage tels que ceux de la famille MBNL. Dans notre modèle cellulaire, l’extinction de l’expression de MBNL1 ou l’utilisation de minigènes mutants MBNL démontrent que ces facteurs sont impliqués dans la régulation et la dérégulation de l’épissage de l’exon 2 de Tau. De plus, la surexpression de MBNL2 restaure un épissage normal de l’exon 2 en présence de la mutation DM1. Cette restauration est augmentée lorsque MBNL1 est également surexprimé suggérant un effet synergique de ces deux facteurs. Par la suite, nous avons étudié l’intervention d’autres familles de facteurs ubiquitaires ou impliqués dans les pathologies à expansion de triplets. Les facteurs conduisant à la dérégulation de l’exon 10 dans la DM1 n’étant que très peu connus, l’épissage du transcrit de Tau endogène a été analysé afin d’étudier à la fois les exons 2 et 10. Ainsi, de nouveaux facteurs impliqués dans la régulation de l’exon 2 (CELF2, 4 et 6, PTB1 et 2, Sam68, MBNL2) et de l’exon 10 (Sam68, MBNL2, Fox 1 et 2) ont été identifiés. Pour la première fois, l’implication des facteurs CELF5, SC35, SRp20, SRp75, 9G8 pour l’exon 2 et CELF3, hnRNPA1 et Fox1 pour l’exon 10 dans la restauration d’un épissage normal en présence de la mutation DM1 a été identifiée. En conclusion, les exons 2 et 10 de Tau, bien que tous deux dérégulés dans la DM1, sont régulés et dérégulés de façon différente. / Myotonic Dystrophy Type 1 (DM1) belongs to the group of pathologies referred as misregulated alternative splicing or spliceopathies. DM1 is a multisystemic inherited disease characterized by an unstable CTG-repeat expansion in the 3’ UTR of the DMPK gene. These CUG expansions are not translated, but they inhibit nuclear exportation of DMPK transcripts modifying in this way, the pool of available splicing regulating factors like CELF (CUGBP and ETR-3 like factor) and MBNL (Muscleblind Like) families. This deregulation leads to a default of alternative splicing of numerous transcripts, particularly in skeletal muscle, heart and brain. Beyond them, we focus on RNA from the microtubule-associated protein Tau (MAPT). In human brain, six Tau RNA variants have been described from alternative splicing of exons 2, 3 and 10. In DM1 brains, it has been reported a repression of the inclusion of these exons. The functionality of alternative splicing of Tau exon 2 in DM1 can be studied by the use of minigenes. These minigenes are constituted of Tau sequences more or less deleted, inserted in a plasmidic vector. We demonstrated that the nature of the vector has an influence on splicing. The construction of different minigenes permit to choose the one more adaptated to the research of cis-elements involved in both normal and pathological splicing of Tau RNAs. So, cis elements implicated in regulation of Tau exon 2 are distant of the exon (between nucleotides +500 and +2100 upstream exon 2). On the over hand, cis elements targeted by CUG repetitions in DM1 are close to exon 2 (in 25O nucleotides around exon 2). In this CUG expansions, some splicing factors like MBNL family members can be sequestered. In our cellular model, extinction of expression of MBNL1 and the use of minigenes mutants for MBNL sites show that these factors are implicated in both regulation and deregulation of Tau exon 2 alternative splicing. Moreover, over-expression of MBNL2 can restore a normal Tau exon 2 splicing in presence of DM1 mutation. This restoration is increased when MBNL1 is also over-expressed, suggesting a synergic effect between MBNL1 and MBNL2. Secondly, we studied the involvement of other families of splicing factors such as ubiquitary factors (SR, hnRNP) or factors implicated in others pathologies with triplets expansions (p68, Sam68, Fox). Exon 10 deregulation was very studied in FTDP-17 (Frontotemporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17) but not in DM1. So, Tau endogene has been analysed to study both exon 2 and 10. So, new factors implicated in regulation of exon 2 (CELF2, 4, 6, PTB1 and 2, Sam68, MBNL2) and 10 (Sam68, MBNL2, Fox 1 and 2) were identified. For the first time, the implication of the factors CELF5, SC35, SRp20, SRp75, 9G8 for exon 2 and CELF3, hnRNPA1, Fox1 for exon 10 in the restoration of a normal Tau splicing in presence of DM1 mutation have been identified. In conclusion, our data show that Tau exon 2 and 10, both alterated in DM1 pathology, are regulated and deregulated by different mechanisms.

