En radiothérapie, les nanoparticules faites de métaux lourds telles que les nanoparticules l’or (AuNPs) ont démontré des propriétés radiosensibilisantes particulièrement prometteuses. Une augmentation de la dose et du nombre de radicaux produits, à échelle tumorale (effet photoélectrique) et à échelle sub-cellulaire (électrons Auger) pourraient être responsables d’une partie des effets pour les rayons X de basse énergie. Dans le cadre de cette thèse, nous proposons d'étudier ces mécanismes physiques et chimiques précoces par des outils de simulation, afin de mieux les quantifier et comprendre leur impact sur la survie cellulaire. Nous avons d’abord finalisé et validé une simulation Monte Carlo développée pour suivre les électrons jusqu’à très basse énergie à la fois dans l’eau (meV) et dans l’or (eV). Nous avons obtenu de bons résultats pour l’or en comparant nos données avec des données expérimentales de la littérature, en terme de production d’électrons et de perte d’énergie. Nous avons utilisé cet outil de simulation pour quantifier l’énergie déposée dans des nanocibles situées près d’une AuNP, qui est corrélée à la probabilité de générer des dommages. Cette étude a nécessité d’importantes optimisations, afin d’atteindre des temps de calculs raisonnables. Nous avons montré une augmentation significative de la probabilité d’avoir un dépôt d’énergie dans la nanocible supérieur à une énergie seuil, dans un rayon de 200 nm autour de la AuNP, ce qui suggère qu’une AuNP pourrait efficacement détruire des cibles biologiques situées dans sa périphérie. Nous avons ensuite utilisé la simulation pour quantifier des effets chimiques. A échelle macroscopique, nous avons estimé l'augmentation de la quantité de radicaux libres produits en présence d’une concentration d’AuNPs. Nous avons également comparé la distribution radiale des espèces chimiques d’une nanoparticule d’or ionisée, à celle d’une nanoparticule d’eau ionisée. Si le nombre total d'espèces chimiques par ionisation était en moyenne plus important pour l'or que pour l'eau, le nombre d’espèces chimiques produites en périphérie de la nanoparticule n’était pas systématiquement supérieur pour l’or par rapport à l’eau. Cela suggère que l’effet de la AuNP dans sa périphérie réside surtout dans l’augmentation de la probabilité d’avoir une ionisation. Nous avons également étudié plusieurs scénarios pour expliquer l’augmentation expérimentale inattendue de la production d’espèces fluorescentes lors de l’irradiation d’une solution d’AuNPs et de coumarine. Notre étude suggère qu’un scénario plausible pouvant expliquer les observations expérimentales est l’interférence entre une AuNP et une des molécules intermédiaires produites suite à la réaction entre la coumarine et le radical hydroxyle. Pour finir, nous avons injecté les résultats des simulations dans le modèle biophysique NanOx, développé à l’origine à l’IPNL pour calculer des doses biologiques en hadronthérapie, afin de prédire la survie cellulaire en présence de AuNPs. Nous avons aussi implémenté le Local Effect Model (LEM), principal modèle biophysique utilisé dans le contexte des nanoparticules. Pour le LEM, nous nous sommes appuyés sur plusieurs approches dosimétriques proposées dans la littérature. Pour un système simpliste où les AuNPs étaient distribuées de façon homogène dans la cellule, nous avons montré que, selon l’approche dosimétrique, les prédictions de survies du LEM étaient significativement différentes. De plus, nous avons obtenu une augmentation de la mort cellulaire avec NanOx qui était due uniquement à l’augmentation macroscopique du dépôt de dose. Nous n’avons obtenu aucun effet supplémentaire dû aux électrons Auger, en contradiction avec les prédictions du LEM. Cette étude suggère que les modèles actuels proposés pour prédire l'effet radiosensibilisant des AuNPs doivent être améliorés pour être prédictifs, en prenant par exemple en compte de potentiels mécanismes biologiques mis en évidence par l'expérience / In radiation therapy, high-Z nanoparticles such as gold nanoparticles (GNPs) have shown particularly promising radiosensitizing properties. At an early stage, an increase in dose deposition and free radicals production throughout the tumour (photoelectric effect) and at sub-cellular scale (Auger cascade) might be responsible for part of the effect for low-energy X-rays. In this Ph.D work, we propose to study these early mechanisms with simulation tools, in order to better quantify them and better understand their impact on cell survival. We first finalised and validated Monte Carlo (MC) models, developed to track electrons down to low energy both in water (meV) and gold (eV). The comparison of theoretical predictions with available experimental data in the literature for gold provided good results, both in terms of secondary electron production and energy loss. This code allowed us to quantify the energy deposited in nanotargets located near the GNP, which is correlated with the probability to generate damages. This study required important optimisations in order to achieve reasonable computing time. We showed a significant increase of the probability of having an energy deposition in the nanotarget larger than a threshold, within 200 nm around the GNP, suggesting that GNPs may be particularly efficient at destroying biological nanotargets in its vicinity. The MC simulation was then used to quantify some chemical effects. At the macroscale, we quantified the increase of free radicals production for a concentration of GNPs. We also compared the radial distribution of chemical species following the ionisation of either a gold nanoparticle or a water nanoparticle. We showed that following an ionization, the average number of chemical species produced is higher