Ce travail de thèse a démontré la possibilité de mesurer la relaxation d’un complexe biomoléculaire ainsi que son hétérogénéité structurale, en associant la microfluidique et la fluorescence résolue en temps (FRT). Je présente de quelle façon la FRT permet d’obtenir une information sur la structure d’une molécule et comment on la mesure, notamment grâce à une caméra à balayage de fente. J’introduis ensuite la microfluidique de gouttes, permettant de mélanger deux réactifs en quelques millisecondes et de suivre la relaxation du complexe au cours de la propagation des micro-réacteurs. Puis, la mesure d’une cinétique avec un couple de molécules modèle démontre la preuve de principe, faisant l’objet d’un article soumis. Enfin la mesure de FRT par comptage de photons uniques dans des gouttes uniques est décrite. Elle ouvre une perspective d’application pour le criblage à haut débit : un brevet a été déposé. / This thesis has proven the feasibility of measuring the relaxation of a biomolecular complex as well as its structural heterogeneity, by associating microfluidics and time resolved fluorescence (TRF). I present in which way TRF allows for probing the structure of a molecule and how it is measured, in particular by using a streak camera. I then introduce droplet microfluidics, which enables to mix two reagents in a few milliseconds and to follow the relaxation of the complex, along propagation of the micro-reactors. Next, the measurement of a kinetics with test molecules validates the proof of concept, reported in a submitted article. Finally, the measurement of TRF by single photon counting in single droplets is described. It opens a perspective for an application in high-throughput screening: a patent has been registered.

Le projet de recherche a été réalisé en collaboration avec Professeur Jean-François Masson du Département de Chimie de l'Université de Montréal. The research project was made in collaboration with Professor Jean-François Masson from the Chemistry department of University of Montreal. / L'objectif du projet de recherche est de développer une méthode de criblage d’inhibiteurs basée sur une technologie émergente, soit un dispositif portatif utilisant la résonance des plasmons de surface (SPR). La cible du criblage est la dihydrofolate réductase R67 (DHFR R67), une enzyme qui confère une résistance bactérienne à l'antibiotique triméthoprime. Ici, l'enzyme cible est immobilisée sur une surface d'or mince avec des propriétés plasmoniques (optiques) spécifiques qui varient en fonction de la masse des molécules se liant à cette surface. Cette technique permet de suivre les événements de liaison de molécules à la DHFR R67 immobilisée, et ainsi peut permettre l'identification d'inhibiteurs potentiels. Cependant, la masse molaire des inhibiteurs typiquement utilisés lors de criblages préliminaires (i.e. 500-1000 g/mol) est trop faible pour générer un signal SPR détectable. Afin de contrer cette lacune, ce mémoire a pour objet de développer un essai compétitif indirect qui mettra en jeu des molécules de masse supérieure. D’abord, une nanoparticule d'or portant un analogue de substrat se liera à la DHFR R67 immobilisée à la surface d’or, générant ainsi un signal SPR important en raison de la masse molaire élevée de la nanoparticule. Ensuite, lors du criblage d'inhibiteurs potentiels, les nanoparticules liées seront déplacées de l'enzyme cible si la molécule criblée fournit une affinité suffisante. Ainsi, il sera possible de suivre indirectement la liaison d'un inhibiteur à la cible. Ce projet vise donc à tester et à valider l'approche de criblage SPR appliquée à la DHFR R67. / The objective of the research project is to develop a method for inhibitor screening based on a portable Surface Plasmon Resonance (SPR) device, an emerging technology. The target is R67 dihydrofolate reductase (R67 DHFR), an enzyme that confers bacterial resistance to the antibiotic trimethoprim. Here, the target enzyme is linked to a thin gold surface having specific plasmonic (optical) properties that vary as a function of the mass of bound molecules. This allows monitoring binding to the surface-linked R67 DHFR, and thus permits identification of inhibitors. However, the mass of the low-affinity inhibitors typically identified in early stages of screening (i.e. 500-1000 g/mol) is too low to produce a significant SPR signal. To address this shortcoming, a competitive assay will be developed: a gold nanoparticle carrying a substrate analog will bind the surface-immobilized R67 DHFR, resulting in a strong SPR signal due to its high mass. Then, upon screening for potential inhibitors, the bound nanoparticle will be displaced from the target enzyme if a molecule provides sufficient affinity. By those means, it will be possible to indirectly monitor the binding of an inhibitor to the target. This goal of this project is to test and validate the SPR screening approach applied to R67 DHFR.