L'adaptation à la maladie chronique et évolutive est un phénomène complexe mettant en jeu des facteurs physiologiques, psychologiques et sociaux. L'évaluation d'un tel processus chez un sujet, ou au sein d'une population donnée, requiert une approche intégrative. Nous pensons que la dystrophie myotonique de Steinert (DM1) constitue un modèle pertinent pour aborder l'approche biopsychosociale de l'ajustement à l'adversité, car cette pathologie neuromusculaire d'origine génétique a des conséquences sur ces trois dimensions. Sur la base des données de la littérature, nous avons posé l'hypothèse que le trouble de l'humeur dépressive, dans la DM1, était un phénomène réactionnel à la maladie progressivement invalidante, en raison de l'utilisation de stratégies de « coping » inopérantes. De plus, nous avons postulé que les sujets atteints de DM1 présenteraient une altération significative, sur le plan intellectuel et au niveau des fonctions exécutives, que des sujets atteints d'une autre maladie neuromusculaire sans atteinte connue du système nerveux central (la myopathie facio-scapulo-humérale, FSH), et que des sujets contrôles issus de la population générale. Enfin, considérant l'impact des troubles thymiques et des altérations cognitives sur les capacités d'adaptation des sujets DM1, nous avons fait l'hypothèse que les sujets DM1 estimeraient que leur qualité de vie est diminuée, autant sur la sphère physique que la sphère psychologique. Nous avons donc analysé le rôle des facteurs génétiques, cliniques, cognitifs, émotionnels, affectifs et sociaux, et leur influence sur la qualité de vie, auprès de 41 sujets atteints de dystrophie myotonique de Steinert, et de 19 sujets atteints de myopathie facio-scapulo-humérale. Nous avons comparé ces évaluations avec les résultats d'un groupe contrôle, constitué de 20 sujets sans maladie chronique, issu de la population générale. Nos résultats mettent en avant, d'une part, que les sujets DM1 ont, en moyenne, un niveau intellectuel global qui se situe dans la norme inférieure, et qui est significativement inférieur à celui de la population générale et du groupe témoin FSH ; ainsi que des altérations spécifiques des capacités d'attention/concentration. De plus, les sujets DM1 adultes présentent une apathie plus fréquente et plus intense que les deux autres groupes. Nos résultats permettent de faire l'hypothèse que l'apathie, caractéristique spécifique des sujets DM1, serait d'origine organique dans cette pathologie. Il s'agit d'une piste de réflexion qui mérite d'être approfondie dans de prochains travaux, notamment en y associant l'utilisation de techniques modernes d'imagerie. D'autre part, nous observons, dans la DM1, que la dépression est un symptôme fréquent. Près de 22% des sujets DM1 de notre étude remplissent les critères d'un épisode dépressif majeur actuel. L'humeur y est le plus souvent modifiée, et certains sujets présentent même des idées suicidaires. Néanmoins, l'intensité de cette symptomatologie est, si nous considérons l'ensemble du groupe DM1, légère à modérée. On retrouve des modifications émotionnelles de type « émoussement affectif » et « dyscontrôle et hyper-émotionnalité ». L'intensité dépressive est corrélée à l'augmentation du handicap fonctionnel. Elle est indépendante, statistiquement, des facteurs génétiques et neuropsychologiques. Enfin, elle est associée à l'utilisation de stratégies de coping « centrées sur l'émotion ». Ce type de coping est connu, par ailleurs, pour être peu opérant dans l'adaptation aux maladies chroniques. Inversement, le coping « centré sur le problème » est corrélé à une meilleure estime de soi et à des degrés moindres de dépression. Ces résultats sont en faveur de l'hypothèse que les troubles thymiques sont, dans la DM1, la conséquence secondaire d'une affection chronique incurable et évolutive, en raison de l'utilisation de stratégies d'adaptation non opérantes. Dans la DM1, les troubles anxieux et dépressifs, la diminution de l'estime de soi et l'augmentation de la fatigue subjective sont des facteurs inter-corrélés et associés à une moins bonne adaptation sociale et une moins bonne qualité de vie dans les domaines physique et psychologique. Enfin, au-delà de l'opposition classique entre facteurs primaires et secondaires, ou celle d'une origine neurologique versus origine psychique, nous observons, à travers nos résultats, les interactions entre émotions, cognition et adaptation au stress causé par une maladie évolutive. En effet, alors que les sujets atteints de FSH modifient leur utilisation du coping, au fur et à mesure que la maladie évolue, les sujets DM1, eux, utilisent toujours les mêmes types de stratégies, quelle que soit l'étape de leur maladie. Au sein de ce groupe de sujets atteints de DM1, ce sont les personnes qui présentent une altération cognitive significative (intellectuelle et exécutive) qui utilisent préférentiellement un coping de type émotionnel, associé à des perturbations thymiques. Ainsi, nous pensons que lorsque les substrats cognitifs, qui sous-tendent les capacités d'appréciation et de flexibilité des ressources nécessaires à un ajustement opérant sont altérés, les sujets présentent une plus grande vulnérabilité au développement de troubles affectifs. Les résultats de notre étude soulignent l'importance d'un travail de remédiation sur les stratégies de coping et les modes de réactivité au stress, selon les déterminants propres au sujet (comme par exemple l'anxiété-trait). Ils témoignent aussi de la nécessité d'être attentif, dans la prise en charge des patients DM1, aux périodes critiques d'évolution de la maladie. Il est important, aussi bien pour les aidants et les familles, que pour les cliniciens, d'apporter, dans ces périodes, d'autant plus de présence, d'écoute et d'attention.

