En aquest treball s’ha desenvolupat un mètode en dues etapes per a l’obtenció d’extractes rics en monoglicèrids a partir de llavors de soja i de sèsam. La primera etapa consisteix en una hidròlisi i esterificació directa amb glicidol i solketal dels triglicèrids continguts en les llavors, catalitzada amb miceli liofilitzat de Rhizopus oryzae en absència de solvent. La segona etapa ha estat la desprotecció del glicerol protegit en forma de 1,2-acetonid (solketal) amb catalitzadors àcids. El rendiment màxim d’obtenció de monoglicèrids a l’extracte final de reacció ha estat del 81 %, amb les següents condicions: Temps d’hidròlisi de 24 h i d’esterificació de 6 h emprant solketal, a una temperatura de reacció de de 50 °C per a la primera etapa i utilitzant com a solvent una barreja acetonitril:HCl 1M en proporció 4:1 (v/v), amb un temps de reacció de 6 h a temperatura ambient per a la segona etapa. / En este trabajo se ha desarrollado un método en dos etapas para la obtención de extractos ricos en monoglicéridos a partir de semillas de soja y de sésamo. La primera etapa consta de una hidrólisis y esterificación directa con glicidol y solketal de los triglicéridos de las semillas, catalizada con micelio liofilizado de Rhizopus oryzae en ausencia de solvente. La segunda etapa ha consistido en la desprotección del grupo 1,2-acetonido (solketal), empleando catalizadores ácidos. El rendimiento máximo de obtención de monoglicéridos en el extracto final de reacción ha sido del 81 %, empleando las siguientes condiciones: tiempo de hidrólisis de 24 h y de esterificación de 6 h utilizando solketal, a una temperatura de reacción de 50 °C para la primera etapa y utilizando como solvente una mezcla de acetonitrilo:HCl 1M en proporción 4:1 (v/v), con un tiempo de reacción de 6 h a temperatura ambiente para la segunda etapa. / In this work, a two-step method has been developed to prepare monoglyceride enriched extracts from soybean and sesame seeds. In the first step, direct extraction, hydrolysis and esterification of triglycerides from seeds is performed with glycidol and solketal. Reactions are catalyzed with lyophilized mycelium of Rhizopus oryzae in solvent-free conditions. The second step is the cleavage of solketal ring (1,2-acetonide structure) using acid catalysts. The maximum yield of monoglycerides in the two-step reaction process is 81 % using the following conditions: reaction time of 24 h for hydrolysis and 6 h for esterification using solketal, at a temperature of 50 °C in the first step and using a solvent mixture of acetonitrile:1 M HCl in 4:1 (v/v) with a reaction time of 6 h at room temperature in the second step.

La forma en que el filamento de nucleosomas alcanza diversos estadios de compactación y acaba formando el cromosoma metafásico al final del ciclo celular sigue siendo uno de los problemas más difíciles de resolver en el campo de la biología estructural. La fibra de 30 nm ha sido considerada durante mucho tiempo el segundo nivel de plegamiento de la cromatina, pero la mayoría de los modelos de plegamiento basados en fibras han sido propuestos a partir de estudios realizados en condiciones de muy baja fuerza iónica. Nuestro grupo de investigación ha realizado diversos estudios acerca de la estructura interna del cromosoma metafásico empleando diversas técnicas microscópicas, que han permitido observar un nuevo elemento de plegamiento: la placa de cromatina. El objetivo general de esta tesis es, por un lado, investigar la estructura de la cromatina durante la interfase en condiciones iónicas fisiólogicas y, por otro lado, obtener información estructural de alta resolución de las placas de cromatina observadas en cromosomas metafásicos. En primer lugar, se ha realizado un estudio de la estructura de la cromatina procedente de núcleos bajo condiciones iónicas propias de la interfase mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y se ha evaluado la capacidad autoasociativa de fragmentos de cromatina procedentes de núcleos interfásicos. En segundo lugar, se ha estudiado la estructura interna del cromosoma metafásico mediante la técnica de dispersión de rayos X de sincrotrón a bajo ángulo (SAXS). Por último, se ha obtenido información ultraestructural de la cromatina metafásica empleando la técnica de crio-tomografía electrónica (crio-ET). Los resultados de TEM muestran que la cromatina emanada de núcleos interfásicos presenta agregados amorfos y placas. El análisis de la estructura en las fases G1, S y G2 indica que las placas están presentes a lo largo de toda la interfase y que su compactación aumenta a medida que el ciclo celular avanza. En comparación con las placas metafásicas, las interfásicas son de dimensiones más reducidas y presentan menor tendencia al apilamiento. La falta de cohesión entre placas podría estar relacionada con el aumento de accesibilidad del DNA que se requiere durante los procesos de transcripción y replicación. Los experimentos realizados con fragmentos de cromatina interfásica indican una clara tendencia a autoasociarse para formar estructuras laminares. Al utilizar fragmentos procedentes de núcleos en fase G1, S y G2 se observa que las placas formadas en la interfase temprana son pequeñas y laxas, mientras que las placas en la interfase tardía presentan tamaños mayores y son más compactas. El análisis mediante crio-TE de la cromatina procedente de cromosomas metafásicos ha permitido observar que, en medio acuoso vitrificado, en ausencia de sustratos y en condiciones iónicas próximas a la metafase, la cromatina presenta una estructura laminar. Las placas de cromatina analizadas presentan un grosor de unos 10 nm, similar al diámetro del nucleosoma. En las placas desestructuradas pueden visualizarse nucleosomas como entidades individuales, pero en las placas compactas únicamente se observan líneas transversales que corresponden al DNA nucleosomal. La distancia entre estas líneas es de unos 5 nm, y es equivalente a la distancia entre las líneas visibles en el interior de nucleosomas individuales con diversas orientaciones. Estos resultados sugieren que los nucleosomas en las placas se disponen irregularmente. Frecuentemente, se ha observado que las placas pueden interaccionar a través de sus bordes, formando estructuras cilíndricas, o lateralmente, formando bicapas o multicapas. El grosor de dos placas en contacto es de 16 nm, que es significativamente menor que el grosor esperado para dos placas individuales (20 nm). De acuerdo con observaciones anteriores, estos resultados indican que los nucleosomas de ambas placas se interdigitan. En una estructura multilaminar interdigitada, los nucleosomas pueden interaccionar lateralmente. La distancia entre nucleosomas con interacción lateral es de 6 nm; equivalente a la distancia entre placas apiladas y que coincide con la difracción dominante a 6 nm observada en los experimentos de SAXS en condiciones iónicas metafásicas. Los resultados obtenidos refuerzan el modelo de las placas finas de cromatina para el cromosoma metafásico. La existencia de placas en interfase sugiere que, además de proteger el DNA, estas estructuras laminares deben participar en las diversas funciones de la cromatina a lo largo del ciclo celular. / The mechanism by which the nucleosome filament reaches different stages of compaction and finally forms the metaphase chromosome at the end of the cell cycle still remains one of the most challenging problems in the field of structural biology. The 30 nm fiber has been considered for many years the second level of compaction of chromatin, but most folding models based in fibres have been proposed from studies performed under very low ionic strength conditions. Our research group has conducted several studies about the internal structure of metaphase chromosome using microscopic techniques, which have allowed to observe a new folding element: the chromatin plate. The overall objective of this thesis is, first, to investigate the structure of chromatin during interphase under physiological ionic conditions and, second, to obtain high-resolution structural information of the chromatin plates observed in metaphase chromosomes. Chromatin structure from interphase nuclei under physiological conditions has been studied by transmission electron microscopy (TEM) and self-assembly capability of chromatin fragments from interphase nuclei has also been investigated. The internal structure of the metaphase chromosome has been studied using small angle synchrotron X-ray scattering (SAXS). Finally, ultrastructural information from metaphase chromatin has been obtained using cryo-electron tomography (cryo-ET). TEM results show that chromatin from interphase nuclei is formed by amorphous aggregates and plates. The analysis of chromatin structure from G1, S and G2 nuclei shows that plates are present along the entire interphase and its compaction increases along the cell