Progression through the cell cycle is directed by cyclin dependent kinases (CDKs), which are essential for normal and cancer cell proliferation. CDKs are activated by association with cyclins specific to each cell cycle phase (G1, S, G2, and M). Thus, CDK associated with G1 phase cyclins promote the expression of proteins necessary for DNA replication, but is unable to activate it. CDK associated with S phase cyclins, in turn, triggers the activation of chromosomal origins of replication, but is unable to promote chromosome condensation and segregation of sister chromatids, which is carried out by CDK associated with mitotic cyclins. Despite the essential role of CDKs in cell cycle progression, how the different cyclins promote specifically the various processes of the cell cycle was still an open question by the time this thesis was initiated. Since the discovery of cyclins by Nobel laureate Tim Hunt [Evans et al. (1983) Cell 33:389] it was assumed that cyclins confer substrate specificity. However, later on, fellow Nobel laureate Paul Nurse proposed an alternative quantitative model, [Stern & Nurse (1996) Trends Genet 12:345], based on the observation that successive waves of cyclins result in increased levels of CDK activity. While low levels of activity (CDK associated with G1 cyclins) are sufficient promote progression through the G1 phase and start the pro-S phase transcription program, would be unable to trigger replication. Moderate levels of activity (CDK associated with S phase cyclins) would be able to activate replication but not mitosic events, which would require the high CDK activity associated with M phase cyclins. If correct, the quantitative model should fulfill two predictions, but only one was demonstrated by the Nurse lab. Eukaryotic unicellular yeast cells are able to survive with a single mitotic cyclin, which is notwithstanding able to orderly drive the cell through the different cell cycle phases [Fisher & Nurse (1996) EMBO J 15:850]. Therefore M-CDK activity is able to promote the previous phases of the cycle in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe However, if a purely quantitative mechanism applies, the complementary prediction should be true as well: an early cyclin to be able to trigger later events if expressed at levels high enough. To test such prediction we generated a budding yeast Saccharomyces cerevisiae strain carrying a G1 cyclin G1 resistant to degradation, under a strong inducible promoter, and fused to a nuclear localization signal. Our results show that one such cyclin is capable of firing chromosome replication conditions in which the S phase cyclins, G2 and M are suppressed. Therefore, our results support the quantitative model against the requirement of substrate specificity. How eukaryotic cells prevent premature activation of the critical cell cycle processes that lead to genomic instability, seems therefore trust in the regulation of activity levels and limiting the presence of cyclin at specific time and space.

La polineuropatia diabètica (PND) és una de les complicacions secundàries més freqüents de la diabetis mellitus. Provoca un empobriment de la qualitat de vida dels malalts, causa dolor i úlceres i, en última instància, amputació de l’extremitat afectada. La patogènia és multifactorial, hi ha alteracions estructurals en els nervis perifèrics i els tractaments actuals són simptomàtics, no específics i poc efectius. El ratolí transgènic RIP/INFβ és un model de diabetis, que mimetitza la diabetis autoimmune humana, provocant la destrucció de les cèl·lules β pancreàtiques, que s’intensifica amb l’administració de dosis baixes repetides d’estreptozotocina (STZ). Partint