for gold compared to water. However, in the vicinity of the nanoparticle, the number of chemical species was not necessarily higher for gold compared to water. This suggests that the effect of GNPs in its vicinity mostly comes from the increase of the probability of having an ionisation. We also studied several scenarios to explain the unexpectedly high experimental increase of the production of fluorescent molecules during the irradiation of a colloidal solution of GNPs and coumarin. Our study suggests that a plausible scenario to explain experimental measurements would be that GNPs interfere with an intermediate molecule, produced following the reaction between a coumarine molecule and a hydroxyl radical. During the last step of this Ph.D work, we injected our MC results in the biophysical model NanOx, originally developed at IPNL to calculate the biological dose in hadrontherapy, to predict cell survival in presence of GNPs. In addition, we implemented the Local Effect Model (LEM), currently the main biophysical model implemented for GNP-enhanced radiation therapy, to compare the NanOx and the LEM predictions with each other. In order to estimate cell survival with the LEM, we used various dosimetric approaches that were proposed in the literature. For a simple system where GNPs were homogeneously distributed in the cell, we showed that the LEM had different outcomes with regard to cell survival, depending on the dosimetric approach. In addition, we obtained an increase of cell death with the biophysical model NanOx that was purely due to the increase of the macroscopic dose. We did not obtain an increased biological effectiveness due to Auger electrons, which comes in contradiction with the LEM predictions. This study suggests that the current biophysical models available to predict the radiosensitizing effect of GNPs must be improved to be predictive. This may be done, for instance, by accounting for potential biological mechanisms evidenced by experimental works

Les canaux de potassium voltage-dépendant (Kv) sont des tétramères séparés en 12 familles. Chaque sous-unité est composée de six segments transmembranaires (S1-S6). Les quatre premiers (S1-S4) forment le senseur de voltage dont le rôle est de détecter des variations en potentiel membranaire grâce à des acides aminés chargés. Ces acides aminés vont bouger et ce mouvement va être transmis au second domaine, celui du pore (S5-S6). Les domaines du pore des quatre sous-unités vont se combiner pour créer le pore. Ces sous-unités peuvent former des canaux homomériques où chaque sous-unité est identique ou des canaux hétéromériques avec des membres de la même famille. Kv6.4 (KCNG4) est un membre de la famille de sous-unité silencieuse Kv6. Les familles de sous-unités silencieuses incluent également Kv5, Kv8 et Kv9. Ils ne peuvent pas former d’homomères. À la place, il doit former des hétéromères avec Kv2. Les canaux Kv2.1/Kv6.4 ont des propriétés différentes, lorsque comparées aux homomères de Kv2.1, particulièrement avec un décalage de l’inactivation vers les négatifs. Avec la technique du « cut-open voltage clamp fluorometry » (COVCF), nous avons pu déterminer que l’absence d’une charge positive à la position Kv6.4-Y345 est responsable pour une partie du décalage tout en étant capable de réduire ce décalage avec la mutation Kv6.4-Y345R. Nous avons également pu produire l’effet inverse dans Kv2.1 avec Kv2.1-R306Y. Également, nous avons déterminé que la mutation Kv6.4-L360P trouvée chez des patients souffrant de migraines mène à cette pathologie à cause d’un problème de trafic où les sous-unités mutées ne peuvent pas atteindre la surface et produire des canaux fonctionnels. Ce problème est causé par un bris dans l’hélice alpha du segment S4-S5. Uniquement des homomères de Kv2.1 se rendent à la surface ce qui réduit l’excitabilité membranaire. Nous proposons que lorsqu’exprimée dans le ganglion trigéminal, cette mutation mène à des migraines. / Voltage-gated potassium channels (Kv) are tetramers split into 12 families. Each subunit is composed of six transmembrane helices (S1-S6). The first four of those (S1-S4) form the voltage sensor domain whose role it is to detect variations in the membrane potential through charged amino acids. The movement of those amino acids will be transmitted to the second domain, the pore domain (S5-S6). The pore domain of all four subunits will combine to form the ion conducting pore. These subunits can form homomers where all four subunits are identical or heteromers with members of the same family. Kv6.4 (KCNG4) is a member of the silent subunit family Kv6, which also includes Kv5, Kv8 and Kv9. They cannot form functioning homomers. Instead, they form heteromers with Kv2. Kv2.1/Kv6.4 channels have different properties when compared to Kv2.1 homomers, particularly a negative shift of the voltage dependence of inactivation. With the cut-open voltage clamp fluorometry (COVC) technique, we were able to determine that the absence of a gating charge at position Kv6.4-Y345 is responsible for part of this shift. We were able to recover part of this shift with the mutation Kv6.4-Y345R. We were also able to produce the inverse effect in Kv2.1 with the mutation Kv2.1-R306Y. Also, we determined that the mutation Kv6.4-L360P. which is found in patients suffering from migraines, leads to this condition because of a trafficking defect caused by the mutation stopping the subunits from reaching the membrane and making functional channels. The defect is caused by a kink in the alpha helix of the S4-S5 linker. Only Kv2.1 homomers reach the membrane which reduces membrane excitability. We propose that when expressed in the trigeminal ganglion, this mutation leads to migraines because of this trafficking defect.