La plupart des toxines de Bacillus thuringiensis perméabilisent la membrane intestinale des insectes sensibles en formant des pores qui abolissent le potentiel électrique et les gradients ioniques. Plusieurs toxines ont été étudiées avec des vésicules purifiées de la bordure en brosse intestinale des insectes. Malheureusement, la membrane intestinale de beaucoup d’insectes ne forme pas des vésicules suffisamment étanches pour les expériences de perméabilisation. Une nouvelle technique utilisant des liposomes géants et une sonde de perméabilité membranaire a été développée pour caractériser deux nouvelles toxines particulièrement prometteuses pour le biocontrôle d’un des principaux ravageurs du maïs, la chrysomèle des racines du maïs (Diabrotica virgifera virgifera LeConte), Cry6Aa1 et la toxine binaire DS10/DS11. Les deux toxines perméabilisent efficacement les liposomes. La toxine binaire forme des pores qui sont légèrement sélectifs pour les cations, comme la plupart des toxines de B. thuringiensis. Bien que la Cry6Aa1 puisse former des pores sélectifs pour les anions, les résultats suggèrent aussi qu’elle pourrait, contrairement aux autres toxines de cette bactérie, ne former des pores qu’en présence d’une force ionique élevée. La formation des pores par ces deux toxines semble être sensible à la courbure de la membrane cible étant donné qu’elle est beaucoup plus efficace dans des liposomes géants que dans des liposomes de même composition, mais plus petits. Ce travail jette les bases de la mise au point d’une technique qui permettrait l’étude des toxines dans des liposomes géants enrichis avec des protéines et des lipides provenant de la membrane intestinale des insectes cibles. / Most Bacillus thuringiensis toxins permeabilize the intestinal membrane of susceptible insects by forming pores that abolish transmembrane electrical potentials and ionic gradients. Several toxins have been studied using brush border membrane vesicles purified from the insect midgut. Unfortunately, the intestinal membrane from many insects does not form vesicles that are tight enough to be used in permeabilisation experiments. A new technique using giant liposomes and a membrane permeability probe was developed to evaluate the pore-forming ability of two particularly promising toxins for the biocontrol of a major corn pest, the Western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte), Cry6Aa1 and the binary toxin DS10/DS11. Both toxins permeabilized the liposomes efficiently. However, analysis of the permeabilisation rates under different experimental conditions indicates that these toxins differ in their biophysical properties. The binary toxin forms pores which are slightly selective for cations, like most B. thuringiensis toxins. On the other hand, although the results suggest that Cry6Aa1 could form anion-selective pores, they could also indicate that, in contrast with other toxins produced by this bacterium, it could form pores only under high ionic strength conditions. Pore formation by both toxins appears to be sensitive to membrane curvature since it is much more efficient in giant liposomes than in liposomes with identical composition, but smaller in size. This study sets the bases for the development of a technique that would allow the toxins to be studied in giant liposomes enriched with proteins and lipids from the intestinal membrane of target insects.

Les méthodes d’amélioration des procédures de cryoconservation sont traditionnellement basées sur l’empirisme. Pour s’en démarquer, nous sommes repartis des modèles biophysiques développés pour décrire les procédures en s’appuyant sur 2 méthodes. La 1ère méthode a consisté au développement de techniques de simulation des procédures en caractérisant l’utilisation du Snomax dans l’appareil DSC. Nous avons montré que le contrôle de la température de nucléation (Tn) est possible en choisissant les conditions expérimentales (volume d’échantillon et concentration en Snomax) qui influencent les probabilités de présence de 3 sous-populations d’INA des protéines de P. syringae. La possibilité d’effectuer des simulations a pu être validée pour certaines plages de surfusion dans les solutions de cryoconservation. Ceci a permis la caractérisation des effets physiques influencés par Tn et qui interviennent au cours des procédures et d’alimenter les modèles biophysiques de cryoconservation. La 2ème méthode a consisté à la modification de la composition des solutions afin de réduire le recours au DMSO (cytotoxique) en utilisant des composés de type oligosaccharides : les COS. Après vérification de la biocompatibilité des COS avec des cellules embryonnaires, la caractérisation de l’influence thermodynamique des COS a été effectuée. Il a été montré que les COS sont des cryostabilisateurs qui se lient à une petite quantité de molécule d’eau et n’en affecte pas les propriétés physicochimiques. Les COS peuvent donc être introduits dans le milieu extracellulaire sans risque d’accélérer la déshydratation cellulaire. De plus, il a été montré qu’ils favorisent la gélification du milieu extracellulaire, laquelle est fonction de la proportion massique d’eau en solution résiduelle. Cette gélification fige une partie du système ce qui favorise sa stabilisation au passage des zones de températures à risques de recristallisation / We wished to move aside classical cryopreservation procedure improvements that are based on empiricism and to focus on existing biophysical models in order to describe procedures. We based our study on two methods. The first method consisted in developing the methods for the simulations of procedures, by characterizing the use of Snomax in a DSC device. This study highlighted that the nucleation temperature (Tn) control is possible under precise experimental conditions (sample volume and Snomax concentration) that influence the presence probability of 3 INA subpopulations of the P. syringae protein aggregates. The possibility to simulate the cryopreservation procedures has been achieved for some supercooling ranges within complex cryopreservation solutions. Consequently, it has been possible to characterize