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie génétique caractérisée par une dégénérescence des muscles squelettiques accompagnée d’une myotonie. Cette maladie est due à une expansion instable de triplets CTG dans la région 3’ non traduite du gène DMPK. L’accumulation des ARNm DMPK mutés au sein de foci nucléaires conduit à la séquestration du facteur d’épissage MBNL1 et à des altérations de l’épissage alternatif de nombreux ARNm. En particulier, l’inclusion de l’exon 5 au sein du pré-ARNm de la troponine T cardiaque (hcTNT) est renforcée chez les patients DM1. Cette inclusion anormale participe aux anomalies cardiaques présentées par les patients. Les travaux de l’équipe, menés en collaboration avec l’équipe de Nicolas Sergeant à Lille, sur la régulation de l’épissage de l’ARNm hcTNT avaient établi l’existence de 8 sites MBNL1, dont 6 nouveaux, situés de part et d’autre de l’exon 5 et la présence de régions activatrices et inhibitrices de l’inclusion fixant des facteurs d’épissage dont l’identité n’était pas connue. L’un des objectifs de ma thèse était d’étudier l’importance fonctionnelle in cellulo de chacun des 8 sites MBNL1. J’ai ainsi pu montrer que chacun des 6 nouveaux sites participe à l’inhibition de l’inclusion de l’exon 5 par MBNL1. Les données obtenues nous ont amené à proposer un modèle dans lequel MBNL1 s’associe avec les triplets de sites MBNL1 situés de part et autre de l’exon 5 et entraine la formation d’une structure à longue distance via des interactions protéiques MBNL1-MBNL1. Cette structure isolerait l’exon 5 dans une boucle et limiterait la fixation du spliceosome. Par ailleurs, j’ai mis en œuvre une approche de purification de RNP formées en extrait nucléaire pour identifier d’autres facteurs régulant l’inclusion de l’exon 5. La protéine hnRNP H a ainsi pu être identifiée. Sa capacité à activer l’inclusion de l’exon 5 in cellulo et à entrer en compétition avec MBNL1 pour la régulation de l’inclusion de l’exon 5 via sa fixation sur des sites localisés dans l’exon 5 et en aval de cet exon a pu être confirmée. La seconde partie de ma thèse a porté sur l’étude de l’effet d’un stress oxydatif généré par 500 µM d’H2O2 sur le profil global d’épissage alternatif des pré-ARNm de cellules HeLa. Lors de ce travail, j’ai pu établir que la réponse des cellules HeLa au stress oxydatif implique deux phases de réponse : une phase précoce (1h-8h) caractérisée par un fort taux de mortalité associé à une forte augmentation du taux de d’entités oxygénées réactives (ROS) intracellulaire et une phase tardive (16h-24h) corrélée à une diminution du taux de ROS intracellulaires et une surexpression des ARN satellite III. Sur la base de ces données, une analyse globale du transcriptome par emploi de puces à exons (Affymetrix) a été réalisée à partir d’ARN totaux isolés 1h, 2h, 4h et 24h après le début du stress. Nous avons ainsi identifié des modulations d’expression et d’épissage spécifiques de chacune des deux phases. L’analyse des données par des outils bio-informatiques a permis de mettre en évidence des fonctions cellulaires bien définies qui sont plus particulièrement affectées lors d’un stress oxydant. Enfin, pour comprendre l’origine des variations d’épissage observées lors d’un stress oxydant, j’ai entrepris d’analyser les effets de ce stress sur le niveau d’expression et la localisation cellulaire des composants du spliceosome ou des facteurs qui s’associent pour réguler son activité / Myotonic distrophy of type 1 (DM1) is a genetic disease characterized by skeletal muscle degeneration associated to myotonia. DM1 results from the instable expansion of CTG repeats within the 3’ untranslated region of the DMPK gene. The accumulation of mutated DMPK mRNAs within nuclear foci leads to the sequestration of the MBNL1 splicing factor and causes splicing misregulation of numerous pre-mRNAs. Among altered events the increase of the inclusion of exon 5 in the human cardiac troponin T (hcTNT) mRNA is of particular importance, since it contributes to the cardiac symptoms presented by the patients. Through collaborative work with N. Sergeant’s team from Lille, the team has studied the molecular bases of hcTNT exon 5 inclusion regulation and mapped 8 MBNL1 binding sites, including 6 new ones, within intronic regions surrounding exon 5. They also identified positive and negative splicing regulatory elements of which protein partners remain unidentified. The first objective of my PhD thesis was to test the functional importance of each individual MBNL1 binding site. The obtained results established that the 6 newly identified MBNL1 binding sites are involved in splicing regulation by MBNL1 and lead us to propose a new regulation model in which MBNL1 binds on triplets of MBNL1 sites present on each side of exon 5 and form a long distance structure via MBNL1-MBNL1 protein interaction. The formation of this looping-structure is expected to isolate exon 5 and limit its recognition by the spliceosome. In addition I searched for protein partners of the identified regulatory elements by affinity chromatography. By this way, I identified hnRNP H as a positive regulator of exon 5 inclusion. Its capacity to compete with MBNL1 to regulate splicing in cellulo by binding on exonic and intronic binding sites was further confirmed. The second part of my PhD work corresponds to the study of the global impact of oxidative stress, generated by exposition of HeLa cells to 500 µM of H2O2, on alternative splicing. This allows us to establish that the response of HeLa cells to oxidative stress involve two distincts phases: an early one (1h-8h) characterized by poor survival rate and high intracellular ROS content and a late phase (16-24h), associated with a decrease of the intracellular ROS level and the overexpression of the long non coding sat III RNAs. Based on this observation, we performed a transcriptome global analysis by using exon arrays from Affymetrix on RNA samples isolated 1, 2, 4 or 24 hours after the induction of the oxidative stress. We identified changes of the gene expression level or mRNA splicing pattern specific of each of the response phases. Data computing by bio-informatic tools identified the most affected cellular processes and functions during the cell response to oxidative stress. In order to better understand the mechanisms underlying alternative splicing modulation during oxidative stress, I started to study the impact of oxidative stress on the expression level and the cellular localization of spliceosome components and most common splicing regulation factors