cycle. In contrast to metaphase plates, interphase plates have smaller dimensions and lower stacking tendency. The lack of cohesion between interphase plates could be related to the increased accessibility of the DNA required for the transcription and replication processes. Experiments with interphase chromatin fragments show a clear self-assembly tendency to form laminar structures. By using fragments from G1, S and G2 phase nuclei, it was found that plates formed in early interphase are small and show lower compaction, whereas in the latter interphase plates have larger sizes and are more compact. The analysis of chromatin from metaphase chromosomes by cryo-ET allowed to see that in vitrified aqueous medium, in the absence of substrates and close to the metaphase ionic conditions, chromatin has a laminar structure. Analyzed chromatin plates have a thickness of about 10 nm, similar to the diameter of the nucleosome. Nucleosomes can be seen as individual units in unstructured plates, but in the compact ones only transverse lines corresponding to nucleosomal DNA are observed. The distance between these lines is about 5 nm; it is equivalent to the distance between the visible lines within individual nucleosomes in different orientations. These results suggest that the nucleosomes in the plates are irregularly arranged. It has often been observed that the plates can interact through their edges, forming cylindrical structures, or laterally, forming bilayers or multilayers. The thickness of two plates in contact is 16 nm, which is significantly lower than expected for two individual plates (20 nm). Consistent with previous observations, the results indicate that nucleosomes from both plates are interdigitated. In an interdigitated multilayered structure, nucleosomes may interact laterally. The distance between nucleosomes with lateral interaction is 6 nm. This is equivalent to the distance between stacked plates and is consistent with the dominant diffraction peak at 6 nm observed in SAXS experiments. These results reinforce the model of thin plates for the metaphase chromosome. The existence of plates in interphase suggests that, besides protecting the DNA, these laminar structures must participate in diverse functions of chromatin throughout the cell cycle.

Tesi realitzada a l'Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC-CSIC) / One of the ultimate goals in biomedicine is to understand the relationship between structure, function, and dynamics of biomolecules in living cells. The biophysical tools designed to gain more insight into metabolism, trafficking and interaction of the sphingolipids (SLs), require the use of high molar concentrations of fluorescence lipid analogues, labelled with bulky chromophores, such BODIPY or NBD, resulting in altered biophysical properties of the cell membrane. Recently, lipids tagged with conjugated linear polyene moieties, which are strongly absorbing chromophores that may attain modest but useful fluorescence yields, have been reported to behave in vivo like their endogenous counterparts. Nevertheless, when these labelled lipids are part of the N-acyl or the O-acyl chains of the SLs, the fluorophore can be released by hydrolysis of the amide or the ester bonds, and the resulting sphingoid base is no longer traceable. Taking into account the above considerations, the main objective of this thesis is to synthesize novel intrinsically-fluorescent sphingosine (Sph) and ceramide (Cer) probes, labelled with five conjugated double bonds in the sphingoid base backbond, in order to analyse membrane microdomains that are temporarily enriched in certain lipids. Additionally, the fluorescence of these probes can be modulated with total spatiotemporal control by the presence of a suitable radical quencher that can be removed by the action of a specific enzyme. Initially, as a proof of concept, three probes derived from γ-aminobutyric acid (GABA), based on a conjugated pentaene system with a radical scavenger (n-DOXYL free radical group) at different positions, were synthesised. These probes are structural analogues of palmitoyl-Cer lacking the hydroxyl group at C1 of the sphingoid chain. In addition, the secondary hydroxyl group at C3 has been replaced with an ester group. Despite the overall effect is a lower polarity of the headgroup, GABA-pentaene probes were still useful tools to evaluate the biophysical properties of these dual fluorophore-quencher systems in model membranes. With the GABA-pentaene probes in hand, different biophysical studies were developed in lipid vesicles. Fluorescence studies, differential scanning calorimetry and electron paramagnetic resonance measurements exhibited the ability of these probes to detect membrane lipids in gel phase, being relevant in view of the novel evidences pointing at the existence of gel microdomains in cell membranes. In addition, these Cer analogues may be particularly useful probes for the observation of highly-ordered bilayers by confocal microscopy, since its emission was higher in gel than in fluid domains, and in liquid-ordered than in liquid-disordered areas. Finally, different synthetic protocols for the construction of conformationally constrained pentaene-Sph and -Cer analogues were designed. The combination of Horner-Wadsworth-Emmons (HWE) and Wittig olefinations gave access to triene and pentane alkyne intermediates. In turn, these alkynes were found to be versatile synthons for the preparation of SLs analogues. By means of nucleophilic alkynylations, polyenyne-Sph analogues were obtained, whereas a hydrozirconation approach allowed the synthesis of the first pentaene palmitoyl-Cer analogue. Additionally, in light of the apparent instability of the conjugated pentaene system under acidic conditions, an alternative unreported serinal derivative building block was synthesised, which enabled a selective deprotection under mild basic conditions. Overall, synthetic approaches to polyene sphingosine analogues have been achieved. Remarkably, the pentaene moiety has been introduced in the sphingoid base backbond for the first time, providing new tools to directly observe their distribution in lipid bilayers. In addition, biophysical studies revealed the suitability of polyene moieties for fluorescence detection, by means of the simplified models GABA-pentaene probes. / Actualmente, uno de los retos de la biomedicina es profundizar más en el metabolismo, señalización e interacciones de los esfingolípidos (SLs), mediante empleo de técnicas biofísicas que no alteren las propiedades de las membranas celulares. El estudio y la visualización de los SLs, generalmente, va asociado al uso de concentraciones molares muy elevadas de sondas marcadas con grupos fluorescentes, cuyos cromóforos presentan estructuras rígidas, de considerable tamaño y volumen (NBD, BODIPY), generando un escenario artificial que dista de las condiciones fisiológicas. Con objeto de reducir el impacto que produce el volumen de los grupos cromóforos en la estructura y empaquetamiento de los lípidos de membrana, se han utilizado sistemas de dobles enlaces conjugados, fluorescentes, los cuales se comportan in vivo de forma similar a sus análogos naturales. Sin embargo, hasta el momento, no se ha diseñado ninguna sonda que contenga el sistema pentaénico incorporado en la estructura de la base esfingoide, el cual permitiría observar la distribución de especies tipo esfingosina (Sph), por visualización directa. Con objeto de analizar los microdominios de membrana que son temporalmente enriquecidos en ciertos lípidos, en la presente tesis doctoral se han diseñado diversos protocolos sintéticos para la obtención de sondas análogas a la Sph y a la ceramida (Cer). Las nuevas sondas obtenidas, pentaenino-Sph y palmitoil pentaeno-Cer, han sido marcadas, por primera vez, en la base esfingoide con una estructura de cinco dobles enlaces conjugados, confiriendo un sistema intrínsecamente fluorescente. Además, el diseño de los pentaeno-SLs permite la introducción en la cadena N-acilo de un agente radical atenuador interno (n-DOXYL), el cual latentizaría la fluorescencia con total control espaciotemporal. Por acción de una enzima específica, se liberaría el atenuador, recuperando la fluorescencia del sistema pentaénico, lo que permitiría la visualización directa de los SLs a concentraciones más cercanas a las fisiológicas. Asimismo, como prueba de concepto, se han sintetizado tres sondas derivadas del ácido γ- aminobutírico (GABA), como modelos simplificados de la palmitoil-Cer natural, los cuales contienen un sistema pentaénico con un atenuador radicalario en la misma molécula. Los ensayos biofísicos llevados a cabo en membranas modelo con estas sondas alternativas, nos han proporcionado información interesante de las propiedades biofísicas que presenta el sistema dual pentaeno-atenuador radicalario en un entorno lipídico.