the physical effects influenced by Tn and involved within procedures. These results will participate in supplying cryopreservation biophysical models. The second method aimed to modify the composition of cryopreservative solutions in order to reduce the DMSO use (because of its cytotoxicity), using extracellular CPA components: the chitooligosaccharides COS. Subsequent to the biocompatibility verification of the COS with embryonic cells, the thermodynamic influence of the COS has been characterized. Therefore, it has been demonstrated that COS are cryostabilizers that link themselves to a small number of water molecules and does not influence its physicochemical properties. Consequently, COS can be added within the extracellular space without any risk to accelerate the cell dehydration. It has been demonstrated that COS favor the gelation of the extracellular space and that this gelation relies on the mass proportion of water in the residual solution. This gelation immobilizes a part of the system and therefore favor its stabilization when the temperature reaches the risky recrystallization range

Dans ce projet nous nous intéresserons à la création d’un nouveau modèle permettant de simuler des enregistrements extracellulaires de l’activité électrique neurale dans le système nerveux périphérique. Ce modèle fut développé pour permettre une meilleure compréhension de l’impact des différentes propriétés des interfaces sur la qualité des signaux recueillis. Ce projet fut en particulier conduit pour répondre au contexte actuel qui voit le développement de nombreuses applications dans le domaine des neuro-prothèses et autres interfaces neurales à but biomédical. Nos intentions étaient de fournir un nouvel outil permettant de mieux comprendre les particularités des interfaces existantes ou d’aider à leur amélioration et à la planification de futures innovations. Ce modèle est construit comme la synthèse de la compréhension actuelle des différents rouages biophysiques impactant les enregistrements. Sa structure peut être perçue comme l’assemblage de différents sous-systèmes interconnectés et représentant chacun une dimension du processus. Il s’avère particulièrement efficace pour l’analyse comparative des performances entre diffèrent types/géométries d’électrodes invasives. Dans ce document, nous nous efforcerons d’expliquer en détail la structure et les paramètres de notre modèle. Nous décrirons ensuite les différents tests que nous avons entrepris pour sa validation expérimentale, ainsi que les différentes voies d’applications que nous avons commencé à explorer. Nous finirons par décrire les améliorations qui nous sont apparues comme nécessaires ou possibles et par une discussion sur les ouvertures futures offerte à ce domaine de recherche. / Neural interfaces are becoming a newly dynamic and promising field especially thanks to the numerous applications they could have in the biomedical domain. A great deal of these applications requires a monitoring of targeted neural activity. Among the different technologies available for such recording practice, chronic electrodes implanted in the peripheral nervous system offer a good compromise on the resolution versus invasiveness technological constraint. A large array of electrodes has been developed in this intention but there is still only a limited comprehension of their recording principles and weakness. This makes difficult any targeted improvement of the electrodes and led this field to be mainly dominated by a trial and error empirical approach simultaneously costly in funds, animal lives and time. In particular, intrafascicular electrodes, while providing exiting results for stimulation, have often failed in recordings. These electrodes typically show interesting recording performance right after implantation but have rapid decline of their efficacy up to the points that they often become useless after a few weeks. Such performance proves problematic as they drastically limit the transfer of experimental results to human applications. The extent of our work has been the development of a theoretical framework for the study of implantable electrodes. Our goal here has been to construct a model that could be used as a platform to better understand implanted electrode and compare their performance and possible improvement. We focused our work on intrafascicular electrode for the peripheral nervous system. However, our procedure could easily be applied to other type of interface. During this project we first constructed a detailed model of the recording biophysical process happening at the peripheral nerve electrical interface. This model encompasses all the mechanism known to influence the quality and shape of neural activity recordings. We have then recreated within our model specific controlled experiments and by comparing the properties of the simulated recording with their experimental counterparts demonstrated the potency of our approach to produce bio-plausible signals. This validated our model as an in silico alternative to compare and test electrodes. We then further developed this model to also simulate some of the changes happening in the nerve post implantation. In particular, we found that the growth of the fibrotic scar could already explain a large part of the signal degradation happening in the first weeks. Then to demonstrate the adaptability of this model we used it to compare the performance of the main type of electrodes implanted nowadays peripherally. Finally, as the main weakness of our model relied in its relative complexity and the related long computing time, we started to analyze how this model could be simplified without losing the precision necessary for the intended applications. In conclusion, this project led to the creation of a model which in its current form can be used as an in silico platform to test and compare electrodes. This will facilitate the planning and development of future peripheral neural interface by proving both more economical and informative that current strategies. Conjointly, we opened the way to future improvement of our model, leading to more practicality.