La maladie de Steinert ou dystrophie myotonique de type 1 (DM1), dystrophie musculaire la plus commune chez l’adulte, est causée par l’expansion instable de triplets CTG dans la région 3’ non traduite du gène DMPK (Dystrophia Myotonica Protein Kinase). Cette maladie multisystémique, affectant principalement les muscles squelettiques et le cœur, est liée à l’épissage. En effet, les CUG exp forment des structures secondaires dans le noyau capables de séquestrer la protéine MBNL1, facteur d’épissage alternatif. En parallèle, un autre facteur d’épissage alternatif, CELF1 est stabilisé. La dérégulation de la balance entre ces deux protéines cause des défauts d’épissage, responsables de certains symptômes de la maladie, comme la myotonie, des défauts de conduction cardiaque et une résistance à l’insuline, causés respectivement par l’épissage aberrant du canal chlorure Clcn1, du canal sodique SCN5A et du récepteur à l’insuline IR. De plus, des dérégulations indépendantes de l’épissage sont aussi mises en jeu dans la DM1 mais leur responsabilité dans l’apparition des symptômes de la maladie reste à identifier. Pour identifier des dérégulations transcriptionnelles indépendantes de l’épissage mais liées à la progression et à la sévérité des symptômes, nous avons généré de nouveaux modèles drosophile de la DM1 avec un nombre croissant de répétitions CTG. Ces modèles étudiées au stade larvaire récapitulent les caractéristiques majeures de la DM1 : la formation de foci et une hypercontractilité musculaire. De plus, nous avons identifié dans ce modèle des dérégulations géniques indépendantes de l’épissage mais dépendantes du nombre de répétitions CTG. Notamment, une atténuation de Gbe1, codant pour une enzyme de branchement du glycogène pourrait participer aux phénotypes musculaires. Afin d’étudier les symptômes cardiaques de la maladie qui touchent 80% des patients et représentent la deuxième cause de mortalité, nous avons utilisé le modèle DM1 de drosophile développé dans notre équipe, et réalisé des analyses physiologiques cardiaques sur des mouches adultes qui expriment 960 CTG dans le cœur (Hand>DM1 960 ), un ARNi pour Mbl, l’orthologue de MBNL1, ou qui surexpriment l’orthologue de CELF1, Bru-3. Ces trois modèles DM1 reproduisent les symptômes cardiaques majeurs observés chez les patients comme des défauts de conduction, de l’arythmie (fibrillation) ou encore une cardiomyopathie dilatée. Afin d’identifier des dérégulations géniques susceptibles d’être responsables de ces défauts, nous avons réalisé une analyse transcriptomique par séquençage ARN après collection de l’ARN spécifique du cœur par la technique du TU-tagging. Les gènes dérégulés identifiés dans ces contextes ont été classés en fonction de leur conservation et du niveau de dérégulation. Parmi eux, la surexpression dans le cœur adulte de Straightjacket (Stj), l’orthologue de CACNA2D4 qui code pour une sous-unité d’un canal calcique voltage- dépendant, cause des défauts de conduction et de la fibrillation, mimant ce qui a été observé en contexte DM1 960 et gain de fonction pour Bru-3. Dans l’avenir, nous aimerions confirmer son implication dans la physiologie cardiaque et en particulier dans la DM1 en analysant son expression chez les patients présentant des défauts cardiaques similaires. / The most common muscular dystrophy found in adults, Steinert disease or Myotonic Dystrophy Type 1 (DM1) is caused by an unstable CTG repeat expansion in the 3’ untranslated region of the Dystrophia Myotonica Protein Kinase (DMPK) gene. This multisystemic disease, affecting particularly skeletal muscles and the heart, is called a spliceopathy because it involves the sequestration of the MBNL1 splicing factor by the expanded CUG-carrying transcripts and the stabilization of the CELF1 splicing factor. The misbalance of these two factors is responsible for splicing defects that cause most of the disease symptoms, like myotonia, conduction defects and arrhythmia but also insulin resistance, respectively associated to missplicing of Clcn1, SCN5A and IR. Moreover, DM1 toxicity is also associated to splice-independent deregulations but their link to disease symptoms remain poorly understood. To identify transcriptional deregulations independent of splicing and associated to disease progression and severity, we generated new DM1 Drosophila models with increasing number of CTG repeats. These larval models recapitulated the main DM1 muscular symptoms such as hypercontractility and foci formation and allowed us identifying gene deregulations independent of splicing. Among them, Gbe1 coding for a glycan branching enzyme is attenuated in the DM1 context in a CTG-repeat dependant manner and could participate in the severity of muscle phenotypes. To better understand the causes of cardiac symptoms that represent the second cause of death and affecting 80% of DM1 patients, we took advantage of our DM1 inducible Drosophila model and performed phenotypic analyses on the heart of adult flies expressing: 960 CTG specifically in the heart (Hand>DM1 960 ), a RNAi for the Drosophila MBNL1 orthologue (Muscleblind, Mbl) or overexpressing the CELF1 orthologue (Bruno-3, Bru3). These DM1 adult models display conduction abnormalities, arrhythmicity (fibrillation) and dilated cardiomyopathy (DCM). Thus, these three pathogenic contexts recapitulated collectively the main DM1 cardiac symptoms and prompted us to perform transcriptional profiling to identify symptom’s-associated gene deregulations. To identify new molecular actors responsible for the DM1 associated heart defects, we performed cardiac cell-specific transcriptional analyses by RNA-sequencing, using TU-tagging technique. Then, we selected deregulated candidate genes that could be linked to the particular observed phenotypes and ranked depending on their conservation and deregulation level. Among them, increased expression of Straightjacket (Stj), the CACNA2D4 orthologue, encoding a subunit of voltage- dependent calcium channel results in fibrillation and conduction defects, thus mimicking cardiac symptoms found in DM1 960 and Bru-3 gain of function contexts in which it was up- regulated. Whether identified candidates are deregulated in DM1 patients displaying cardiac abnormalities remains to be tested.