Cette thèse porte sur l’étude de la relation entre la structure et la fonction chez les cotransporteurs Na+/glucose (SGLTs). Les SGLTs sont des protéines membranaires qui se servent du gradient électrochimique transmembranaire du Na+ afin d’accumuler leurs substrats dans la cellule. Une mise en contexte présentera d’abord un bref résumé des connaissances actuelles dans le domaine, suivi par un survol des différentes techniques expérimentales utilisées dans le cadre de mes travaux. Ces travaux peuvent être divisés en trois projets. Un premier projet a porté sur les bases structurelles de la perméation de l’eau au travers des SGLTs. En utilisant à la fois des techniques de modélisation moléculaire, mais aussi la volumétrie en voltage imposé, nous avons identifié les bases structurelles de cette perméation. Ainsi, nous avons pu identifier in silico la présence d’une voie de perméation passive à l’eau traversant le cotransporteur, pour ensuite corroborer ces résultats à l’aide de mesures faites sur le cotransporteur Na/glucose humain (hSGLT1) exprimé dans les ovocytes. Un second projet a permis d’élucider certaines caractéristiques structurelles de hSGLT1 de par l’utilisation de la dipicrylamine (DPA), un accepteur de fluorescence dont la répartition dans la membrane lipidique dépend du potentiel membranaire. L’utilisation de la DPA, conjuguée aux techniques de fluorescence en voltage imposé et de FRET (fluorescence resonance energy transfer), a permis de démontrer la position extracellulaire d’une partie de la boucle 12-13 et le fait que hSGLT1 forme des dimères dont les sous-unités sont unies par un pont disulfure. Un dernier projet a eu pour but de caractériser les courants stationnaires et pré-stationaires d’un membre de la famille des SGLTs, soit le cotransporteur Na+/myo-inositol humain hSMIT2 afin de proposer un modèle cinétique qui décrit son fonctionnement. Nous avons démontré que la phlorizine inhibe mal les courants préstationnaires suite à une dépolarisation, et la présence de courants de fuite qui varient en fonction du temps, du potentiel membranaire et des substrats. Un algorithme de recuit simulé a été mis au point afin de permettre la détermination objective de la connectivité et des différents paramètres associés à la modélisation cinétique. / This thesis is about the structure/function relationship in Na+/glucose cotransporters (SGLTs). SGLTs are membrane proteins which use the Na+ transmembrane electrochemical gradient to accumulate their substrates within the cell. As an introduction, a short review of the current state of the field will be followed by a presentation of the different technics used in this work. This work can be divided in three main projects. In the first project, we investigated the structural basis of water permeation through SGLTs. By using molecular modeling technics, we have identified, in silico, a passive permeation pathway used by water to go through the cotransporter across the membrane. Using voltage-clamp volumetric measurement, we were able to corroborate these findings for hSGLT1 expressed in oocytes. A second project allowed elucidation of some of hSGLT1 structural characteristics through the use of dipicrylamine (DPA), a fluorescence acceptor whose repartition in the lipid membrane is voltage-dependant. Use of DPA concomitantly with voltage-clamp fluorescence and FRET (fluorescence resonance energy transfer) has clearly demonstrated the extracellular localisation of part of the 12-13 loop which was previously assumed to be intracellular. In addition, we have shown that hSGLT1 forms a dimeric structure where the subunits are linked by a disulfide bridge. A last project aimed at characterizing the steady-state and pre-steadystate currents of a member of the SGLT family named hSMIT2 (human Na/myo-inositol transporter 2). We showed that phlorizin is a poor inhibitor of pre-steady state currents following depolarisation, and the presence of a time, membrane potential and substrate dependent leak current. A simulated annealing algorithm was developed in order to allow objective determination of both the connectivity and the parameters associated with the optimal kinetic model.

Les etonnantes performances de l'organe auditif des mammiferes sont<br />notamment dues aux proprietes generiques des oscillateurs critiques<br />couples qui constituent le systeme. Cette these presente une etude<br />des proprietes critiques generiques des<br />systemes spatialement etendus d'oscillateurs stochastiques couples,<br />operant dans le voisinage d'une instabilite oscillante homogene ou<br />bifurcation de Hopf. Dans ce contexte, cette bifurcation constitue un<br />point critique dynamique hors equilibre, exhibant des proprietes<br />universelles qui sont canoniquement decrites par l'equation<br />Ginzburg-Landau complexe en presence de bruit. La formulation du probleme<br />en termes d'une theorie statistique dynamique des champs non hamiltonienne<br />nous permet d'etudier le comportement critique du systeme a l'aide des<br />techniques de la renormalisation dynamique perturbative.<br /><br />Dans un cas particulier, une analogie exacte avec le modele O(2) dynamique<br />nous permet d'ecrire une relation generalisee de la relation<br />fluctuation-dissipation et de deduire le comportement critique du systeme<br />directement a partir des etudes anterieures. Dans le cas general,<br />nous etablissons la structure du groupe de renormalisation de la theorie<br />dans un espace de dimension<br />4-epsilon, en lui adaptant les schemas de renormalisation de Wilson et<br />de Callan-Symanzik. La presence d'une frequence caracteristique dans le<br />systeme - la frequence des oscillations spontanees a la transition -<br />impose d'associer aux transformations de renormalisation un changement de<br />referentiel oscillant dependant de l'echelle. Nous effectuons le<br />calcul a l'ordre de deux boucles en theorie des perturbations, et montrons<br />que la classe d'universalite du modele est decrite par le point fixe du<br />modele dynamique dissipatif<br />O(2) dans un referentiel oscillant bien choisi. Ainsi, bien que la<br />dynamique soit hautement hors equilibre et brise les relations de bilan<br />detaille, une relation fluctuation-dissipation generalisee est<br />asymptotiquement restauree a la transition. Cette relation prevoit<br />l'existence de fortes contraintes sur les principales observables<br />experimentales : la fonction de correlation a deux points et la fonction<br />de reponse lineaire a un stimulus sinusoidal.