Les canaux ioniques sont des complexes macromoléculaires clés exprimés dans tous les types de cellules et sont impliqués dans divers processus physiologiques, y compris la génération et la propagation de potentiels d'action. Des canaux défectueux conduisent à des maladies graves, notamment l'épilepsie, des arythmies et des syndromes douloureux, ce qui en fait une cible potentielle intéressante pour le développement de médicaments. Pour améliorer notre compréhension de ces assemblages biologiques et éventuellement trouver des traitements spécifiques pour les canalopathies, il est crucial d'étudier la structure et la fonction des canaux ioniques. L'objectif principal de cette thèse a été d'étudier ce type de détails structurels et fonctionnels pour trois canaux ioniques associés aux domaines des capteurs de douleur et des canaux potassiques voltage-dépendants en utilisant des techniques de fluorescence et d'électrophysiologie. Dans le premier projet, nous avons étudié la stœchiométrie des canaux hétéromères Kv2.1 / 6.4 (chapitre trois). La technique du décompte de sous-unités isolées (single subunit counting :ssc) permet de compter les sous-unités marquées par fluorescence d’un complexe isolé en déterminant le nombre d'événements de photoblanchiment, qui apparaissent en sauts irréversibles vers le bas sur les traces de fluorescence. Pour désigner la stœchiométrie la plus probable, nous avons utilisé des calculs de probabilités pondérées et avons constaté que les canaux Kv2.1 / 6.4 s'expriment dans un arrangement 2 : 2. Plus précisément, les études fonctionnelles des canaux concatémériques montrent que les sous-unités Kv6.4 et 2.1 doivent être disposées de manière alternée. Le deuxième projet était également basé sur des expériences de SSC et visait à déterminer l'état oligomérique du nouveau canal ionique TACAN (chapitre quatre). Nous avons trouvé une portion significative de canaux intracellulaires, ce qui a provoqué une fluorescence de fond dans les expériences de SSC traditionnelles réalisées avec les cellules mammifères. Pour améliorer le rapport du signal sur bruit de fond, nous avons effectué des expériences de SSC sur des canaux purifiés qui ont été immobilisés sur des lamelles de verre fonctionnalisées Ni-NTA. En utilisant la méthode de calcul décrite dans le premier projet, nous avons trouvé différents états oligomériques et proposons que les canaux TACAN natifs s'assemblent en tétramères qui sont instables lorsqu'ils sont solubilisés dans un détergent. Dans le dernier projet, nous avons étudié la relation structure-fonction de la sous-unité auxiliaire DPP6 pour les canaux Kv4.2 (chapitre cinq). Ici, nous avons progressivement tronqué le grand domaine extracellulaire de 700 acides aminés de DPP6 et étudié son effet sur les courants macroscopiques en utilisant la technique du cut-open voltage clamp. Nous avons constaté que les sous-unités DPP6 avec un domaine extracellulaire court ne parviennent pas à moduler les propriétés du canal aussi efficacement que la DPP6 pleine longueur. Plus précisément, la seconde moitié du domaine extracellulaire b-propeller de DPP6 est responsable d'une inactivation du canal considérablement accélérée. Sur la base de la structure cristalline du domaine extracellulaire, nous avons proposé qu'un domaine b-propeller stable et possiblement la formation de dimères DPP6 sont responsables de la déstabilisation efficace de l'état du canal ouvert. / Ion channels are key macromolecular complexes expressed in all cell types and are involved in various physiological processes including the generation and propagation of action potentials. Defective channels lead to severe diseases including epilepsy, arrhythmias and pain syndromes making them an interesting potential drug target. To improve our understanding of these biological assemblies and eventually find specific treatments for channelopathies, it is crucial to study the structure and function of ion channels. The main purpose of this thesis has been to investigate such structural and functional details of three ion channel complexes from the field of pain sensors and voltage-gated potassium channels using fluorescence and electrophysiological techniques. In the first project, we studied the stoichiometry of heteromeric Kv2.1/6.4 channel complexes (chapter three). Single subunit counting (SSC) allows to directly count the number of fluorescently labeled subunits by determining the number of irreversible, step-wise photobleaching events. To determine the most probable stoichiometry, we used weighted likelihood calculations and found that Kv2.1/6.4 channels express in a 2:2 arrangement. More precisely, functional studies of concatemeric channels (performed by our collaborators) illustrate that Kv6.4 and 2.1 subunits need to be arranged in an alternating fashion. The second project was also based on SSC experiments and aimed at determining the oligomeric state of the novel ion channel TACAN (chapter four). We found a significant amount of channels in the intracellular which caused background fluorescence in traditional SSC experiments performed in cells. To improve the signal to background ratio, we performed SSC experiments on purified channels that were immobilized on Ni-NTA functionalized glass coverslips. Using the model selection method described in the first project, we found different oligomeric states and propose that native TACAN channels assemble as tetramers which are unstable when solubilized in detergent. In the last project, we investigated the structure-function relation of the auxiliary DPP6 subunit in Kv4.2 channel complexes (chapter five). Here, we progressively truncated DPP6’s 700 amino acids long extracellular domain and studied its effect on macroscopic currents using the cut-open voltage clamp technique. We found that DPP6 subunits with a short extracellular domain fail to modulate the channel properties as efficiently as the full length DPP6. More precisely, the second half of the extracellular b-propeller domain of DPP6 is responsible for drastically accelerated channel inactivation. Based on the crystal structure of the extracellular domain, we proposed that a stable b-propeller domain and possibly DPP6 dimer formation is responsible for destabilizing the open channel state efficiently.