La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est cause par l’expansion anormale d’un triplet CTG dans la partie 3’UTR du gène DMPK, entrainant l’agrégation du transcrit mutant dans des inclusions ribonucléoprotéiques appelées foci. D’après plusieurs études structurales sur des courtes répétitions CUG, il a été proposé que les expansions CUG se replient en une structure en tige-boucle qui interfère avec l’activité de plusieurs facteurs lié au métabolisme de l’ARN et altère leur fonction cellulaire. Le facteur d’épissage muscleblind-like 1 (MBNL1) a été identifié par sa capacité à interagir avec les répétitions CUG. In vivo, ces répétitions entrainent la séquestration de cette protéine aboutissant en une déplétion nucléaire. Un autre facteur d’épissage, la CUG Binding protein (CUGBP1), est également impliqué dans la pathologie. Au lieu d’être séquestré par les répétitions, la stabilité protéique de CUGBP1 est augmentée dans les tissus DM1 entrainant un gain d’activité pour ce facteur. La séquestration de MBNL1 et la stabilisation de CUGBP1 résultent en la dérégulation de l’épissage alternatif de plusieurs transcrits musculaires et du cerveau et la réexpression d’isoformes protéiques fœtales dans les tissus adultes. Cependant, de récentes études suggèrent que d’autres facteurs ou voies de signalisation que celles faisant intervenir MBNL1 et CUGBP1 pourraient être impliquées dans la pathologie DM1.Le but de mon travail de thèse a été d’identifier de nouveaux facteurs ayant la capacité d’interagir avec les répétitions CUG. A l’aide d’une purification sur chromatographie d’affinité utilisant un ARN contenant 95 répétitions CUG comme appât, nous avons identifié l’ARN hélicase p68/DDX5. p68 fait partie de la famille des protéines DEAD-box, caractérisée par un core protéique conservé constitué de neufs domaines hautement conservés, dont le motif DEAD, à l’origine du nom de ces protéines. p68 est impliquée dans de nombreux aspects du métabolisme de l’ARN, dont la transcription, l’épissage, l’export, la traduction et la dégradation des ARN. Nous avons montré, que p68 colocalise avec les foci CUG dans un modèle cellulaire exprimant la partie 3’UTR du gène DMPK contenant de longues répétitions CTG. Nous avons identifié que p68 augmente l’interaction de MBNL1 sur les répétitions CUG et une structure secondaire particulière d’un élément régulateur de l’ARN pré-messager cardiac Troponin T (TNNT2), dont l’épissage est dérégulé dans la pathologie. L’insertion de mutations dans le core de l’hélicase de p68 abolit l’effet de p68 sur la fixation de MBNL1 ainsi que la colocalisation de p68 avec les expansions CUG in vivo, suggérant que le remodelage des structures secondaires ARN de manière ATP-dépendante par p68 facilite l’interaction de MBNL1. Nous trouvons également que la compétence de p68 pour réguler l’inclusion de l’exon alternatif 5 de TNNT2 dépend de l’intégrité des sites de fixation de MBNL1.Nous proposons que p68 agit comme un modificateur de l’activité de MBNL1 sur ces cibles d’épissage ainsi que sur les expansions CUG à l’origine de la pathologie. / Myotonic Dystrophy type I (DM1) is caused by an abnormal expansion of CTG triplets in the 3’ UTR of the DMPK gene, leading to the aggregation of the mutant transcript in nuclear RNA foci. Based on structural studies on short CUG repeats, it has been proposed that expanded CUG repeats fold into an imperfect hairpin structure that interferes with the activities of RNA binding proteins and alters their normal cellular function. The muscleblind-like 1 protein (MBNL1) was identified by its ability to bind to CUG repeats. It has been shown that the expanded mutant transcript promotes the sequestration of the MBNL1 splicing factor in nuclear RNA foci. CUGBP1 is another splicing factor that is involved in DM1. Instead of being sequestered by the repeats, the steady-state level of CUGBP1 is increased in DM1 tissues, leading to a gain of activity of the protein. The sequestration of MBNL1 and the up-regulation of CUGBP1 in DM1 results in the misregulation of alternative splicing of a subset of muscle and brain-specific transcripts, leading to the re-expression of fetal isoforms in adult tissues. However, several recent studies suggest that factors or signaling pathways other than MBNL1 and CUGBP1 could be involved in DM1 pathogenesis.The aim of this work was to isolate new factors that bind to CUG repeats. Using an affinity chromatography strategy with an RNA containing 95 pure CUG repeats, we identified the RNA helicase p68 (DDX5). p68 is a prototype of DEAD-box RNA helicase proteins. This family is characterized by a conserved core, consisting of nine conserved motifs including the DEAD signature, which gives rise to the name to these proteins. p68 is involved in many aspects of RNA metabolism including transcription, RNA processing, RNA export, translation and mRNA degradation. We showed that p68 colocalized with RNA foci in cells expressing the 3’UTR of the DMPK gene containing expanded CTG repeats. We found that p68 increased MBNL1 binding onto pathological repeats and the stem-loop structure regulatory element within the cardiac Troponin T (TNNT2) pre-mRNA, splicing of which is misregulated in DM1. Mutations in the helicase core of p68 prevented both the stimulatory effect of the protein on MBNL1 binding and the colocalization of p68 with CUG repeats, suggesting that remodeling of RNA secondary structure through a ATP-dependant manner by p68 facilitates MBNL1 binding. We also found that the competence of p68 for regulating TNNT2 exon 5 inclusion depended on the integrity of MBNL1 binding sites.We propose that p68 acts as a modifier of MBNL1 activity on splicing targets and pathogenic RNA.