Latexin es un gen de respuesta a ácido retinoico (RA) cuya función celular se conoce escasamente. Latexin se encuentra silenciada por un mecanismo de hipermetilación en numerosas líneas tumorales, sugiriendo que ésta podría estar ejerciendo una función como supresor tumoral. Con el objetivo de elucidar su potencial implicación en cáncer, empleamos líneas derivadas de neuroblastoma ya que representan modelos adecuados para estudiar tanto procesos de apoptosis como de diferenciación. En este estudio revelamos que la escasa expresión de latexin parece una característica común de las líneas de neuroblastoma y que dicha expresión puede ser modulada mediante el tratamiento con RA. La sobreexpresión estable de latexin no altera los procesos proliferación celular ni de muerte celular en la línea SH-SY5Y. Sin embargo, su sobreexpresión sí que tiene un efecto significativo promoviendo la aparición de células del tipo S (del linaje Schwanniano) cuando son tratadas con RA. Además, su expresión también facilita la emergencia del fenotipo S cuando las células se exponen al agente 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU). De hecho, la inhibición del axis PI3K/Akt impide la activación de senescencia Estas evidencias sugieren que latexin podría ser un determinante en la decisión del destino celular entre apoptosis y senescencia en células de neuroblastoma, probablemente modulando dicha cascada de señalización. Estos resultados nos alentaron a tratar de desvelar el panorama de expresión génico que promovueve latexin con el objetivo de identificar piezas claves en los efectos previamente mencionados que promueve latexin. Interesantemente, latexin promueve la expresión de un gran número de genes, principalmente involucrados en procesos de adhesión celular, desarrollo y morfogénesis. Curiosamente, la mayoría de genes promovidos por latexin, ya sea en presencia o ausencia de RA, pertenecen a la matriz extracelular (ECM), sugiriendo una potencial asociación entre la ECM y los efectos favorecidos por latexin en células SH-SY5Y. Cuando extendimos nuestros resultados a otros modelos celulares, observamos que latexin también fomenta el proceso de senescencia en respuesta al estímulo adecuado en la línea de neuroblastoma SK-N-LP y en la línea derivada de Glioblastoma Multiforme (GBM) LN-18. Sorprendentemente, una bajada en la expresión de latexin en las células U87-MG resulta en diferenciación tipo astrocitario cuando las células son tratadas con el agente genotóxico doxorubicina. Cabe remarcar que las células U87-MG con una expresión disminuida de latexin tienen perturbada la activación del proceso de senescencia. De una manera general, estos descubrimientos revelan una nueva función de latexin en la regulación de la especificación celular hacia la adquisición de un fenotipo senescente en diferentes modelos celulares. / Latexin is a recently discovered and poorly known retinoic acid (RA)-responsive gene whose cellular function is scarcely known. Latexin expression appears downregulated through promoter hypermethylation in several types of cancer, suggesting it can function as a tumor suppressor. With the aim to elucidate its potential role in cancer, we employed neuroblastoma-derived cells since they represent canonical and well-established models of apoptosis and differentiation. We first reveal that the lack of latexin expression appears as a common hallmark in neuroblastoma-derived cells although it can be modulated by RA treatment. The stable overexpression of latexin does not significantly alter cell proliferation or cell death responses in SH-SY5Y cells. However, the overexpression of latexin remarkably favors the emergence of S-type cells (Schwannian lineage) upon RA treatment. Consistently, latexin overexpression also facilitates the appearance of the S-type phenotype upon exposure to 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU). Moreover, latexin-overexpressing cells display enhanced Akt activation upon RA or BrdU stimuli, or even in basal growth conditions. This activation allows latexin-overexpressing cells to survive for long periods under unfavorable extracellular conditions and to undergo cellular senescence. Indeed, the inhibition of the PI3K/Akt axis impedes the activation of cellular senescence. These evidences suggest that latexin could be a critical determinant of cell fate choices between apoptosis or senescence in neuroblastoma cells likely by modulating this cascade. These results encouraged us to unveil the landscape of gene expression promoted by latexin to identify key targets involved in the aforementioned latexin-mediated effects. Interestingly, latexin upregulated a large number of genes, most of them involved in cell adhesion, cell development and morphogenesis processes. Surprisingly, the vast majority of genes upregulated by latexin either in the presence or in the absence of RA belong to the extracellular matrix (ECM), therefore suggesting the potential involvement of the ECM in latexin-promoted effects in SH-SY5Y cells. When extending our results to other cellular models, we observe that latexin also promotes cellular senescence upon the adequate stimuli in the neuroblastoma cell line SK-N-LP and in the Glioblastoma Multiforme (GBM)-derived cell line LN-18. Intriguingly, latexin knock down in U87-MG cells results in astrocytic-like differentiation upon treatment with the genotoxic drug doxorubicin. Remarkably, U87-MG cells with decreased levels of latexin expression remarkably impair the activation of cellular senescence. Altogether, these findings disclose a novel functional role of latexin in regulating cell specification towards the acquisition of a senescent phenotype in different cellular models.