Cette thèse est dédiée à l’analyse et la modélisation d'expériences où la position d'un traceur dans le milieu cellulaire est enregistrée au cours du temps. Il s’agit de pouvoir de retirer le maximum d’information à partir d’une seule trajectoire observée expérimentalement. L’enjeu principal consiste à identifier les mécanismes de transport sous-jacents au mouvement observé. La difficulté de cette tâche réside dans l’analyse de trajectoires individuelles, qui requiert de développer de nouveaux outils d’analyse statistique. Dans le premier chapitre, un aperçu est donné de la grande variété des dynamiques observables dans le milieu cellulaire. Notamment, une revue de différents modèles de diffusion anormale et non-Gaussienne est réalisée. Dans le second chapitre, un test est proposé afin de révéler la rupture d'ergodicité faible à partir d’une trajectoire unique. C’est une généralisation de l’approche de M. Magdziarz et A. Weron basée sur la fonction caractéristique du processus moyennée au cours du temps. Ce nouvel estimateur est capable d’identifier la rupture d’ergodicité de la marche aléatoire à temps continu où les temps d'attente sont distribués selon une loi puissance. Par le calcul de la moyenne de l’estimateur pour plusieurs modèles typiques de sous diffusion, l’applicabilité de la méthode est démontrée. Dans le troisième chapitre, un algorithme est proposé afin reconnaître à partir d’une seule trajectoire les différentes phases d'un processus intermittent (e.g. le transport actif/passif à l'intérieur des cellules, etc.). Ce test suppose que le processus alterne entre deux phases distinctes mais ne nécessite aucune hypothèse sur la dynamique propre dans chacune des phases. Les changements de phase sont capturés par le calcul de quantités associées à l’enveloppe convexe locale (volume, diamètre) évaluées au long de la trajectoire. Il est montré que cet algorithme est efficace pour distinguer les états d’une large classe de processus intermittents (6 modèles testés). De plus, cet algorithme est robuste à de forts niveaux de bruit en raison de la nature intégrale de l’enveloppe convexe. Dans le quatrième chapitre, un modèle de diffusion dans un milieu hétérogène où le coefficient de diffusion évolue aléatoirement est introduit et résolu analytiquement. La densité de probabilité des déplacements présente des queues exponentielles et converge vers une Gaussienne au temps long. Ce modèle généralise les approches précédentes et permet ainsi d’étudier en détail les hétérogénéités dynamiques. En particulier, il est montré que ces hétérogénéités peuvent affecter de manière drastique la précision de mesures effectuées sur une trajectoire par des moyennes temporelles. Dans le dernier chapitre, les méthodes d’analyses de trajectoires individuelles sont utilisées pour étudier deux expériences. La première analyse effectuée révèle que les traceurs explorant le cytoplasme montrent que la densité de probabilité des déplacements présente des queues exponentielles sur des temps plus longs que la seconde. Ce comportement est indépendant de la présence de microtubules ou du réseau d’actine dans la cellule. Les trajectoires observées présentent donc des fluctuations de diffusivité témoignant pour la première fois de la présence d’hétérogénéités dynamiques au sein du cytoplasme. La seconde analyse traite une expérience dans laquelle un ensemble de disques de 4mm de diamètre a été vibré verticalement sur une plaque, induisant un mouvement aléatoire des disques. Par une analyse statistique approfondie, il est démontré que cette expérience est proche d'une réalisation macroscopique d'un mouvement Brownien. Cependant les densités de probabilité des déplacements des disques présentent des déviations par rapport à la Gaussienne qui sont interprétées comme le résultat des chocs inter-disque. Dans la conclusion, les limites des approches adoptées ainsi que les futures pistes de recherches ouvertes par ces travaux sont discutées en détail. / This thesis is dedicated to the analysis and modeling of experiments where the position of a tracer in the cellular medium is recorded over time. The goal is to be able to extract as much information as possible from a single experimentally observed trajectory. The main challenge is to identify the transport mechanisms underlying the observed movement. The difficulty of this task lies in the analysis of individual trajectories, which requires the development of new statistical analysis tools. In the first chapter, an overview is given of the wide variety of dynamics that can be observed in the cellular medium. In particular, a review of different models of anomalous and non-Gaussian diffusion is carried out. In the second chapter, a test is proposed to reveal weak ergodicity breaking from a single trajectory. This is a generalization of the approach of M. Magdziarz and A. Weron based on the time-averaged characteristic function of the process. This new estimator is able to identify the ergodicity breaking of continuous random walking where waiting times are power law distributed. By calculating the average of the estimator for several subdiffusion models, the applicability of the method is demonstrated. In the third chapter, an algorithm is proposed to recognize the different phases of an intermittent process from a single trajectory (e.g. active/passive transport within cells, etc.).This test assumes that the process alternates between two distinct phases but does not require any hypothesis on the dynamics of each phase. Phase changes are captured by calculating quantities associated with the local convex hull (volume, diameter) evaluated along the trajectory. It is shown that this algorithm is effective in distinguishing states from a large class of intermittent processes (6 models tested). In addition, this algorithm is robust at high noise levels due to the integral nature of the convex hull. In the fourth chapter, a diffusion model in a heterogeneous medium where the diffusion coefficient evolves randomly is introduced and solved analytically. The probability density function of the displacements presents exponential tails and converges towards a Gaussian one at long time. This model generalizes previous approaches and thus makes it possible to study dynamic heterogeneities in detail. In particular, it is shown that these heterogeneities can drastically affect the accuracy of measurements made by time averages along a trajectory. In the last chapter, single-trajectory based methods are used for the analysis of two experiments. The first analysis carried out shows that the tracers exploring the cytoplasm show that the probability density of displacements has exponential tails over periods of time longer than the second. This behavior is independent of the presence of both microtubules and the actin network in the cell. The trajectories observed therefore show fluctuations in diffusivity, indicating for the first time the presence of dynamic heterogeneities within the cytoplasm. The second analysis deals with an experiment in which a set of 4mm diameter discs was vibrated vertically on a plate, inducing random motion of the disks. Through an in-depth statistical analysis, it is demonstrated that this experiment is close to a macroscopic realization of a Brownian movement. However, the probability densities of disks’ displacements show deviations from Gaussian which are interpreted as the result of inter-disk shocks. In the conclusion, the limits of the approaches adopted as well as the future research orientation opened by this thesis are discussed in detail.