La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est cause par l'expansion anormale d'un triplet CTG dans la partie 3'UTR du gène DMPK, entrainant l'agrégation du transcrit mutant dans des inclusions ribonucléoprotéiques appelées foci. D'après plusieurs études structurales sur des courtes répétitions CUG, il a été proposé que les expansions CUG se replient en une structure en tige-boucle qui interfère avec l'activité de plusieurs facteurs lié au métabolisme de l'ARN et altère leur fonction cellulaire. Le facteur d'épissage muscleblind-like 1 (MBNL1) a été identifié par sa capacité à interagir avec les répétitions CUG. In vivo, ces répétitions entrainent la séquestration de cette protéine aboutissant en une déplétion nucléaire. Un autre facteur d'épissage, la CUG Binding protein (CUGBP1), est également impliqué dans la pathologie. Au lieu d'être séquestré par les répétitions, la stabilité protéique de CUGBP1 est augmentée dans les tissus DM1 entrainant un gain d'activité pour ce facteur. La séquestration de MBNL1 et la stabilisation de CUGBP1 résultent en la dérégulation de l'épissage alternatif de plusieurs transcrits musculaires et du cerveau et la réexpression d'isoformes protéiques fœtales dans les tissus adultes. Cependant, de récentes études suggèrent que d'autres facteurs ou voies de signalisation que celles faisant intervenir MBNL1 et CUGBP1 pourraient être impliquées dans la pathologie DM1.Le but de mon travail de thèse a été d'identifier de nouveaux facteurs ayant la capacité d'interagir avec les répétitions CUG. A l'aide d'une purification sur chromatographie d'affinité utilisant un ARN contenant 95 répétitions CUG comme appât, nous avons identifié l'ARN hélicase p68/DDX5. p68 fait partie de la famille des protéines DEAD-box, caractérisée par un core protéique conservé constitué de neufs domaines hautement conservés, dont le motif DEAD, à l'origine du nom de ces protéines. p68 est impliquée dans de nombreux aspects du métabolisme de l'ARN, dont la transcription, l'épissage, l'export, la traduction et la dégradation des ARN. Nous avons montré, que p68 colocalise avec les foci CUG dans un modèle cellulaire exprimant la partie 3'UTR du gène DMPK contenant de longues répétitions CTG. Nous avons identifié que p68 augmente l'interaction de MBNL1 sur les répétitions CUG et une structure secondaire particulière d'un élément régulateur de l'ARN pré-messager cardiac Troponin T (TNNT2), dont l'épissage est dérégulé dans la pathologie. L'insertion de mutations dans le core de l'hélicase de p68 abolit l'effet de p68 sur la fixation de MBNL1 ainsi que la colocalisation de p68 avec les expansions CUG in vivo, suggérant que le remodelage des structures secondaires ARN de manière ATP-dépendante par p68 facilite l'interaction de MBNL1. Nous trouvons également que la compétence de p68 pour réguler l'inclusion de l'exon alternatif 5 de TNNT2 dépend de l'intégrité des sites de fixation de MBNL1.Nous proposons que p68 agit comme un modificateur de l'activité de MBNL1 sur ces cibles d'épissage ainsi que sur les expansions CUG à l'origine de la pathologie.

Thèse d'exercice : Médecine : Nancy 1 : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

Les cellules souches pluripotentes (CSP) humaines sont devenues en quelques années des modèles de choix pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui gouvernent l'apparition de maladies monogéniques, mais également pour le développement de criblages à haut débits afin d'identifier parmi plusieurs milliers de molécules chimiques celles qui ont un potentiel thérapeutique. C'est dans ce contexte de criblage que mes travaux de thèse s'inscrivent, alliant automatisation et miniaturisation de la biologie des CSP dans le cadre de deux maladies monogéniques, l'amyotrophie spinale infantile (SMA) et la dystrophie myotonique de type I (DM1). De manière générale, la mise en place d'une telle stratégie repose sur trois étapes essentielles qui sont l'obtention de CSP porteuses d'une mutation donnée, l'identification d'un modèle d'étude pertinent et la réalisation du criblage à proprement parlé. L'obtention de CSP humaines repose sur deux approches principales. La première consiste en la dérivation de cellules embryonnaires humaine (hES) issues de diagnostiques préimplantatoires et la seconde repose sur la reprogrammation de cellules somatiques par l'induction de pluripotence (iPS). Une partie de mon travail a consisté en la création de cellules iPS modèles de la SMA et leur caractérisation par une approche à haut débit. Par la suite un travail d'optimisation du protocole de génération de motoneurones à partir de CSP humaines a permis d'accélérer et augmenter les rendements de production de ces cellules qui sont principalement affectées dans la SMA. Enfin, l'utilisation de cellules hES porteuses de la mutation causale de la DM1 a permis le criblage de 12000 molécules et a conduit à l'identification d'une famille chimique capable de restaurer plusieurs défauts typiques de cette maladie tels que des défauts d'épissage et de fusion moléculaire. / For only few years, Human pluripotent stem cells (PSC) have become wide spread models in order to study and decipher cellular or molecular mechanims involved in monogenic diseases, but also for the development of large scale screening strategies allowing the identification of new therapeutics among thousands of chemicals. Mythesis research aimed at the development of such strategies, miniaturizing and automating PSC biology within the framework of two monogenic diseases, namely spinal muscular atrophy (SMA) and myotonic dystrophy type 1 (DM1).Basically, PSC based screening programs are generally built around three main steps which are the access to a stem cell model, the identification of a relevant cell type and lastly the screening campaign. There is actually two main ways to generate human PSC. Firstly, human embryonic stem cells (hES) can be derived from the inner cell mass of blastocyte through a pre-implantation diagnosis and secondly, induced pluripotent stem cells (iPS) can be generated after somatic cell reprogramming in vitro. A part of my work has consisted in the generation of hiPS cellular models for SMA by reprogramming fibroplasts that carried SMN1 gene deletion, followed bay the characterization of several dozen of independant clones with high throughput. Then an optimization process of the protocol for the generation of Motoneuron from PSC has been done multiplying experimental conditions. This finally allowed the description of a fast and efficient protocol to generate the most affected cell type in SMA. Finally, DM1 mutated hES were uded for the screening of 12.000 compounds among which a chemical family has been identified to rescue DM1 typical splicing and myogenesis defects.