Cette thèse porte sur l’étude de la relation entre la structure et la fonction chez les cotransporteurs Na+/glucose (SGLTs). Les SGLTs sont des protéines membranaires qui se servent du gradient électrochimique transmembranaire du Na+ afin d’accumuler leurs substrats dans la cellule. Une mise en contexte présentera d’abord un bref résumé des connaissances actuelles dans le domaine, suivi par un survol des différentes techniques expérimentales utilisées dans le cadre de mes travaux. Ces travaux peuvent être divisés en trois projets. Un premier projet a porté sur les bases structurelles de la perméation de l’eau au travers des SGLTs. En utilisant à la fois des techniques de modélisation moléculaire, mais aussi la volumétrie en voltage imposé, nous avons identifié les bases structurelles de cette perméation. Ainsi, nous avons pu identifier in silico la présence d’une voie de perméation passive à l’eau traversant le cotransporteur, pour ensuite corroborer ces résultats à l’aide de mesures faites sur le cotransporteur Na/glucose humain (hSGLT1) exprimé dans les ovocytes. Un second projet a permis d’élucider certaines caractéristiques structurelles de hSGLT1 de par l’utilisation de la dipicrylamine (DPA), un accepteur de fluorescence dont la répartition dans la membrane lipidique dépend du potentiel membranaire. L’utilisation de la DPA, conjuguée aux techniques de fluorescence en voltage imposé et de FRET (fluorescence resonance energy transfer), a permis de démontrer la position extracellulaire d’une partie de la boucle 12-13 et le fait que hSGLT1 forme des dimères dont les sous-unités sont unies par un pont disulfure. Un dernier projet a eu pour but de caractériser les courants stationnaires et pré-stationaires d’un membre de la famille des SGLTs, soit le cotransporteur Na+/myo-inositol humain hSMIT2 afin de proposer un modèle cinétique qui décrit son fonctionnement. Nous avons démontré que la phlorizine inhibe mal les courants préstationnaires suite à une dépolarisation, et la présence de courants de fuite qui varient en fonction du temps, du potentiel membranaire et des substrats. Un algorithme de recuit simulé a été mis au point afin de permettre la détermination objective de la connectivité et des différents paramètres associés à la modélisation cinétique. / This thesis is about the structure/function relationship in Na+/glucose cotransporters (SGLTs). SGLTs are membrane proteins which use the Na+ transmembrane electrochemical gradient to accumulate their substrates within the cell. As an introduction, a short review of the current state of the field will be followed by a presentation of the different technics used in this work. This work can be divided in three main projects. In the first project, we investigated the structural basis of water permeation through SGLTs. By using molecular modeling technics, we have identified, in silico, a passive permeation pathway used by water to go through the cotransporter across the membrane. Using voltage-clamp volumetric measurement, we were able to corroborate these findings for hSGLT1 expressed in oocytes. A second project allowed elucidation of some of hSGLT1 structural characteristics through the use of dipicrylamine (DPA), a fluorescence acceptor whose repartition in the lipid membrane is voltage-dependant. Use of DPA concomitantly with voltage-clamp fluorescence and FRET (fluorescence resonance energy transfer) has clearly demonstrated the extracellular localisation of part of the 12-13 loop which was previously assumed to be intracellular. In addition, we have shown that hSGLT1 forms a dimeric structure where the subunits are linked by a disulfide bridge. A last project aimed at characterizing the steady-state and pre-steadystate currents of a member of the SGLT family named hSMIT2 (human Na/myo-inositol transporter 2). We showed that phlorizin is a poor inhibitor of pre-steady state currents following depolarisation, and the presence of a time, membrane potential and substrate dependent leak current. A simulated annealing algorithm was developed in order to allow objective determination of both the connectivity and the parameters associated with the optimal kinetic model.