Hyperexcitabilité est l'un des changements les plus importants observés dans de nombreuses maladies neuro-dégénératives telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la maladie d'Alzheimer. De nombreuses recherches études se sont concentrées sur la réduction de l'hyperexcitabilité, soit en inactivant les canaux sodiques ce qui va réduire la génération de potentiels d'action, soit en prolongeant l'ouverture des canaux potassiques ce qui va qui ramener la membrane à son état de repos et réduire l’activité des neurones. Ainsi, pour cibler l'hyperexcitabilité, il faut tout d’abord comprendre les différents aspects de la fonction des canaux ioniques au niveau. Les objectifs des travaux présentés dans cette thèse consistent à déterminer le mécanisme d'inactivation dans les canaux potassiques Shaker. Les canaux Shaker Kv s'inactivent rapidement pour culminer le potentiel d'action et maintenir l'homéostasie des cellules excitables. L'inactivation de type N est causée par les 46 premiers acides aminés situés de l'extrémité N-terminale du canal, encore appelé, peptide d'inactivation (IP). De nombreuses études mutationnelles ont caractérisé l'inactivation de type N au niveau fonctionnel, cependant, la position de l'IP à l'état de repos et leur transition lors de l'inactivation est encore débattue. L'objectif de la première étude consiste à évaluer le mouvement des IP pendant leur inactivation à l'aide de la fluorométrie en voltage imposé. En insérant un acide aminé non naturel, la 3-[(6-acétyl-2-naphtalényl) amino]-L-alanine (Anap), qui est sensible aux changements d'environnement, nous avons identifié séparément les mouvements de la boule et de la chaîne. Nos données suggèrent que l'inactivation de type N se produit dans un mouvement biphasique en libérant d'abord le IP, ce qui va bloquer le pore du côté cytoplasmique. Pour affiner davantage la position de repos des IP, nous avons utilisé le transfert d'énergie de résonance à base de lanthanide et le métal de transition FRET. Nous proposons que le IP se situe dans la fenêtre formée par le canal et le domaine T1, interagissant avec les résidus acides-aminés du domaine T1. Dans notre deuxième étude, nous avons montré que le ralentissement de l'inactivation de type N observé dans la première étude est causée par une expression élevée des canaux Shaker. En effet, l'extrémité C-terminale du canal interagit avec les protéines d'échafaudage associées à la membrane pour la formation d'amas. Nous avons aussi montré qu'en tronquant les quatre derniers résidus C-terminaux impliqués dans la formation des amas, nous empêchons également le ralentissement de la cinétique d'inactivation dans les canaux Shaker. Nous avons également démontré que l'inactivation lente de type N n'est pas affectée par l'accumulation des cations potassiques [K+] externe ou toute diaphonie entre les sous-unités voisines. Cette étude élucide non seulement la cause du ralentissement de l'inactivation, mais montre également que les canaux modifient leur comportement en fonction des conditions d'expression. Les résultats trouvés au niveau moléculaire ne peuvent donc pas toujours être extrapolés au niveau cellulaire. / Hyperexcitability of neurons is a major symptom observed in many degenerative diseases such as ALS and Alzheimer’s disease. A lot of research is focused on reducing hyperexcitability, either by inactivating sodium channels that will reduce the generation of action potentials, or by prolonging the opening of potassium channels which will help to bring the membrane back to resting state and thus, reduce firing frequency of neurons. At the molecular level, it is important to understand different aspects of ion channel function to target hyperexcitability. The aim of this thesis was to investigate in two projects the inactivation mechanism in Shaker potassium channels. Shaker Kv channels inactivate rapidly to culminate the action potential and maintain the homeostasis of excitable cells. The so-called N-type inactivation is caused by the first 46 amino acids of the N-terminus of the channel, known as the inactivation peptide (IP). Numerous mutational studies have characterized N-type inactivation functionally, however, the position of the IP in the resting state and its transition during inactivation is still debated. The aim of the first project was to track the movement of IP during inactivation using voltage clamp fluorometry. By inserting an unnatural amino acid, 3-[(6-acetyl-2-naphthalenyl) amino]-L-alanine (Anap), which is sensitive to changes in environment, we identified the movements of ball and chain separately. Our data suggests that N-type inactivation occurs in a biphasic movement by first releasing the IP, which then blocks the pore from the cytoplasmic side. To further narrow down the resting position of the inactivation peptide, we used Lanthanide-based Resonance Energy transfer and transition metal FRET. We propose that the inactivation peptide is located in the window formed by the channel and the T1 domain, interacting with the acidic residues of the T1 domain. In a follow-up study, we explored the reason underlying slow inactivation kinetics observed during the study of N-type inactivation in the first project. High expression of Shaker channels results in slowing of the N-type inactivation. The C-terminus of the channel interacts with membrane associated scaffold proteins for cluster formation. In this study, we have shown that by truncating the last four C-terminal residues involved in cluster formation, and hence preventing channel clustering, we also prevent slowing of the inactivation kinetics in Shaker channels. We also showed that slow N-type inactivation is not affected by accumulation of external [K+] or any crosstalk between the neighboring subunits. The second project not only elucidates the cause of the inactivation slow-down but illustrates that the channels alter their behavior dependent on the expression conditions. Results found on the molecular level can thus not always be extrapolated to the cellular level.