L’Aneurisma Aòrtic Abdominal (AAA) és una malaltia vascular que afecta amb rellevància la població dels països industrialitzats. És una malaltia que té pocs símptomes i en cas de ruptura de l’artèria aorta té una taxa de mortalitat molt alta per dessagnació interna. Les principals característiques d’aquesta alteració vascular són la dilatació de les parets del vas aòrtic com a conseqüència de la degradació de les diferents capes del mur vascular i una hipervascularització de l’artèria. Aquests dos processos estan estretament relacionats amb el procés inflamatori que es desenvolupa a la paret de l’artèria. Hem investigat la via de la PGE2 en l’AAA i la seva relació amb la hipervascularització associada a aquesta malaltia. Hem analitzat mostres de pacients d’AAA sotmesos a intervenció quirúrgica i les hem comparat amb les mostres de donants multiorgànics. Els pacients havien estat estratificats en funció del diàmetre màxim de l’aorta: low diameter (LD) (>55mm), moderate diameter (MD) (55-69,9mm), i high diameter (HD) (≥70mm). L’AAA es caracteritza per una abundant microvasculatura en la capa mitjana i adventícia amb una infiltració perivascular de cèl·lules CD45 positives. Els nivells d’mRNA de la ciclooxigenasa (COX)-2 i de la isoforma microsomal de la prostaglandin E sintasa (mPGES-1) estan incrementats en les mostres d’AAA (4,4 i 1,4 vegades respectivament). Els dos enzims estan localitzats en les cèl·lules endotelials (EC), en les cèl·lules vasculars llises (VSMC) i en els leucòcits. Aquests enzims, així com els marcadors d’EC, tenen una expressió màxima en el grup LD de pacients d’AAA, mentre que l’expressió dels marcadors de leucòcits mostren un màxim en el grup MD de pacients d’AAA. Aquests resultats indiquen que la hipervascularització i la up-regulation de la COX-2/mPGES-1 precedeixen al màxim d’infiltració leucocitària. Els nivells de metabòlits de PGE2 circulants i secretats pel teixit d’aneurisma in vitro són més alts en les mostres d’AAA que no pas en les mostres control (plasma-controls, 19.9±2.2 pg/ml; plasma-AAA, 38,8±5,5 pg/ml; teixit aòrtic-control 16,5±6,4 pg/mg; teixit aòrtic-AAA, 72,9±6,4 pg/mg). Els receptors de la PGE2 EP2 i EP4 estan sobreexpressats en les mostres d’AAA, sent el receptor EP4 l’únic receptor substancialment expressat en les cèl·lules endotelials i colocalitzat amb l’mPGES-1 en la microvasculatura. A més, el receptor EP4 media l’angiogènesi in vitro activada per la PGE2. Amb aquest estudi aportem de novo dades de l’expressió de l’mPGES-1 en mostres d’AAA humanes. Tots els nostres resultats suggereixen que l’eix COX-2/mPGES-1/EP4 en la microvasculatura pot tenir una especial rellevància en la hipervascularització associada a l’AAA. / The Abdominal Aortic Aneurysm (AAA) is a vascular disease that affects with relevance to the population of industrialized countries. It is usually an asymptomatic disease and in case of rupture of the aorta it has a very high mortality rate by internal hemorrhage. The main features of this disorder are vascular dilation of the aortic vessel walls as a result of the degradation of the different layers of the vascular wall and arterial hypervascularization. These two processes are closely related to the inflammatory process that develops in the wall of the artery. We investigated the PGE2 pathway in the AAA and its relationship with hypervascularization associated with this disease. We analyzed samples of AAA patients undergoing surgery in comparison with samples from multi-organ donors. Patients were stratified according to the maximum diameter of the aorta: low diameter (LD) (> 55mm) moderate diameter (MD) (55-69,9mm) and high diameter (HD) (≥70mm). The AAA is characterized by abundant microvasculature in the middle layer and adventitia with perivascular infiltration of CD45 positive cells. mRNA levels of cyclooxygenase (COX)-2 and the microsomal isoform of prostaglandin E synthase (mPGES-1) are increased in samples of AAA (4.4 and 1.4 times respectively). The two enzymes are located in endothelial cells (EC), vascular smooth muscle cells (VSMC) and leukocytes. These enzymes and markers of EC have maximum expression in the LD group of AAA patients, whereas the expression of leukocyte markers show a maximum in the MD group of AAA patients. These results indicate that hypervascularization and up-regulation of COX-2 / mPGES-1 precedes the maximum leukocyte infiltration. The levels of circulating metabolites PGE2 secreted by in vitro aneurysm tissue are higher in samples AAA than in control samples (plasma-controls, 19.9 ± 2.2 pg / ml, plasma-AAA, 38 8 ± 5.5 pg / ml; aortic tissue-control 16.5 ± 6.4 pg / mg; aortic tissue-AAA, 72.9 ± 6.4 pg / mg). PGE2 receptors EP2 and EP4 were overexpressed in samples AAA, EP4 being the only receptor expressed substantially in EC and colocalizes with mPGES-1 in the microvasculature. In addition, the EP4 receptor mediates in vitro angiogenesis activated by PGE2. This study provides de novo data of the mPGES-1 expression in samples of human AAA and, taken together, our results suggest that the axis COX-2/mPGES-1/EP4 in the microvasculature could have a key role in AAA-associated hypervascularization.