Cry6Aa1, une nouvelle toxine produite par Bacillus thuringiensis (Bt), agit comme insecticide sur la chrysomèle du maïs (WCRW). Dans cette étude, on démontre que Cry6Aa1 est une toxine formeuse de pores (TFP) en bicouches lipidiques planes (BLP). Contrairement aux autres toxines de Bt étudiées jusqu’à présent, la formation de pores par Cry6Aa1 ne requiert pas de prétraitement par protéases et se produit à des doses de toxine deux à trois ordres de grandeur plus faibles que celles nécessaires pour les autres toxines de Bt dans les mêmes conditions. La formation de pores par la forme non traitée de Cry6Aa1 dépend du pH; les pores obtenus ont des conductances comprises entre 31 et 689 pS en conditions symétriques de 150 mM de KCl; ils sont cationiques avec un comportement cinétique complexe. Les propriétés biophysiques des pores ne changent pas lorsque la toxine est traitée avec le suc du mésenthéron de l’insecte (Cry6Aa1 WCR1). Par contre, un traitement à la trypsine (Cry6Aa1 TT) modifie la conductance et la sélectivité des pores à pH 5,5 (le pH physiologique de l’intestin de WCRW). La reconstitution en BLP de fraction de membrane native du mésenthéron de WCRW affecte les propriétés des pores formés par Cy6Aa1. Les déterminants moléculaires du mode d’action de cette nouvelle toxine formeuse de pores semblent donc différer de ceux décrits précédemment pour d’autres toxines de Bt. La structure atomique tridimensionnelle de Cry6Aa1 vient tout juste d’être élucidée. Elle montre que la toxine adopte une conformation riche en hélices α qui ressemble fortement à celle de la TFP ClyA produite par E. coli. En se fondant sur les données disponibles pour ClyA, on a étudié l’effet de divers changements dans les régions N et C terminales de Cry6Aa1 sur sa capacité de former des pores en BLP. / Cry6Aa1 is a new toxin produced by Bacillus thuringiensis (Bt), which displays insecticidal activity against the Western corn rootworm (WCRW). The present work demonstrates that Cry6Aa1 is a pore-forming toxin (PFT) in planar lipid bilayers (PLBs). Contrary to other Bt toxins tested so far, pore formation by Cry6Aa1 does not require protease pretreatment and takes place at doses that are two to three orders of magnitude lower than those required for other Bt toxins under similar conditions. Pore formation by Cry6Aa1 is pH-dependent; the conductances of the pores range between 31 and 689 pS under symmetrical 150 mM KCl conditions; they are cationic and display a complex kinetic behaviour. The treatment of the toxin with midgut juice (Cry6Aa1 WCR1) does not change the biophysical properties of the pores. However, the treatment with trypsin (Cry6Aa1 TT) affects their conductance and selectivity at pH 5.5 (the WCRW gut physiological pH). The incorporation in PLBs of native membrane material from WCRW midgut affects the behaviour of the Cry6Aa1 pores. The molecular determinants of the mode of action of this new PFT appear therefore to differ from those reported before for other Bt toxins. The three-dimensional (3-D) atomic structure of Cry6Aa1 has just been elucidated. It shows that the toxin assumes an α-helix-rich configuration, which is quite similar to that of the ClyA PFT produced by E. coli. Based on the data available for ClyA, we have studied how different changes in the N- and C-terminal regions of Cry6Aa1 affect its pore formation ability in PLBs.

Les toxines Cry sont des protéines synthétisées sous forme de cristaux par la bactérie bacille de Thuringe pendant la sporulation. Elles sont largement utilisées comme agents de lutte biologique, car elles sont toxiques envers plusieurs espèces d’invertébrées, y compris les nématodes. Les toxines Cry5B sont actives contre certaines espèces de nématodes parasites, y compris Ankylostoma ceylanicum un parasite qui infeste le système gastro-intestinal des humains. Jusqu’au présent, le mode d’action des toxines Cry nématicides reste grandement inconnu, sauf que leurs récepteurs spécifiques sont des glycolipides et qu’elles causent des dommages importants aux cellules intestinales. Dans cette étude, on démontre pour la première fois que la toxine nématicide Cry5Ba, membre de la famille des toxines à trois domaines et produite par la bactérie bacille de Thuringe, forme des pores dans les bicouches lipidiques planes en absence de récepteurs. Les pores formés par cette toxine sont de sélectivité cationique, à pH acide ou alcalin. Les conductances des pores formés sous conditions symétriques de 150 mM de KCl varient entre 17 et 330 pS, à pH 6.0 et 9.0. Les niveaux des conductances les plus fréquemment observés diffèrent les uns des autres par environ 17 à 18 pS, ce qui est compatible avec l’existence d’arrangement d’un nombre différent de pores élémentaires similaires, activés de façon synchronisée, ou avec la présence d’oligomères de tailles variables et de différents diamètres de pores. / Cry toxins are proteins synthetized as crystal inclusions by the Bacillus thuringiensis bacterium upon sporulation. They are used widely as biological control agents, as they exhibit toxicity to a range of invertebrates, including nematodes. The Cry5B toxins are active against a number of parasitic nematode species, such as Ancylostoma ceylanicum a human gastro-intestinal parasite. So far, the mode of action of nematicidal Cry toxins is largely unknown, except for the facts that their specific receptors are glycolipids and that they cause prominent damage to nematode intestinal cells. In this study, we show for the first time that the nematicidal Cry5Ba toxin, a member of the three domain family of toxins produced by the Bacillus thuringiensis forms pores in receptor-free planar lipid bilayers. The pores formed by the toxin were cation selective, both under acid and alkaline pH conditions. Under symmetrical 150 mM KCl conditions, pore activity was characterized by conductances ranging from 17 to 330 pS, at both pH 6.0 and 9.0. The most frequently observed conductance levels differed from each other by approximately 17 to 18 pS consistent with the existence of clusters of different number of elementary, similar, co-operatively gated pores, or with the presence of variable size oligomers with different pore diameters.