de la base de que els processos biològics implicats en la degeneració i regeneració dels nervis perifèrics estan controlats pels ganglis de les arrels dorsals (GAD), l’objectiu d’aquesta tesi ha estat analitzar l’expressió gènica i els processos biològics que esdevenen en els GAD del nervi ciàtic després d’un traumatisme, en el ratolí transgènic RIP/INFβ tractat amb dosis baixes i repetides de STZ (Tg-STZ). S’ha treballat amb els GAD del nervi ciàtic de ratolins, en diferents condicions experimentals: controls ICR (ICR) atès que els ratolins transgènics presenten aquest fons genètic; ICR tractats amb STZ (ICR-STZ); transgènics RIP/INFβ (Tg); i Tg tractats amb STZ (Tg-STZ). Quatre setmanes després de considerar-ne instaurada la diabetis en els Tg-STZ, tots els animals van ser sotmesos a una lesió per aixafament en el nervi ciàtic de l’extremitat esquerra, mantenint la dreta intacta. Quatre setmanes desprès de la lesió es van prendre mostres dels GAD del nervi ciàtic d’ambdues extremitat. Es va extreure el RNA dels GAD per realitzar els estudis de microarrays (Affymetrix GeneChip® Mouse Genome 430 2.0 Array). Per validar els valors de l’expressió gènica es va realitzar una PCR quantitativa en temps real (RT-qPCR). Es van realitzar comparacions dels perfils gènics entre les diferents condicions experimentals: 1) ICR-STZ lesionades vs ICR lesionades; 2) ICR lesionades vs ICR no lesionades; 3) Tg-STZ no lesionades vs ICR no lesionades; i 4) Tg-STZ lesionades vs ICR lesionades. Les mostres de referència van ser els GAD de l’extremitat no lesionada dels ratolins ICR (baseline) amb un fold change (FC) de 1. Un cop obtinguts els perfils de les comparatives es van analitzar els gens sobrerregulats i infrarregulats, i els processos biològics implicats, amb diferents bases de dades (Database for Annotation, Visulaization and Integrated Discovery; Center for Quantitaive Biology; Gene Home). L’absència de diferències en l’expressió gènica entre els GAD de les extremitats lesionades dels animals ICR-STZ vs ICR, indica que, en aquests òrgans, la STZ no té un efecte neurotòxic. En animals control ICR a les 4 setmanes després d’una lesió en el nervi ciàtic, encara es sobrexpressen gens relacionats amb la regeneració nerviosa, que participen en les vies de senyalització (Gpr151, Nts), transmissió sinàptica (Npy), projeccions neuronals i guia de l’axó (Sox11, Atf3, Tnc, Sema6a, Sprr1a, Gal), el que indicaria que la lesió encara no està totalment resolta. En animals transgènics (Tg-STZ) diabètics, la infrarregulació de gens relacionats amb vies metabòliques (Vgf) i la sobrerregulació de gens implicats en el metabolisme de hidrats de carboni (Car3) i lípids (Gdpd3), indicaria que a les 8 setmanes d’iniciar el procés diabètic els GAD estarien afectats per la hiperglucèmia. En animals transgènics (Tg-STZ) diabètics, 8 setmanes després de començar la hiperglucèmia, la infrarregulació de gens implicats en desenvolupament del sistema nerviós (Gal, Bdnf, Erg3), regeneració axonal (Sprr1a, Lingo1), transmissió sinàptica (Calb1, Snapin), transducció de senyals (Nts, Rgs2), canals de potassi (Kcns1, Kcnq5, Knj13, Kcna6, Kcnt1) i apoptosi (Tfnaip, Ctsb, E2f1, Crh), indicaria l’existència de canvis degeneratius en els GAD deguts a la neuropatia diabètica. En animals transgènics (Tg-STZ) diabètics, 4 setmanes després d’una lesió per aixafament del nervi ciàtic, la sobreexpressió de gens relacionats amb guia de l’axó (Foxd1), regeneració axonal (Sprr1a), projeccions neuronals (Mapk8), supervivència de les neurones dels GAD i elongació de les neurites (Gal, Sox11), o de vies de senyalització nerviosa (Npy1r, Igf1, Rgs18, Gpr151), transmissió sinàptica (Gabrb3, Neto1, CcKbr) i