Hepatic cirrhosis is a largely diffused pathology caused by alcohol abuse and hepatitis C in developed countries, whereas hepatitis B is the cause in most parts of Asia and sub-Saharan Africa. It's characterized by development of regenerative nodules delimited by fibrous septa. Regenerative nodules are composed by proliferating hepatocytes, entrapped by deposition of extracellular matrix, and have been shown to be involved in growth factor production, in particular VEGF, which is responsible of angiogenic induction that culminates with formation of a dense network of blood vessels into fibrous septa. The newly formed blood vessels of fibrous septa connect the vessels of the portal region with terminal hepatic veins, determining an alternative route of the blood flow that, in this way, is redirected into the systemic circulation bypassing the liver. At pre-hepatic level, the cirrhosisrelated portal hypertension induces development of new blood vessels that shunt the portal blood into the systemic circulation. As consequence of both intrahepatic and pre-hepatic angiogenesis, the liver cannot metabolize several blood components such as drugs, nutrients, toxins, and bacteria, with obvious deleterious effects. Despite angiogenesis is one of the main complications of liver cirrhosis and VEGF has a pivotal role in the control of blood vessels formation, the molecular mechanisms that govern VEGF expression during angiogenesis and hepatic cirrhosis are poorly understood. In order to address whether CPEB family of proteins may have a function in the regulation of angiogenesis in liver diseases, we analysed the expression of CPEBl and CPEB4 in liver of patients affected by hepatic cirrhosis. The expression of CPEBl and CPEB4 was increased in regenerative nodules, compared with basal levels of expression detected in healthy hepatic parenchyma. Interestingly, also VEGF expression was higher in regenerative nodules. The numerous fibrous septa that characterized cirrhotic livers resulted highly vascularized, and the endothelium of newly formed blood vessels expressed high levels of CPEB1, CPEB4 and VEGF. The description of CPEB1, CPEB4 and VEGF expression in healthy and cirrhotic conditions represented a first cue of CPEB-mediated translational regulation of VEGF mRNA during angiogenesis. To prove the accuracy of this hypothesis we implemented two animal models that allowed the study of intrahepatic and prehepatic angiogenesis correlated with liver cirrhosis. CBDL experiments performed in rats enabled to recapitulate the histopathological conditions observed in human hepatic cirrhosis. Cirrhotic rat livers showed deep histological perturbations, with high proliferation of blood vessels and biliary ducts. Compared with control healthy samples, the expression of CPEB1, CPEB4 and VEGF in pathological liver was strongly increased. These proteins localized at level of both, blood vessels and biliary ducts. Partial portal vein ligation (PPVL) experiments performed in rats enabled to show an important correlation between CPEBl and CPEB4 expression with VEGF synthesis and consequent high vascularization of mesentery. In angiogenic condition, both pre-existing and newly formed blood vessels expressed CPEB1, CPEB4 and VEGF at level of endothelium, smooth muscle and adventitia, tissues that playa pivotal role in the development of the vascular net. To better define the mechanistic relevance of these correlations, we characterized the endothelial cell line HSV. In this in vitro model we modulated the levels of CPEBl and CPEB4, and showed a direct involvement of this two proteins in the translational regulation of VEGF mRNA. Taking advance of the ability of HSV cells to form blood vessel like structure in an in vitro angiogenesis assay, we were able to show that CPEBl and CPEB4 are required for VEGF synthesis and secretion, which in turn are essential to create the correct microenvironment necessary to activate the cells and induce the formation of a dense network of vascular structures on Matrigel. Our results suggest that CPEBl drives the nuclear cleavage of VEGF 3'UTR while CPEB4 is responsible of its cytoplasmic polyadenylation. / "Regulación de la angiogénesis a través del control traduccional mediato par las proteínas CPEB " En muchas enfermedades hepáticas cr6nicas, la angiogénesis es una importante característica patológica y juega un papel crucial en la progresión de la fibrogénesis hepática a cirrosis, y en la aparición y agravamiento de la hipertensión portal, la cual determina las principales complicaciones de la enfermedad. A pesar de que es evidente que VEGF es el principal efector de la angiogénesis patológica, los mecanismos moleculares que gobiernan la activación post-transcripcional de su síntesis durante la cirrosis hepática son en gran parte desconocidos. En este trabajo se muestra que la síntesis de VEGF está regulada a través de funciones secuenciales y no redundantes de dos miembros de la familia de las proteínas CPEB:. CPEB1 y CPEB4. Por 10 tanto, CPEB1 promueve el procesamiento alternativo de ambos los pre-ARNm de CPEB4 y VEGF, acortando las 3'UTRs y excluyendo elementos de inhibición de la traducción de los transcritos maduros. Como resultado de este procesamiento alternativo, CPEB4 se sobreexpresa, y polyadenyla el ARNm de VEGF, aumentando aún más su traducción. Entonces, se requieren tanto CPEB1 como CPEB4 para la síntesis de VEGF y la consecuente angiogénesis. Por tanto, todas las proteínas se sobreexpresan de forma secuencial en pacientes y en modelos animales de cirrosis hepática e hipertensión portal, y ambos ratones knock-out para CPEB1 y CPEB4 no lograron activar la angiogénesis tras la inducción de hipertensión portal. A través del análisis de la angiogénesis en ensayos in vitro, las muestras de humanos y modelos animales, nuestros resultados ponen de relieve el papel crucial de CPEBs en la neovascularización patol6gica, en el marco de la hipertensión portal y cirrosis, e identifican CPEBs como potenciales nuevas dianas moleculares para el tratamiento de la enfermedad hepática cr6nica y otras enfermedades dependientes de la neovascularización, como el cáncer.

Les mitocòndries generen la major part de l’energia necessària per a la funció cel·lular mitjançant la respiració i la fosforilació oxidativa. Quan els mioblasts diferencien a miotubs, la biogènesi mitocondrial i l’activitat enzimàtica mitocondrial augmenta. A més, la regeneració muscular també està acompanyada d’un augment en l’activitat enzimàtica mitocondrial. I la dinàmica mitocondrial és essencial per mantenir les funcions bioenergètiques mitocondrials. Opa1 i la Mitofusina 1 (Mfn1) són dues proteïnes de fusió mitocondrial involucrades en la dinàmica mitocondrial. Els meus resultats mostren que la pèrdua de funció de Opa1 i Mfn1 redueix dràsticament la diferenciació miogènica en les cèl·lules C2C12. Per una banda, s'observa una gran disminució en l'expressió dels marcadors finals de la diferenciació com la Caveolina 3 o la cadena pesada de miosina (MHC). A més, hi ha una disminució prou marcada en l'expressió de la Miogenina, causada per una disminució en l'activitat de MyoD. En canvi, la pèrdua de funció de mitofusina 2 (Mfn2), una altra proteïna de fusió mitocondrial, no mostra aquests canvis durant el procés de diferenciació. La respiració mitocondrial es veu fortament afectada per deficiència en Opa1 o en Mfn1, de manera que es detecta, un major “leak”, una menor capacitat respiratòria màxima, i una augmentada producció mitocondrial de peròxid d'hidrogen. L'observació que els defectes en la miogènesi estan parcialment normalitzats mitjançant l’ús d’antioxidants en les cèl·lules amb silenciament de Opa1 o Mfn1, indica que la disfunció mitocondrial pot ser important en algunes de les alteracions detectades durant la miogènesi. A més, la deficiència de Opa1 o Mfn1 en múscul esquelètic, provoca un alentiment en la regeneració muscular de ratolins i la repressió total de Opa1 en el múscul esquelètic de ratolí condueix a una miopatia, una reducció en el creixement del múscul i una disminuïda longevitat. En resum, les nostres dades indiquen que Opa1 i Mfn1 regulen miogènesi i que la pèrdua de funció de Opa1 o Mfn1 provoca estrès oxidatiu, que podria ser clau reduint la diferenciació muscular. En resum, he demostrat que Opa1 i Mfn1 regulen la diferenciació de les cèl·lules musculars en cultiu i la regeneració muscular en ratolins. Així mateix, aquestes proteïnes podrien participar en la formació normal del múscul esquelètic. / Mitochondria generate most of the energy necessary for cellular function via respiration and oxidative phosphorylation (OXPHOS). When myoblasts differentiate into myotubes, mitochondrial biogenesis is increased. Likewise, muscle regeneration is also accompanied by an increased mitochondrial biogenesis. Mitochondrial dynamics is essential for the maintenance of mitochondrial bioenergetic functions. Optic atrophy 1 (Opa1) and Mitofusin 1 (Mfn1) are two mitochondrial fusion proteins involved in mitochondrial dynamics. Here I show that Opa1 and Mfn1 loss of function impairs myogenic differentiation in C2C12 cells. On the one hand, we detect a reduced expression of late differentiation markers as Caveolin 3 or MHC. In addition, a reduced expression of Myogenin and reduced activity of MyoD is documented. In contrast, Mitofusin 2 (Mfn2) loss of function, another mitochondrial fusion protein, does not show these changes during the differentiation process. We find that mitochondrial respiration is heavily impaired, showing a higher leak, a lower ETS capacity, and increased mitochondrial hydrogen peroxide levels in living Opa1 and Mfn1 knocked-down C2C12 myoblasts. The observation that defects in myogenic differentiation are partly normalized by antioxidants in Opa1 or Mfn1 silenced cells indicates that mitochondrial dysfunction may be relevant in some of the alterations we detected during myogenesis. In addition, upon Opa1 or Mfn1 silencing, muscle regeneration is disrupted in adult mice and Opa1 depletion in skeletal muscle leads to a myopatic condition, reduced growth and reduced lifespan. In summary, our data indicate that Opa1 and Mfn1 regulate myogenesis and that Opa1 or Mfn1 loss-of-function causes oxidative stress, which may be key for dysregulation of muscle differentiation. As conclusion, we propose Opa1 and Mfn1 as potential regulators of muscle cell differentiation, muscle regeneration and muscle formation.