Les canaux ioniques dépendants du voltage sont responsables de l'initiation et de la propagation des potentiels d'action dans les cellules excitables. De nombreuses maladies héréditaires (channelopathies) sont associées à un contrôle défectueux du voltage par ces canaux (arythmies, épilepsie, etc.). L’établissement de la relation structure-fonction exacte de ces canaux est donc crucial pour le développement de nouveaux agents thérapeutiques spécifiques. Dans ce contexte, le canal procaryote dépendant du voltage et sélectif au potassium KvAP a servi de modèle d’étude afin d’approfondir i) le processus du couplage électromécanique, ii) l’influence des lipides sur l’activité voltage-dépendante et iii) l’inactivation de type closed-state. Afin de pallier à l’absence de données structurales dynamiques du côté cytosolique ainsi que de structure cristalline dans l’état fermé, nous avons mesuré le mouvement du linker S4-S5 durant le gating par spectroscopie de fluorescence (LRET). Pour ce faire, nous avons utilisé une technique novatrice du contrôle de l’état conformationnel du canal en utilisant les lipides (phospholipides et non phospholipides) au lieu du voltage. Un modèle dans l’état fermé a ainsi été produit et a démontré qu’un mouvement latéral modeste de 4 Å du linker S4-S5 est suffisant pour mener à la fermeture du pore de conduction. Les interactions lipides - canaux jouent un rôle déterminant dans la régulation de la fonction des canaux ioniques mais ne sont pas encore bien caractérisées. Nous avons donc également étudié l’influence de différents lipides sur l’activation voltage - dépendante de KvAP et mis en évidence deux sites distincts d’interactions menant à des effets différents : au niveau du senseur de voltage, menant au déplacement de la courbe conductance-voltage, et du côté intracellulaire, influençant le degré de la pente de cette même courbe. Nous avons également démontré que l’échange de lipides autour de KvAP est extrêmement limité et affiche une dépendance à l’état conformationnel du canal, ne se produisant que dans l’état ouvert. KvAP possède une inactivation lente particulière, accessible depuis l'état ouvert. Nous avons étudié les effets de la composition lipidique et de la température sur l'entrée dans l'état inactivé et le temps de récupération. Nous avons également utilisé la spectroscopie de fluorescence (quenching) en voltage imposé afin d'élucider les bases moléculaires de l’inactivation de type closed-state. Nous avons identifié une position à la base de l’hélice S4 qui semble impliquée à la fois dans le mécanisme responsable de ce type d'inactivation et dans la récupération particulièrement lente qui est typique du canal KvAP. / Voltage-gated ion channels are responsible for the initiation and propagation of action potentials in excitable cells. Several hereditary diseases (channelopathies) are associated with a defective voltage control by these channels, leading to arrhythmias, epilepsy, etc. Hence, establishing the exact structure/function relation for ion channels is crucial for the development of new specific therapeutic agents. Here, the bacterial voltage-gated potassium channel KvAP served as a model to study i) electromechanical coupling, ii) influence of lipids on the voltage dependent activity and iii) closed-state inactivation. To overcome the lack of structural information on the cytosolic side and of crystal structure in the closed state, we determined the S4-S5 linker movement during gating using fluorescence spectroscopy (LRET). We were able to control the conformational state of the channels by using lipids (phospholipids and non phospholipids) instead of voltage clamp. Based on these experimental constraints, a model in the closed state was produced, showing that a small 4Å radial displacement of the S4-S5 linker is sufficient to close the conduction pore. Interactions between lipids and membrane proteins play an important role in the regulation of ion channels activity but are not well characterized. We studied the influence of different lipids on KvAP voltage-dependent activation and showed two distinct effects related to different interactions sites: one bound to the voltage sensor, leading to a shift of the conductance-voltage curve, and another at the intracellular side near the pore region, affecting the steepness of this curve. We also showed that the exchange of lipids is very limited around KvAP and seems to be state dependent, occuring only when the channels are kept in the open state. KvAP has a slow inactivation atypical, accessible from the open state. We studied the effects of lipid composition and temperature on entry into inactivation and recovery. We also used voltage-clamp fluorometry in bilayers to investigate closed-state inactivation molecular basis. We identified a position at the bottom of the S4 helix that seems involved in the mechanism for slow inactivation and the extremely slow recovery from inactivation typically displayed by KvAP.