apoptosi (Crh), assenyalaria que en els GAD hi ha processos de regeneració posttraumàtica. En animals transgènics (Tg-STZ) diabètics, 4 setmanes després d’una lesió per aixafament del nervi ciàtic, la infraexpressió de gens relacionats amb l’axogènesi (Nptx1, Cxcr4), transmissió sinàptica neuromuscular (Egr3) i transport de substàncies (Htr3a, Tnpo, Mlc1, Slc15a2, Slc6a4), mostraria un alentiment de la regeneració nerviosa. En animals control ICR a les 4 setmanes després d’una lesió en el nervi ciàtic, la sobreregulació de gens implicats en reorganització o remodelació de la matriu extracel·lular (MEC) i del microambient local a la part lesionada (Mmp16, Col18a1, Col3a1, Col5a2, Loxl2) i d’adhesió cel·lular (Lmo7, Flrt3), i transport de substàncies (Cacna2d1, Slc15a3, Slc15a9, Slc6a4) i apoptosi (Phb, Comp), indicaria que hi ha regeneració i remodelació a la part lesionada. En animals transgènics (Tg-STZ) diabètics, els processos de reorganització i remodelació de la MEC quasi no estan sobrerregulats, excepte Mmp16 i Tgfbi amb un FC>2, el que confirmaria que la regeneració estaria retardada, i encara no s’haurien iniciat els fenòmens de remodelació local. En animals control ICR a les 4 setmanes després d’una lesió en el nervi ciàtic, hi ha sobrexpressió de gens relacionats amb el dolor neuropàtic (Npy, Npy2r, Gal) i en animals transgènics (Tg-STZ) no hi ha expressió de Npy, i el gen Gal està infrarregulat. Això podria estar relacionat amb la pèrdua de la sensibilitat al dolor que s’observa en els pacients amb PND. El coneixement dels gens i els processos biològics involucrats en la degeneració i regeneració nerviosa en ratolins sans ICR i en ratolins transgènics Tg-STZ diabètics, obre noves vies de recerca per aprofundir en el coneixement de la patogènia de la PND i per l’estudi de molècules diana en el tractament de la PND i del dolor neuropàtic. / Diabetic neuropathy (PND) is the most frequent secondary complication of diabetes mellitus (DM). The most important contributors to reduction in the quality of life of patients with DM are neurological pain and foot ulcerations and, ultimately, non-traumatic amputation of the affected limb. The pathogenesis is multifactorial, there are structural changes in the peripheral nerves and current treatments remain largely symptomatic, non-specific and not uniformly effective. Transgenic diabetic RIP/INFβ mice when treated with low doses of streptozotocin (STZ) present with pancreatic β-cell destruction, mimicking autoimmune diabetes in humans. On the basis that mechanisms governing peripheral nerve degeneration and regeneration are controlled by dorsal root ganglion (GAD), the aim of this thesis was to characterize gene expression, and thus the biological processes that take place in the GAD of injured sciatic nerve, of transgenic RIP/INFβ mice treated with multiple low doses of STZ (Tg-STZ). Gene expression in GAD was studied in four different groups of mice: wild type ICR (ICR) as a wild type genetic background control; ICR treated with STZ (ICR-STZ); transgenic RIP/INFβ mice (Tg); and Tg mice treated with STZ (Tg-STZ). Four weeks after diabetes was established in Tg-STZ mice, a left sciatic nerve crush injury was performed in all groups, the right limb was left intact. Four weeks after sciatic nerve injury GAD samples were collected from both hind limbs. GAD RNA was extracted to perform microarray study (Affymetrix GeneChip® Mouse Genome 430 2.0 Array). Real time PCR (RT-qPCR) was performed to validate some of gene expression values obtained. Comparisons were made between the gene profiles from the different experimental conditions: 1) ICR-STZ injured vs ICR injured, 2) ICR injured vs ICR