La diabetis tipus 2 és la malaltia metabòlica més freqüent a tot el món. Malgrat que els tractaments farmacològics són útils en les primeres etapes de la malaltia, no han sigut capaços prevenir la pèrdua de control de la glucèmia a llarg termini. A més, aquests tractaments presenten efectes secundaris indesitjables. Per tant, el desenvolupament de nous tractaments per a la diabetis tipus 2 és avui en dia un gran repte per a la investigació científica. El desenvolupament de la teràpia gènica ha proporcionat una nova eina per al tractament de malalties humanes. No obstant això, no s'han desenvolupat fins ara tractaments de teràpia gènica per a la diabetis tipus 2. Un 90% de la diabetis tipus 2 és conseqüència d'un excés de pes. L'acumulació de triglicèrids en els teixits perifèrics està vinculada a l'aparició de resistència a la insulina i la reducció de la captació de glucosa, conduint a un disfunció de la cèl·lula β i a la diabetis tipus 2. Per tant, promoure la captació de glucosa o l'oxidació d'àcids grassos podria prevenir el desenvolupament de la diabetis tipus 2. El múscul esquelètic juga un paper clau en l'homeòstasi de la glucosa i posseeix una gran capacitat d'utilitzar els àcids grassos per a la producció d'energia. És també un teixit ideal per a la transferència de gens, ja que és fàcilment accessible i permet ser transduït per una diversitat de vectors de teràpia gènica. En aquest estudi, per trobar una nova aproximació de teràpia gènica per a la diabetis tipus 2, vam transferir diversos gens amb la capacitat d'augmentar la captació de glucosa o la capacitat oxidativa del múscul esquelètic en un model de diabetis induïda per la dieta, mitjançant l'ús de vectors AAV. Els vectors AAV són segurs i permeten una expressió a llarg termini del transgen en el múscul esquelètic. En estudis previs hem demostrat en ratolins transgènics que l'augment de la fosforilació de la glucosa per la sobreexpressió muscular del Glucoquinasa (GCK) prevé l’obesitat induïda per dieta alta en lípids i la resistència a la insulina. En una primera aproximació, la sobreexpressió de GCK en els músculs esquelètics de ratolins adults alimentats en dieta alta en lípids, ha permès una reducció del 10% en el guany de pes corporal, juntament amb normoinsulinemia i una prevenció de la resistència a la insulina. El PGC1 α és un regulador de la biogènesi mitocondrial i de la funció oxidativa en el múscul esquelètic. La seva expressió muscular està disminuïda en pacients diabètics tipus 2, el que suggereix la seva implicació en la patogènesis de la resistència a la insulina en aquest teixit. A més, la seva expressió incrementa la captació de glucosa en les cèl·lules del múscul esquelètic. Així, en la segona part d'aquest estudi, es sobreexpressa el PGC1α en els músculs esquelètics de ratolins adults alimentats en dieta alta en lípids, sol o en combinació amb GCK. La sobreexpressió de PGC1α ha conduït a una reducció del 10% del pes corporal. No obstant això, no ha evitat el desenvolupament de la resistència a la insulina. La co-sobreexpressió de PGC1α i GCK no ha previngut l'obesitat ni el desenvolupament de resistència a la insulina, abolint així els efectes beneficiosos observats amb la sobreexpressió de la GCK sola. En el múscul esquelètic, PPARδ és un factor de transcripció induïble per lligand, que promou l'oxidació d'àcids grassos. Després de la unió del lligand, PPARδ recluta coactivadors que permeten la transcripció dels seus gens diana. PGC1α és un d'aquests coactivadors. Així, en la tercera part d'aquest estudi, es sobreexpressa PPARδ sol o en combinació amb PGC1α en els músculs esquelètics de ratolins adults alimentats en dieta alta en lípids. La sobreexpressió de PPARδ no ha evitat el desenvolupament de l'obesitat o la resistència a la insulina. Per contra, la co-expressió de PPARδ i PGC1α ha comportat una reducció del 10% en el guany de pes corporal i una prevenció del desenvolupament de resistència a la insulina. A més, els músculs que sobreexpressen els dos gens presenten una major sensibilitat a la insulina i una reducció en l'acumulació d'àcids grassos. Per tant, la sobreexpressió muscular GCK o la co-sobreexpressió de PPARδ i PGC1α, podrien representar noves aproximacions potencials de teràpia gènica pel tractament de la diabetis tipus 2. / Type 2 diabetes is the most common metabolic disease worldwide. Despite drug treatments are useful in the first stages of the disease, none of them have proven to prevent the glycaemic control loss in a long-term basis. Furthermore, all treatments present undesirable secondary effects. Thus, the development of new treatments for type 2 diabetes is nowadays an important cornerstone in scientific research. The development of Gene Therapy has provided a new tool to treat human diseases. However, successful gene therapy approaches for the treatment of type 2 diabetes have not been developed to date. About 90% of type 2 diabetes is attributable to excessive body weight. The accumulation of triglycerides in peripheral tissues is linked to the appearance of insulin resistance and reduced glucose uptake. This leads to β-cell failure and to type 2 diabetes. Thus, promoting glucose uptake or fatty acid oxidation may prevent the development of type 2 diabetes. The skeletal muscle plays a key role in glucose homeostasis and possesses a big capacity to use fatty acids for energy production. It is also an ideal tissue for gene transfer since it is easily accessible and can be transduced by a diversity of gene therapy vectors. In this study, to find a new gene therapy approach for type 2 diabetes, we transferred several genes with the ability to increase glucose uptake or bust the oxidative capacity of the skeletal muscle in a model of diet-induced diabetes by using AAV vectors. These vectors are safe and allow a long-term expression of the transgene in the skeletal muscle. We previously demonstrated in transgenic mice that increasing glucose phosphorylation by the muscular overexpression of Glucokinasse (Gck) prevents high fat diet-induced obesity and insulin resistance. Here, as a first approach, we overexpressed Gck in the skeletal muscles of high fat diet-fed adult mice, leading to a 10% reduction in body weight gain along with normoinsulinemia and a prevention of high fat diet-induced insulin resistance. PGC1α is a master regulator of mitochondrial biogenesis and the oxidative function in the skeletal muscle. The muscular expression of this gene is reduced in type 2 diabetic patients, suggesting its involvement in the pathogenesis of insulin resistance in this tissue. Additionally, the expression of PGC1α increased glucose uptake in skeletal