Une fois ingérées par un insecte sensible, les toxines insecticides du bacille de Thuringe doivent être activées par les protéases intestinales de cet insecte. Leur premier domaine, un ensemble de sept hélices-α amphipathiques, est responsable de leur insertion dans la membrane luminale de certaines cellules de l’intestin médian, ce qui crée des pores peu sélectifs. La toxicité et la capacité à former des pores d’une telle toxine, la Cry9Ca, de ses mutants simples R164A et R164K et d’un fragment de 55 kDa résultant d’un clivage protéolytique au niveau de son résidu 164 ont été étudiées à l’aide d’une combinaison de modélisation par homologie, de bioessais, d’expériences de gonflement osmotique avec des vésicules de membrane en bordure en brosse de larves de sphinx du tabac et de mesures électrophysiologiques sur des intestins isolés. Ni les mutations simples ni le clivage protéolytique n’ont altéré la toxicité de la Cry9Ca. Dans une solution à faible force ionique, toutefois, la formation des pores dépend fortement du pH : une augmentation de celui-ci de 6,5 à 10,5 a entraîné une baisse irrégulière et par étapes successives de la perméabilité membranaire. Les quatre préparations de toxine ont néanmoins dépolarisé la membrane apicale d’intestins médians fraîchement isolés baignant dans une solution contenant 122 mM de KCl à pH 10,5. L’activité de la Cry9Ca, et des mutants R164A et R164K, a été grandement stimulée lorsque les expériences ont été effectuées en présence de suc intestinal, de lipides extraits d’un volume équivalent de suc intestinal ou d’un cocktail d’inhibiteurs de protéases solubles dans l’eau. De plus, le rôle des boucles inter-hélicales du Domaine I lors de l’insertion dans la membrane a été étudié avec des mutants doubles de la Cry9Ca dont les mutations introduisaient, neutralisaient ou renversaient une charge électrique. À l’exception de trois d’entres eux, tous ces mutants ont conservé une toxicité et une capacité à former des pores comparables à celles de la toxine parentale. L’ensemble de ces résultats suggère que le micro-environnement de l’intestin médian contribue à minimiser l’influence des charges de surface portées par les résidus des boucles inter-hélicales du Domaine I sur la capacité des toxines du bacille de Thuringe à former des pores. Il indique aussi que, d’une part, selon le site de clivage et les conditions expérimentales utilisées, des protéolyses supplémentaires de la toxine Cry9Ca activée peuvent soit stimuler, soit nuire à son activité et que, d’autre part, le suc intestinal du sphinx du tabac contient probablement un inhibiteur de protéases qui pourrait jouer un rôle important dans l’activité des toxines du bacille de Thuringe. / Once ingested by susceptible insects, Bacillus thuringiensis insecticidal toxins must be activated by the insect’s intestinal proteases. Their first domain, a bundle of seven amphipathic -helices, is responsible for their insertion into the luminal membrane of midgut cells, thereby creating poorly selective pores. The toxicity and pore-forming ability of one such toxin, Cry9Ca, its single-site mutants, R164A and R164K, and of the 55-kDa fragment resulting from its proteolytic cleavage at residue 164 were investigated using a combination of homology modeling, bioassays, osmotic swelling experiments with Manduca sexta larval midgut brush border membrane vesicles and electrophysiological measurements on isolated midguts. Neither the single mutations nor the proteolytic cleavage altered Cry9Ca toxicity. In low ionic strength solutions however, pore formation was highly dependent on pH: increasing pH from 6.5 to 10.5 resulted in an irregular step-wise decrease in membrane permeabilization. All four toxin preparations nevertheless depolarized the apical membrane of freshly isolated midguts bathing in a solution containing 122 mM KCl at pH 10.5. The activity of Cry9Ca, R164A and R164K was greatly enhanced when the experiments were conducted in the presence of midgut juice, the lipids extracted from an equivalent volume of midgut juice or a cocktail of water-soluble protease inhibitors. Additionally, the role of the interhelical loops of Domain I in membrane insertion was investigated with Cry9Ca double mutants with mutations that either introduced, neutralized or reversed an electrical charge. All but three mutants retained a toxicity and a pore-forming ability that were comparable to those of their parental toxin. Overall, the results suggest that the midgut microenvironment contributes to minimizing the influence of surface charges carried by Domain I interhelical loop residues on B. thuringiensis toxins pore-forming ability. They also indicate that, depending on the cleavage site and on the experimental conditions used, further proteolysis of the activated Cry9Ca toxin can either stimulate or be detrimental to its activity and that M. sexta midgut juice probably contains protease inhibitors that could play a major role in the activity of B. thuringiensis toxins in the insect midgut.