Il est relativement bien établi que les crises focales entraînent une augmentation régionale du flot sanguin dans le but de soutenir la demande énergétique en hémoglobine oxygénée des neurones épileptiques. Des changements hémodynamiques précoces ont également été rapportés dans la région homologue controlatérale, bien que ceci ait été moins bien caractérisé. Dans cette étude, notre objectif est de mieux caractériser, lors de crises focales, la nature des changements hémodynamiques précoces dans la région homologue controlatérale au foyer épileptique. L'imagerie optique intrinsèque (IOI) et la microscopie deux-photons sont utilisées pour étudier les changements hémodynamiques dans la région homologue controlatérale au site de crises focales induites par l’injection de 4-aminopyridine (4-AP) dans le cortex somatosensitif ipsilatéral de souris. Dans l'étude d'IOI, des changements de l’oxyhémoglobine (HbO), de la désoxyhémoglobine (HbR) et du débit sanguin cérébral ont été observées dans la région homologue controlatérale au site de crises focales lors de toutes les crises. Toutefois, ces changements étaient hétérogènes, sans patron cohérent et reproduisible. Nos expériences avec la microscopie deux-photons n’ont pas révélé de changements hémodynamiques significatifs dans la région homotopique controlatérale lors de trains de pointes épileptiques. Nos résultats doivent être interprétés avec prudence compte tenu de plusieurs limitations: d’une part absence de mesures électrophysiologiques dans la région d’intérêt controlatérale au foyer simultanément à l’imagerie deux-photons et à l'IOI; d’autre part, lors des expériences avec le deux-photons, incapacité à générer de longues décharges ictales mais plutôt des trains de pointes, couverture spatiale limitée de la région d’intérêt controlatérale, et faible puissance suite au décès prématuré de plusieurs souris pour diverses raisons techniques. Nous terminons en discutant de divers moyens pour améliorer les expériences futures. / It has been well demonstrated that focal seizures are associated with a significant increase in regional cerebral blood flow to actively supply discharging neurons with oxygenated hemoglobin. There is also some evidence to suggest that focal seizures elicit early hemodynamic changes in the contralateral homotopic area, although this has been less well documented. In this study, we aim to better characterize the nature of early hemodynamic responses contralateral to the epileptic focus during seizures. We used intrinsic optical imaging (IOI) and two-photon laser microscopy to measure the hemodynamic changes in the homotopic contralateral area following focal seizures induced by an injection of 4-aminopyridine (4-AP) in the mouse somatosensory neocortex. In the study using IOI, oxyhemoglobin (HbO), deoxyhemoglobin (HbR) and cerebral blood flow (CBF) changes were observed in the homotopic area contralateral to the focus during all seizures. However, these changes were rather heterogenous, lacking any consistent or reproducible pattern. Our two-photon study showed no significant hemodynamic changes at the capillary level in the homotopic area contralateral to the ictal focus during epileptic spike trains. However, these findings must be interpreted cautiously in light of several limitations we encountered during the experiments. Specifically, we were unable to simultaneously record electrophysiology in the contralateral homotopic area. Furthermore, during our two-photon experiments, we failed to induce long ictal discharges (inducing only spike trains) had a limited sampling of the contralateral homotopic area and reduced power as a result of low mice survival rate. We conclude by providing alternatives to possibly improve future experiments.

Les Erythropoietin-producing hepatocyte (EPH) sont la plus grande famille de récepteurs tyrosine kinase. Leurs ligands, les éphrines (EFNs), sont aussi des molécules exprimées à la surface cellulaire. Les EPH/EFNs sont impliqués dans de nombreux processus biologiques. L'hypertension artérielle (PA) est une maladie chronique qui, aujourd'hui, est devenue un problème médical critique dans le monde entier et un enjeu de santé publique. La découverte de nouvelles thérapeutiques de l'hypertension sont d'une grande importance pour la santé publique. Jusqu’à tout récemment, il existe seulement quelques études concernant le rôle de l’axe EPH/EFNs sur la fonction des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Dans nos études précédentes, nous avons montré qu'EPHB6 et EFNB1, de concert avec les hormones sexuelles, régulent la PA. Dans la présente étude, nous avons constaté que les différents membres de la famille EPH/EFN peuvent réguler soit positivement, soit négativement, la contractilité des CMLV et la PA: tandis que EPHB4 et EFNB2 appartiennent à la première catégorie, EFNB1, EFNB3 et EPHB6 appartiennent à la deuxième. In vivo, des souris males, mais non pas des femelles, porteuses d’une mutation EPHB4 (KO) spécifique du muscle lisse présentent une PA diminuée, comparée aux souris témoins (WT). Les CMLV de souris EPHB4 KO, en présence de testostérone, ont montré une contractilité réduite lors de la stimulation par la phényléphrine (PE). Au niveau moléculaire, la phosphorylation de la protéine kinase II dépendante de Ca2+/calmoduline et de la kinase de la chaine légère de la myosine (CLM) est augmentée, tandis que la phosphorylation de la kinase de la CLM est réduite dans les CMLV KO lors de la stimulation par PE, par rapport au WT CMLV. Cela fournit une