muscle cells. Thus, in the second part of this study, we overexpressed Pgc1α in the skeletal muscles of high fat diet-fed adult mice alone or in combination with Gck. The overexpression of Pgc1α led to a 10% reduction of the body weight gained during the diet. However, it didn’t prevent the development of insulin resistance. The co-overexpression of Pgc1α and Gck didn’t prevent obesity or the development of insulin resistance, thus abolishing the beneficial effects observed when Gck was overexpressed alone. In the skeletal muscle, PPARδ is a ligand-inducible transcription factor that promotes fatty acid oxidation. Upon ligand binding, PPARδ recruits coactivators which allow the transcription of its target genes. PGC1α is one of these coactivators. Thus, in the third part of this study, we overexpressed Pparδ alone or in combination with Pgc1α in the skeletal muscles of high fat diet-fed adult mice. The overexpression of Pparδ during the diet didn’t prevent the development of obesity or insulin resistance. In contrast, the co-overexpression of Pparδ and Pgc1α led to a 10% reduction in body weight gain along and with a prevention of the development of insulin resistance. Furthermore, muscles overexpressing both genes presented increased insulin sensitivity and reduced accumulation of fatty acids. Therefore, the muscular overexpression of Gck or the co-overexpression of Pparδ and Pgc1α, might represent potential new gene transfer approaches to treat type 2 diabetes.

El carcinoma Escamoso de Cabeza y Cuello (CECC) es el sexto cáncer con mayor incidencia en países desarrollados. Dos terceras partes de los pacientes con Carcinoma Escamoso de Cabeza y Cuello (CECC) se diagnostican en estadios avanzados y no siempre responden al tratamiento habitual de quimioterapia combinada con cirugía o radioterapia. El objetivo principal de este proyecto de tesis es desarrollar marcadores pronóstico y predictivos en pacientes con CECC localmente avanzado tratados con quimioradioterapia (QRT) concomitante o quimioterapia de inducción seguida de QRT/radioterapia o cirugía. Con este objetivo, hemos analizado por PCR cuantitativa o inmunohistoquímica, el nivel de expresión de una serie de genes candidatos, identificados en un estudio previo de microrrays, y la asociación de estos con la recidiva tumoral y la supervivencia de los pacientes. Estos análisis se realizaron en biopsias tumorales pre-tratamiento de cuatro cohortes de pacientes con CECC localmente avanzado. Los resultados muestran que el nivel de expresión de SERPINA-1 y RAB25 se asocia con la recidiva local, supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia global de los pacientes. Además, mediante un estudio de microarrays, hemos identificado una firma de 16 genes cuya expresion se asocia con el pronóstico de los pacientes. Posteriormente la firma genética ha sido validada utilizando los datos obtenidos en dos estudios independientes previamente publicados. Por último, una vez caracterizado un panel de líneas celulares, hemos analizado funcionalmente el efecto de la manipulación de genes con capacidad pronóstica en células de CECC. En este sentido, la sobreexpresión exógena de Rab25 aumenta la proliferación, disminuye la capacidad de migración e invasión y potencia la citotoxicidad inducida por cisplatino en líneas de CECC. Los resultados confirman que el nivel de expresión de Rab25 es un factor de buen pronóstico en pacientes con CECC localmente avanzado. Aquellos pacientes cuyos tumores tienen una expresión elevada de Rab25 presentan un pronóstico más favorable que los pacientes con tumores que expresan niveles bajos. En cambio, el nivel de expresión de SERPINA-1 es un factor de mal pronóstico, aumenta el riesgo de sufrir recidivas tumorales y disminuye la supervivencia de los pacientes. La determinación de ambos marcadores podría ayudar, en un futuro, a identificar antes de iniciar el tratamiento, aquellos pacientes que presentan una mayor probabilidad de responder al tratamiento genotóxico y distinguirlos de los pacientes que no se benefician del tratamiento actual. La firma genética desarrollada podría predecir de una manera más precisa la supervivencia de los pacientes a partir de la determinación del nivel de expresión de un número mínimo de genes. / Head and Neck Carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer in develop worldwide. Two thirds of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) patients are diagnosed at an advanced stage and they do not always respond to the standard treatment protocols based on radiotherapy and/or chemotherapy. The main objective of this project is to develop prognostic and predictive markers of response to treatment in patients with locally advanced HNSCC treated with concomitant chemoradiotherapy (CRT) or induction chemotherapy followed by CRT/radiotherapy or surgery. Based in this objective, we have analyzed by quantitative PCR or immunohistochemistry, the expression level of a gene subset, identified in a previous microarray study, and their association with tumor recurrence and patient survival. These analyses were done in pre-treatment tumor biopsies of four cohorts of locally advanced HNSCC patients. Results showed that RAB25 and SERPINE-1 expression is associated with local recurrence, progression free survival and overall survival of patients. Even more, we identified a 16 gene signature associated with clinical outcome of patients. This gene signature has been validated in two independent microarray studies, previously published. Finally, we characterized a set of cell lines and we analyzed the effect of the manipulation of prognostic genes in HNSCC cell lines. We observed that the exogenous Rab25 overexpression increases cell proliferation, reduces migration and invasion, and promotes cisplatin cytotoxicity in CECC cell lines. These results confirm that RAB25 expression is a good prognostic marker in locally advanced HNSCC patients. Those patients with tumors bearing high expression levels of RAB25 have better prognostic than those patients with low expressing RAB25 tumors. In contrast, the expression level of SERPINE-1 is a bad prognostic marker, because increases the risk of tumor recurrence and diminish patient survival. The determination of both markers could be useful, in the future, to identify before treatment, those patients who have a higher probability to respond to genotoxic treatment and distinguish them from patients who won’t obtain benefit from current treatment. The developed genetic signature could predict with high accuracy patient survival, determining gene expression of minimum number of genes included in our genetic signatures.