Les glycoprotéines de fusion virales de classe 1 contrôlent la fusion entre lenveloppe virale et la membrane cellulaire. Ces glycoprotéines présentent une extrémité N-terminale indispensable à la fusion, le peptide de fusion. Les peptides de fusion sont capables dinduire à eux seuls la fusion de membranes in vitro. Dans cette étude, nous avons dabord analysé les peptides de fusion de gp41 du HIV et de gp30 du BLV. Ces deux peptides de fusion sont des peptides obliques : ils sinsèrent obliquement dans la membrane sous forme hélicoïdale. Nos études ont montré une relation entre la capacité de ces deux peptides de fusion à sinsérer obliquement dans la membrane et la capacité de leurs glycoprotéines de fusion à induire la fusion. Dans le cas du BLV, nous avons également montré une relation entre lobliquité du peptide de fusion et sa fusogénicité. Cette relation obliquité-fusogénicité a été utilisée pour prédire avec succès la région minimale des deux peptides de fusion suffisante pour induire une fusion significative in vitro, qui correspond respectivement aux douze et aux quinze premiers acides aminés de gp41 et gp30. Nos résultats montrent également que le peptide caméléon, un peptide de novo avec une structure labile, sinsère obliquement dans la membrane et induit la fusion in vitro. Le fait que ce peptide fasse partie des peptides obliques, comme les peptides de fusion du HIV et BLV, renforce lhypothèse dun lien entre la fusogénicité des peptides de fusion et leur flexibilité structurale. De nombreuses études réalisées sur les glycoprotéines de fusion de classe 1 indiquent que le domaine transmembranaire intervient également dans la fusion virale. Ce domaine doit être suffisamment long pour que la fusion soit complète. Dans ce travail, nous avons montré quun peptide transmembranaire modèle, le peptide KALR, est capable de sinsérer et dinduire la fusion de liposomes in vitro. En comparant les résultats de modélisation moléculaire avec ceux de FTIR et ceux de la fusion de phase lipidique/perméabilisation de liposomes, nous avons également montré que le taux dinsertion membranaire et la fusogénicité de KALR dépendent de la longueur de son cur hydrophobe. En effet, le taux dinsertion de KALR dans la membrane est beaucoup plus important lorsquil contient un cur hydrophobe lui permettant de traverser entièrement la membrane. Dans cette situation, KALR est capable dinduire la déstabilisation et la fusion de membranes alors que lorsque son cur hydrophobe est trop court pour lui permettre de traverser la membrane, il en est incapable. Ces résultats ont permis dapporter des éléments de compréhension des mécanismes intervenant lors de la fusion induite par les glycoprotéines de fusion virales. / Abstract: Class 1 fusion glycoproteins of viruses are involved in the fusion between viral envelope and cell membrane. The N-terminal extremity of these glycoproteins, called fusion peptide, is essential for fusion. Fusion peptides are able to induce by themselves in vitro membrane fusion. Firstly, we analysed fusion peptides of HIV-1 gp41 and BLV gp30. These two peptides are tilted peptides: they insert obliquely in the membrane when helical. Our studies showed a correlation between the ability of these two fusion peptides to insert obliquely in the membrane and the ability of whole glycoproteins to induce fusion. For BLV, a relationship between the obliquity of the fusion peptide and its fusogenicity was also observed. This obliquity/fusogenicity relationship was used to successfully predict the minimal region of the two fusion peptides sufficient to induce significant in vitro fusion. The minimal fusion peptide corresponds respectively to the twelve and to the fifteen first residues of gp41 and gp30. Our results also showed that the chameleon peptide, a de novo peptide with structural flexibility, inserts obliquely into the membrane and induces in vitro fusion. The fact that this peptide is a tilted peptide, like fusion peptides of HIV-1 and BLV, confirms the hypothesis of a relationship between the fusion peptides fusogenicity and their structural flexibility. A lot of studies on class 1 fusion glycoproteins of viruses indicate that the transmembrane domain is also directly involved in the viral fusion. Glycoproteins must have a domain long enough to induce complete fusion. In this study, we showed that a model transmembrane peptide, KALR peptide, is able to insert into membranes and to induce their fusion. By comparing molecular modelling results with those of FTIR, of liposomes lipid-mixing and of liposomes leakage, we also showed that the insertion rate into the membranes and the fusogenicity of KALR depend on the length of its hydrophobic core. Indeed, the insertion rate of KALR into the membrane is greatly larger when it contains a hydrophobic core long enough to allow the peptide to traverse the membrane. In this situation, KALR is able to destabilize membranes and to induce their fusion, while when it is too short to match the membrane, it is unable to induce fusion. These results allow to better understanding mechanisms involved in the fusion induced by viral fusion glycoproteins.