uninjured, 3) Tg-STZ uninjured vs ICR uninjured and 4) Tg-STZ injured vs ICR injured. Baseline samples were the uninjured limbs from ICR mice with a Fold Change value of 1. Once the compared profiles were obtained, upregulated and downregulated genes were analysed, as well as their related biological process, using different databases (Database for Annotation, Visulaization and Integrated Discovery; Center for Quantitaive Biology; Gene Home). The absence of differences in gene expression between injured limbs GAD from ICR-STZ mice vs ICR mice showed that STZ administration had no toxic effect in GAD. Four weeks after sciatic nerve injury, genes associated with nerve regeneration were still upregulated in ICR mice, particularly those involved in signalling (Gpr151, Nts), synaptic transmission (Npy), neuronal projection and axonal guidance (Sox11, Atf3, Tnc, Sema6a, Sprr1a, Gal). This finding indicates that the lesion was not completely resolved. Transgenic diabetic mice (Tg-STZ) showed downregulation of genes related to metabolic pathways (Vgf) and upregulation of genes implicated in carbohydrate (Car3) and lipid metabolism (Gdpd3), indicating that 8 weeks after DM onset, a sustained hyperglycaemia affects GAD. Transgenic diabetic mice (Tg-STZ) showed, after 8 weeks of sustained hyperglycaemia, downregulation of genes associated with nervous system development (Gal, Bdnf, Erg3), axonal regeneration (Sprr1a, Lingo1), synaptic transmission (Calb1, Snapin), signal transduction (Nts, Rgs2), potassium channel (Kcns1, Kcnq5, Knj13, Kcna6, Kcnt1) and apoptosis (Tfnaip, Ctsb, E2f1, Crh). Reflecting GAD degenerative changes due to PND. Four weeks after sciatic nerve injury, genes associated with nerve regeneration were still upregulated in diabetic transgenic mice (Tg-STZ) such as those involved in axon guidance (Foxd1), axonal regeneration (Sprr1a), neuronal projection (Mapk8), GAD neurons survival and neurite elongation (Gal, Sox11), or signalling (Npy1r, Igf1, Rgs18, Gpr151), synaptic transmission (Gabrb3, Neto1, CcKbr) and apoptosis (Crh). Suggesting ongoing posttraumatic GAD regeneration processes. Four weeks after sciatic nerve injury, several genes were downregulated in diabetic transgenic mice (Tg-STZ) involved in axogenesis (Nptx1, Cxcr4), neuromuscular synaptic transmission (Egr3) and transport (Htr3a, Tnpo, Mlc1, Slc15a2, Slc6a4), evidencing delayed nerve regeneration. Four weeks after sciatic nerve injury, genes associated with nerve regeneration were still upregulated in ICR mice, involved in extracellular matrix (MEC) reorganization and local microenvironment (Mmp16, Col18a1, Col3a1, Col5a2, Loxl2), cell adhesion (Lmo7, Flrt3), transport (Cacna2d1, Slc15a3, Slc15a9, Slc6a4) and apoptosis (Phb, Comp) indicating reorganization and regeneration of the injured site. Transgenic diabetic mice (Tg-STZ) only showed upregulation of 2 genes (Mmp16, Tgfbi) related to MEC reorganization. The remaining genes were barely upregulated. This finding is in accordance with a delayed regeneration, and with the fact that local remodelling is yet to be started. Four weeks after sciatic nerve injury, genes associated with neuropatic pain were upregulated in ICR mice (Npy, Npy2r, Gal). However, in diabetic transgenic mice Tg-STZ, no Npy expression was found and, moreover, Gal was downregulated. This finding could be related to PND loss of pain sensitivity. Our findings regarding genes and biological processes involved in nerve degeneration and regeneration mechanisms in ICR mice and in diabetic transgenic mice Tg-STZ lead to new research lines aimed to understanding PND pathogenesis and to the study of target therapeutic molecules for PND and diabetic pain.