Les quinases dependents de ciclina (CDKs) dirigeixen la progressió del cicle cel·lular a les cèl·lules eucariotes. A l’organisme eucariota model Saccharomyces cerevisiae (llevat de gemmació) una sola quinasa dependent de ciclina, Cdk1, és essencial i suficient per dirigir el cicle cel·lular. Unida alternativament a ciclines de fase G1, S i G2/M, Cdk1 regula els programes transcripcionals del cicle cel·lular, la replicació i segregació dels cromosomes, la dinàmica del fus mitòtic, el creixement cel·lular polar, la morfogènesi, etc. La desregulació de l’activitat CDK promou la proliferació descontrolada i la inestabilitat genòmica. Donada la seva funció essencial en la progressió del cicle cel·lular, Cdk1 és estretament regulada per proteïnes associades (les ciclines, Cks1, i inhibidors de les CDKs –CKIs) i per modificacions post-traduccionals. Tanmateix, molts detalls de la regulació de Cdk1 romanen desconeguts, com és el cas de com les activitats CDK de fase G1 o de fase M són inhibides en resposta a determinats estressos cel·lulars. Quan la progressió del cicle cel·lular és amenaçada per la presència d’estressos genotòxics tals com l’estrès replicatiu o la presència de dany al DNA, un mecanisme de vigilància, l’anomenat checkpoint de la fase S, s’activa per tal de protegir la integritat del genoma. Al llevat de gemmació, el checkpoint de la fase S és mediat per la quinasa Mec1 (ATR/ATM a humans) i la seva quinasa efectora Rad53 (Chk2 a humans). Per explorar si la quinasa efectora Rad53 regula Cdk1 en resposta a estrès genotòxic, hem explorat dues qüestions principals: (1) la fosforilació de Cdk1 per Rad53 i (2) la regulació per Rad53 de proteïnes associades a Cdk1. Pel que fa a la primera qüestió, aprofitant un assaig quinasa in vitro amb Rad53, mostrem que Cdk1 és fosforilat directament per Rad53. Hem identificat proteòmicament dos llocs de Cdk1 (Ser46, Ser258) fosforilats per Rad53 in vitro. Les cèl·lules dirigides per l’al·lel no-fosforilable (Cdk1-2A) mostren un fenotip wee, compatible amb una activitat CDK incrementada/desregulada. Les cèl·lules dirigides per l’al·lel fosfomimètic (Cdk1-2E) són allargades i més grans que les cèl·lules silvestres, compatible amb una activitat CDK reduïda. A més, assignem i quantifiquem les diferents formes fosforilades de Cdk1 in vivo mitjançant electroforesi Phos-tag. Respecte la segona qüestió, hem identificat proteòmicament proteïnes associades a Cdk1 en presència d’estrès replicatiu en forma dependent de Rad53. Hem estudiat en detall el producte del gen de funció desconeguda YPL014W, que bategem Cip1 (per Cdk1 Interacting Protein 1), que obté la puntuació més alta en l’anàlisi. Les nostres dades mostren que Cip1 és una proteïna regulada al llarg del cicle cel·lular. A més, l’abundància de Cip1 s’incrementa en forma dependent de Rad53 en presència d’estrès replicatiu. La sobre-expressió de Cip1 bloqueja les cèl·lules a fase G1 i estabilitza el CKI de fase S Sic1 in vivo. A més, Cip1 interacciona específicament amb el complex de fase G1 Cln2-Cdk1, però no amb el complex de fase S Clb5-Cdk1 or el de fase M Clb2-Cdk1. Cip1 inhibeix l’activitat Cln2-CDK tant in vivo com in vitro. Els nostres resultats suggereixen que Cip1 pot ser un nou CKI de l’activitat CDK de fase G1. / Cyclin dependent kinases are drive cell division cycle progression in eukaryotic cells. In the model eukaryotic organism Saccharomyces cerevisiae (budding yeast) a single Cyclin Dependent Kinase, Cdk1, is essential and sufficient to drive the cell cycle. Alternately bound to G1, S and G2/M phase cyclins, Cdk1 regulates cell cycle transcriptional programs, chromosome replication and segregation, spindle dynamics, polarized cell growth, morphogenesis, etc. Misregulated CDK activity induces unscheduled proliferation as well as genomic instability. Given its essential function in cell cycle progression, Cdk1 is tightly regulated by binding partners (cyclins, Cks1 and Cyclin dependent Kinase Inhibitors -CKIs) and post-translational modifications. However, many details on Cdk1 regulation remain unknown, such as how G1 or mitotic CDK activities are inhibited in response to challenging conditions. When the cell cycle progression is challenged by genotoxic stress such as DNA replication stress or DNA damage, a surveillance mechanism, the S phase checkpoint is activated to protect the integrity of the genome. In the budding yeast the S phase checkpoint is mediated by the Mec1 kinase (ATR/ATM in humans) and its downstream effector kinase Rad53 (Chk2 in humans). To explore whether the effector kinase Rad53 regulates Cdk1 in response to genotoxic stress, we have been exploring two main avenues: (1) Cdk1 phosphorylation by the S phase checkpoint effector kinase Rad53 and (2) Rad53 dependent regulation of Cdk1 associated factors. With respect to the first question, taking advantage of a Rad53 in vitro kinase assay, we show that recombinant Cdk1 is directly phosphorylated by Rad53. We also proteomically identified two sites of Cdk1 (Ser46, Ser258) phosphorylated by Rad53 in vitro. Cells carrying the non-phosphorylatable Cdk1 allele (Cdk1-2A) display a wee phenotype, compatible with increased/unrestrained CDK activity. Cells carrying the phosphomimetic Cdk1 allele (Cdk1-2E) are elongated and larger in size than wild type cells. Moreover, we also assign and quantify the different phosphorylation forms of Cdk1 in vivo using Phos-tag electrophoresis technology. With respect to the second question, we have proteomically identified proteins associated with Cdk1 in the presence of replication stress in a Rad53 dependent manner. The product of the unknown function gene YPL014W, which we name Cip1 (for Cdk1 Interacting Protein 1), with the highest score, is further studied. Our data shows that Cip1 is a cell cycle regulated protein. In addition, the abundance of Cip1 increases in a Rad53 dependent manner upon DNA replication stress. Overexpression of Cip1 blocks cells in G1 and stabilizes the S-phase-Cdk1 inhibitor Sic1 in vivo. Moreover, Cip1 specifically interacts with G1 phase Cln2-Cdk1 but not with S phase Clb5-Cdk1 or M phase Clb2-Cdk1. Cip1 inhibits Cln2-CDK activity both in vivo and in vitro. Our finding suggests that Cip1 may be a novel CKI of G1 phase CDK activity.