Parmi leurs applications prometteuses, les lignées de cellules souches embryonnaires humaines (hES) présentent un potentiel inestimable pour améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de maladies monogéniques. Cette application de modélisation pathologique est devenue possible grâce à l'utilisation de lignées hES porteuses de la mutation causale d'une maladie monogénique, obtenues au cours d'un diagnostique pré-implantatoire. L'équipe dans laquelle j'ai effectué mes travaux de thèse a démontré que des lignées hES et leurs progénies, porteuses de la mutation causale de la dystrophie myotonique de type 1 (DM1), exprimaient des défauts moléculaires caractéristiques de la pathologie, permettant ainsi leur analyse de façon plus pertinente par rapport à des cultures primaires dérivées de biopsies de patients et validant l'utilisation de ce modèle cellulaire. Dans ce contexte, dans la première partie de mon travail de thèse, mon objectif a été de mettre au point des conditions de culture permettant la différenciation des cellules hES normales et mutantes vers le lignage neural afin d'obtenir des populations homogènes de progéniteurs neuraux et de cellules souches neurales, puis de les caractériser sur le plan phénotypique et fonctionnel. Par une étude transcriptomique, j'ai ensuite comparé le profil d'expression de ces progéniteurs neuraux à une autre population homogène de précurseurs mésenchymateux. J'ai ainsi identifié des gènes et des voies de signalisation spécifiques à chacune de ces populations. (Article 1). Dans la seconde partie de mes travaux, ma contribution au projet de modélisation pathologique de DM1 a été d'utiliser ces progéniteurs neuraux et les cellules souches neurales mutés pour explorer les mécanismes physiopathologiques responsables des symptômes neurologiques observés dans cette pathologie. J'ai ainsi identifié une anomalie dans une voie de signalisation cellulaire perturbée, la voie la voie mTORC1, basée sur l'observation selon laquelle les cellules NSC porteuses de la mutation DM1 proliféraient plus lentement que les cellules contrôles (Article II). J'ai également étudié l'expression la protéine Tau, connue pour son implication dans la maladie d'Alzheimer, et mis en évidence des modifications suggérant une altération du transport axonal dans les neurones issus des lignées hES mutantes. Ces résultats, associés à ceux réalisés dans l'équipe, permettent d'apporter la preuve de concept de l'intérêt d'un tel modèle cellulaire pour la modélisation pathologique des maladies monogéniques.

La dystrophie myotonique de type I (DM1) constitue la plus fréquente des pathologies musculaires héréditaires chez l’adulte. Bien qu’initialement considérée comme une maladie musculaire, la DM1 présente une atteinte neurologique très handicapante. Cette maladie autosomique dominante résulte de l’expansion anormale d’un triplet CTG dans la partie 3’UTR du gène DMPK. Un effet trans du transcrit DMPK muté entraine une dérégulation de l‘épissage alternatif dans de nombreux tissus. Cependant, les mécanismes pathologiques de la DM1 dans le cerveau restent encore peu compris. Afin de disséquer ce mécanisme, notre laboratoire a créé des souris transgéniques exprimant le transcrit DMPK avec de larges expansions CUG dans de nombreux tissus. Ces souris nommées DMSXL, recréent d’importants aspects pathologiques de la DM1, comme des anomalies du comportement et électrophysiologiques du cerveau. Elles représentent donc un excellent outil pour explorer l’effet pathologique de la mutation dans le SNC. En m’appuyant sur ce modèle, j’ai exploré dans un premier temps l’effet trans des ARNs toxiques et l’ampleur de la splicéopathie dans le SNC. De façon intéressante, certains défauts d’épissage sont régions spécifiques, et ne montrent pas d’aggravation avec l’âge des souris DMSXL. Mes résultats démontrent que les ARNs mutés sont capables de déréguler l’épissage alternatif dans l’ensemble du SNC. La région du cervelet a aussi montré des anomalies de l’épissage dans les souris DMSXL, qui, en plus, présentent des perturbations cognitives dépendantes de cette région cérébrale. Le cervelet des souris DMSXL présente aussi des déficits électrophysiologiques suggérant une dysfonction cérébelleuse et plus précisément une dysfonction des cellules de Purkinje. Dans la recherche des populations cellulaires les plus affectées dans le cervelet, j’ai démontré la présence de signes de la toxicité de l’ARN plus marqués dans la glie de Bergman, entourant les cellules de Purkinje. Pour trouver les voies moléculaires perturbées dans le cervelet, et disséquer le mécanisme derrière les anomalies observées, j’ai réalisé une approche protéomique globale et trouvé une sévère baisse de l’expression du transporteur glial de glutamate GLT1/EAAT2, suggérant une dysfonction du cervelet, en conséquence d’un possible métabolisme anormal du glutamate. L’analyse protéomique globale du cerveau des souris DM1 a aussi identifié des différences d’expression et des modifications post-traductionnelles de protéines impliquées dans la signalisation du calcium. L’étude du métabolisme des ARNm dans la DM1 a mis en évidence la dérégulation