La presente tesis estudia los sitios alostéricos desde una perspectiva estructural y evolutiva. La regulación alostérica es un aspecto fundamental de la vida a nivel molecular, ya que es el mecanismo más potente y frecuente en la regulación de la actividad proteica: mediante la unión de un ligando a un sitio que no es el sitio activo. Este fenómeno fue descrito por primera vez hace más de 50 años y desde entonces no ha dejado de captar la atención de la comunidad científica, llegando incluso a ser calificado como `el segundo secreto de la vida', después del código genético. Sin embargo, la comprensión cabal de los mecanismos involucrados continúa siendo un gran desafío científico. Actualmente, los sitios alostéricos han despertado un creciente interés por parte de expertos en química medicinal y compañías farmacéuticas, dado su potencial para el desarrollo de nuevos fármacos. La tesis se presenta como un `compendio de publicaciones'. El primer artículo fue publicado a principios del año 2010 y describe la primera etapa del proyecto, una serie de análisis computacionales a gran escala para caracterizar sitios de unión a ligando integrando información referente a secuencia, sitios activos y estructura para más de mil familias proteicas. Mediante la identificación de sitios de unión comunes en distintas estructuras de la misma familia proteica, se desarrolló un método para medir la conservación estructural de dichos sitios. Esta metodología permitió realizar una caracterización de sitios de unión considerando distintos aspectos, como la conservación evolutiva a nivel de secuencia, flexibilidad estructural, potencial electrostático y conservación estructural. El descubrimiento más significativo fue la inesperada falta de correlación entre las medidas de conservación de secuencia y estructura para muchos de los sitios de unión predichos. Este hallazgo es válido también para casos específicos de proteínas alostéricas, donde el sitio activo está conservado tanto a nivel de secuencia como de estructura, pero el sitio alostérico sólo presenta conservación a nivel estructural y no de secuencia. El segundo artículo fue publicado a fines del año 2012 y explora la relación entre la flexibilidad proteica y la regulación alostérica, definiendo una metodología computacional para la predicción de sitios alostéricos en estructuras proteicas. Más allá de los aspectos dinámicos que fueron estudiados mediante el análisis de modos normales, el método también incorpora la medida de conservación estructural desarrollada en el primer artículo. El sistema predictivo fue puesto a prueba utilizando un extenso conjunto de proteínas alostéricas de estructura conocida, obteniendo un valor predictivo positivo de 65%. Después de la segunda publicación, el método se ha implementado como servidor web para brindar apoyo a la investigación de la regulación alostérica, tanto para extender el conocimiento de esta forma fundamental de regulación de la actividad proteica, como para ayudar en la aplicación de dichos conocimientos al desarrollo de nuevos fármacos con objetivos terapéuticos. / This thesis studies protein allosteric sites from a structural and evolutionary perspective. Allostery is a fundamental aspect of life at the molecular level, the most common and powerful mechanism of protein activity regulation: through binding of a ligand to a site which is not the active site. This phenomenon was first described more than 50 years ago and it still captures the attention of researchers, while fully understanding its mechanisms remains a grand scientific challenge. Furthermore, allosteric sites have been increasingly calling the attention of medicinal chemists and pharmaceutical companies, given their potential for the development of novel therapeutics. The thesis is presented as a `compendium of published articles'. The first article was published at the beginning of 2010 describing the first stage of the thesis, a series of large-scale computational analyses to characterize putative small-molecule binding sites by integrating publicly available information on protein sequences, structures and active sites for more than a thousand protein families. By identifying common pockets across different structures of the same protein family a method was developed to measure the pocket's structural conservation. Characterization of putative ligand-binding sites followed using different measures such as sequence conservation, structural flexibility, electrostatic potential and structural conservation. The most relevant finding was the unexpected lack of correlation between the two conservation measures, of sequence and structure, for many of the predicted cavities. This general finding was also observed in specific cases of allosteric proteins, where the active site was conserved both in terms of structure and sequence but the allosteric site was conserved only from the structural perspective and did not show conservation at the sequence level. The second article was published at the end of 2012, it explores the relationship between protein flexibility and allosteric effects defining a computational methodology to predict the presence and location of allosteric sites on protein structures. Besides the dynamical aspects assessed through normal mode analysis, the method also incorporates the structural conservation measure defined in the first article. The predictive approach was benchmarked against a large data set of allosteric proteins of known structure obtaining 65% positive predictive value. After the second publication, the method has been implemented in the form of a freely available web-server aimed to support the work of researchers in the field of allosterism, both to improve the understanding of this fundamental form of protein function regulation and to serve applied purposes in the area of drug design and discovery.