base moléculaire à la réduction de la PA et de la contractilité des CMLV chez les souris EPHB4 KO. EFNB2 est le ligand majeur de l’EPHB4. Comme attendu, les souris EFNB2 KO spécifique du muscle lisse avaient un phénotype de PA semblable, quoique non identique, aux souris EPHB4 KO. Les souris mâles EFNB2 KO, mais pas femelles, sous régime régulier ou riche en sel, présentent une PA réduite, par rapport à leurs homologues WT. Au niveau cellulaire, les CMLV des souris KO ont montré une contractilité réduite lors de la stimulation par PE par rapport aux témoins WT. Une région de l’acide aminé (aa) 313 à l’aa 331 dans la partie intracellulaire d’EFNB2 est essentielle pour la signalisation inverse qui régule la contractilité des CMLV, selon des études de mutation-délétion. Dans une étude de génétique humaine, nous avons identifié, dans le gène EFNB2, six SNP qui étaient associées significativement au risque d'hypertension artérielle, de façon dépendante du sexe, ce qui corrobore nos résultats chez les souris. En revanche, la délétion du gène EFNB3 (KO) chez les souris femelles aboutit à une PA élevée et à une augmentation des résistances des petites artères in vivo, améliore la contractilité des petites artères ex-vivo et augmente la contractilité des CMLV in vitro. Les souris mâles KO ont une PA normale, mais la castration conduit à une augmentation significative de la PA dans les souris KO, mais pas dans les souris WT. Les CMLV des souris KO femelles ont montré une phosphorylation accrue de la CLM et une phosphorylation réduite de la kinase de la CLM, ce qui fournit à nouveau une base moléculaire aux phénotypes de PA et de contractilité des CMLV observés. Ce changement de signalisation est attribuable à une protéine adaptatrice Grip1. En effet, dans une étude d'association pan génomique par le Consortium International pour la Pression Sanguine, un SNP dans le gène GRIP1 a approché le seuil de significativité de la valeur p pour son association avec la pression diastolique. Nos recherches, pour la première fois, ont révélé que EPH/EFNs sont de nouveaux composants dans le système de régulation de la PA. Les membres de la famille EPH/EFN peuvent agir comme des forces Yin et Yang pour régler finement le tonus des vaisseaux pour assurer l'homéostasie de la PA et de sa régulation. Ces effets de EPH/EFNs dépendent du sexe et des niveaux d’hormones sexuelles. À partir de ces nouvelles connaissances, nous pourrions développer une nouvelle thérapie personnalisée pour l’hypertension artérielle, utilisant des antagonistes d'hormones sexuelles ou des thérapies de remplacement d'hormones sexuelles, selon les niveaux d'hormones sexuelles des patients et les mutations dans les gènes de l'EPH/EFN. / Erythropoietin-producing hepatocyte (EPH) kinases are the largest family of receptor tyrosine kinases. Their ligands, ephrins (EFNs), are also cell surface molecules. Ephs/EFNs are implicated in many biological processes. Hypertension is a chronic medical condition of high arterial blood pressure (BP). New hypertension therapeutic treatments are of great importance for public health. Until recently, there are only a few studies related to the role of EPHs/EFNs in vascular smooth muscle cell (VSMC) function. In our previous studies, we have found that EPHB6 and EFNB1 function in concert with sex hormones to regulate BP. In the present investigation, we found that different EPH/EFN family members can either positively or negatively regulate the VSMC contractility and BP: while EPHB4 and EFNB2 belong to the former category, EFNB1, EFNB3 and EPHB6, the latter. In vivo, male but not female smooth muscle-specific EPHB4 knockout (KO) mice presented decreased BP, compared to WT controls. VSMCs from EPHB4 KO mice in the presence of testosterone showed reduced contractility. EFNB2 is the major ligand of EPHB4. As expected, smooth muscle-specific EFNB2 KO mice had a similar although not identical BP phenotype as EPHB4 KO mice. Male but not female EFNB2 KO mice on regular or high-salt diet presented reduced BP, compared to WT counterparts. At the cellular level, the KO VSMCs showed reduced contractility compared to WT controls. In a human genetic study, we identified in the EFNB2 gene six SNPs that were significantly associated with hypertension risk in a sex-dependent way, corroborating our findings in mice. On the other hand, EFNB3 gene KO in female mice resulted in elevated BP and small artery resistance in vivo, enhanced small arterial contractility ex vivo, and augmented VSMC contractility in vitro. Male KO mice had normal BP, but castration led to significant BP elevation in KO but not in WT mice. VSMCs from female KO mice showed heightened MLC phosphorylation and reduced MLC kinase phosphorylation. This signaling change was mediated through an adaptor protein Grip1. Indeed, in a genome-wide association study by the International Consortium for Blood Pressure, an SNP in the GRIP1 gene approached the significant threshold p-value for its association with diastolic BP. Our research for the first time revealed that EPHs/EFNs are novel components in the BP regulation system. Members of the EPH/EFN family may act as Yin and Yang forces to finely tune the vessel tone for BP homeostasis and regulation. Such effects of EPHs/EFNs depend on sex and sex-hormone levels. Based on this new knowledge, we could develop novel personalized hypertension therapy using sex hormone antagonists or sex hormone replacement therapy, depending on the sex hormone levels of the patients and mutations in EPH/EFN genes.