de l’épissage de gènes impliqués dans le métabolisme du calcium, soutenant l’hypothèse d’une dysfonction calcique dans le SNC. Pour étudier les conséquences de la mutation sur les variations calciques cellulaires, j’ai caractérisé un modèle cellulaire astrocytaire de la DM1. Ce modèle m’a permis de démontrer une localisation anormale du récepteur GRIN1/NMDAR1, ainsi qu’une réponse calcique anormale dans les astrocytes primaires porteurs des amplifications CTG. Malgré les avancés thérapeutiques dans le muscle, on ne sait pas à quel point les stratégies en cours de développement sont efficaces dans le SNC. Pour étudier ce problème, j’ai utilisé le modèle astrocytaire de la DM1 afin de valider in cellulo une stratégie thérapeutique qui vise à rétablir une activité normale du facteur d’épissage MBNL1 endogène. Mes travaux de thèse ont permis d’avancer dans la compréhension de la neuropathologie de la DM1. Ils ont mis en évidence pour la première fois une dysfonction du cervelet, ainsi que la possible dérégulation de la voix calcique dans le SNC. Mes résultats ont donc contribué à mieux comprendre le mécanisme de la DM1 dans le SNC, pour, à long terme, développer des approches thérapeutiques ciblant des évènements moléculaires précis. / Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is the most frequent inherited muscular disorder in adults. Although traditionally regarded as a muscle disease, DM1 presents debilitating neurological manifestations. DM1 is an autosomic dominant disease caused by the abnormal expansion of a CTG triplet within the 3’UTR of the DMPK gene. Many molecular aspects of the DM1 are mediated by a trans effect of the expanded DMPK transcripts, whose accumulation leads to splicing deregulation in many tissues. Despite recent progress in the understanding of DM1 pathogenesis in muscle and central nervous system (CNS), the detailed molecular disease mechanism operating in the brain is still poorly understood. In order to investigate the pathophysiology, our laboratory has generated DMSXL transgenic mice expressing DMPK transcripts containing large CUG expansions in many tissues. DMSXL mice mimic important features of the DM1, notably in the CNS, showing behaviour as well as electrophysiological abnormalities. Therefore, this mouse line represents an excellent tool to investigate the toxic effects of the mutation in the CNS. Taking advantages of this transgenic model, I have first explored the trans effect of the toxic RNA and the extent of DM1-associated spliceopathy in the CNS. Interestingly, some splicing defects were region-specific, and their severity did not increase with the age of the DMSXL mice. My data demonstrate that CUG-containing RNAs have a wide deleterious effect and deregulate alternative splicing in many areas of the CNS. In addition to splicing abnormalities in cerebellum, DMSXL mice also displayed deficits in cerebellum-dependant motor coordination. Plus, DMSXL cerebellum showed electrophysiological abnormalities, suggesting cerebellar dysfunction and more precisely Purkinje cell dysfunction. In the search for the cellular populations showing the greatest susceptibility to RNA toxicity in the cerebellum, I have found extensive foci accumulation as well as pronounced splicing defects in the Bergman glia, surrounding Purkinje cells, in DMSXL and DM1 patients cerebellum. In order to identify molecular pathways and mechanisms behind the behaviour and electrophysiological abnormalities detected, I have performed a global proteomics approach and found a severe decrease in the expression of a glial glutamate transporter GLT1/EAAT2, suggesting that DM1 causes cerebellum dysfunction, through abnormal glutamate metabolism. Global proteomic analysis of DMSXL cerebellum also identified expression and post-translational changes of several proteins involved in calcium signalling. Missplicing of different transcripts involved in calcium metabolism reinforces the idea of calcium dysfunction in the neuropathogenesis of the DM1. To study the effects of toxic RNA on calcium homeostasis and flux, I have established and characterised a brain cell model of DM1. DMSXL primary astrocyte cultures allowed me to show the mislocalisation of the glutamate receptor GRIN1/NMDAR1, as well as abnormal calcium responses to stimulation. Despite recent therapeutic advances in muscle, we do not know the CNS efficiency of the therapeutic strategies currently being developed. To address this problem, I have used the DM1 astrocyte cell model to validate in cellulo a therapeutic strategy aiming to restore the activity of the endogenous splicing factor MBNL1. My thesis work provided a significant step in the understanding of the DM1 pathology in the CNS. My results revealed for the first time signs of cerebellum dysfunction in DM1, as well as signs of calcium homeostasis deregulation in the SNC. My work contributed to better understand the pathological mechanisms of DM1, the brain pathways and cell types most susceptible to toxic RNA. In the long term, my data will contribute to the rational development of therapeutic strategies targeting precise and deleterious molecular events.