Els test de resistència al antiretrovirals són utilitzats en la pràctica clínica per la personalització del tractament antiretroviral (TARV) de les persones infectades pel VIH-1. La seqüenciació poblacional (SP) és la tècnica més emprada pel genotipat del VIH-1 obtenint una bona correlació amb la resposta clínica dels pacients. No obstant, la baixa sensibilitat de la SP pel que fa a la detecció de mutacions de resistència als antiretrovirals (DRM) o soques X4-tròpiques presents en baixes prevalences pot comprometre l’eficàcia del TARV. L’aplicació de noves tècniques de seqüenciació massiva pel genotipat del VIH-1 (genotipat ultrasensible) permetria una caracterització de la població viral amb major resolució optimitzant el TARV. L’objectiu d’aquesta tesi era avaluar el valor clínic del genotipat ultrasensible pel maneig clínic de pacients infectats pel VIH-1 que han estat exposats a TARV. Durant la utilització de 454 sequencing per la determinació del tropisme viral, 454 sequencing va obtenir una major concordança amb ESTA (Enhanced Sensitivity TrofileTM Assay) en l’anàlisi de l’ARN viral. Tot i que la SP tenia una menor sensibilitat respecte 454 sequencing, la seva elevada especificitat li va permetre obtenir una millor precisió. Anàlisis filogenètics a partir de dades obtingudes per 454 sequencing van revelar que, encara que les determinacions eren equivalents entre amdós compartiments, en alguns pacients es va observar compartimentalització de seqüències pel que fa als haplotips i a la seva prevalença. Aquesta compartimentalització podria comprometre la determinació del tropisme viral en funció del compartiment que s’analitzi. Durant aquest treball també es va fer la validació de la SP per determinacions del tropisme a partir d’ADN proviral en un assaig clínic prospectiu i aleatoritzat. Aquest assaig va demostrar ser útil per guiar canvis de tractament antiretroviral que incloguin antagonistes de CCR5. De tota manera, 454 sequencing va ser capaç de detectar variants X4 tròpiques en dos pacients prèviament classificats com a R5 tròpics per SP. Pel que fa a la detecció de DRM en el gen pol, 454 sequencing va demostrar ser no-inferior a la SP durant l’avaluació de la susceptibilitat al tractament antiretroviral. Cal destacar que 454 sequencing va aportar informació genotípica addicional en la majoria dels pacients, encara que aquesta modifiqués poques prediccions de susceptibilitat. A més, aquesta tecnologia va ser utilitzada per explorar l’origen de les DRM en el gen de la integrasa del VIH-1, demostrant que virus mutants detectats durant el fracàs virològic poden ésser originats a partir de virus mutants minoritaris preexistents. En resum, aquesta tesi ha mostrat la utilitat clínica del genotipat ultrasensible del VIH-1 en pacients experimentats al TARV. 454 sequencing ha permès una profunda caracterització de la diversitat viral dins l’hoste, facilitant l’estudi l’evolució viral i la seva patogènesi del VIH-1. A més, l’estandarització i automatització dels protocols de 454 sequencing permetria la implementació d’aquesta tecnologia pel diagnòstic del VIH-1. / Los ensayos de resistencia a los antiretrovirales son utilizados en la práctica clínica para la personalización del tratamiento antirretroviral (TARV) de las personas infectadas por el VIH-1. La secuenciación poblacional (SP) es la técnica más utilizada para el genotipado del VIH-1 obteniendo una buena correlación con la respuesta clínica de los pacientes. Asimismo, la baja sensibilidad de la SP para la detección de mutaciones de resistencia a los antiretrovirales o variantes X4-trópicas presentes en baja prevalencia puede comprometer la eficacia de la TARV. El objetivo de esta tesis era evaluar el valor clínico del genotipado ultrasensible para el manejo clínico de pacientes infectados por el VIH-1 que han estado expuestos a TARV. Durante la utilización de 454 sequencing para la determinación del tropismo viral, 454 sequencing obtuvo una mayor concordancia con ESTA (Enhanced Sensitivity TrofileTM Assay) en el análisis del ARN viral. Aunque la SP mostró una menor sensibilidad que 454 sequencing, su elevada especificidad le permitió obtener una mayor precisión. La información genotípica generada por 454 sequencing fue utilizada para evaluar la compartimentalización. Aunque las determinaciones del tropismo viral eran equivalentes entre los compartimentos, en algunos pacientes se observó compartimentalización de secuencias, lo que puede comprometer la determinación del tropismo viral en función del compartimento que analizado. Durante este trabajo también se hizo la validación de la SP para determinaciones del tropismo a partir de ADN proviral en un ensayo clínico prospectivo y aleatorizado. Este ensayo demostró ser útil para guiar cambios de tratamiento antirretroviral que incluyan antagonistas de CCR5. De todos modos, 454 sequencing fue capaz de detectar variantes X4 trópicas en dos pacientes previamente clasificados como R5 trópicos por SP. En cuanto a la detección de DRM en el gen pol, 454 sequencing demostró ser no inferior a la SP durante la evaluación de la susceptibilidad al tratamiento antirretroviral. Cabe mencionar que 454 sequencing aportó información genotípica adicional en la mayoría de los pacientes, aunque esta modificara pocas predicciones de susceptibilidad. Además, esta tecnología fue útil para explorar el origen de las DRM en el gen de la integrasa del VIH-1, mostrando que los mutantes detectados durante el fracaso virológico pueden ser originados a partir de mutantes pre-existentes. En resumen, esta tesis ha mostrado la utilidad clínica del genotipado ultrasensible del VIH-1 en pacientes experimentados al TARV. 454 sequencing ha permitido una profunda caracterización de la diversidad viral dentro del huésped, facilitando el estudio de la evolución viral i la patogénesis del VIH-1. Además, la estandarización i automatización de los protocolos de 454 sequencing permitiría la implementación de esta tecnología para el diagnóstico clínico del VIH-1. / Drug resistance testing is utilized in the clinical routine to personalize ART of HIV-1 infected people. Population sequencing is employed for HIV-1 genotyping obtaining good correlations with clinical outcomes. However, its lack of sensitivity to detect minority DRM mutations or minor CXCR4-using viruses can compromise the efficacy of antiretroviral therapy (ART). The use of next generation sequencing technologies for ultrasensitive HIV-1 genotyping might allow deep characterization of the viral population optimizing the ART. The objective of this work was to evaluate the clinical value of ultrasensitive HIV-1 genotyping obtained by 454 sequencing for the management of ART-experienced HIV- 1 subjects in different treatment situations. During the utilization of 454 sequencing for viral tropism determinations, this technology achieved the closest diagnostic accuracy to ESTATM in plasma ARN. Although population sequencing had lower sensitivity than 454 sequencing, its highest specificity led to obtain closest accuracy to ESTA. Even though tropism determinations were equivalent between plasma and cellular compartments, phylogenetic analyses from data generated by 454 sequencing revealed sequence compartmentalization in some subjects. We also validated triplicate population HIV-1 genotyping from PBMC-associated DNA for viral tropism determinations in a prospective and randomized clinical trial. Here, genotypic tropism testing in proviral DNA demonstrated to become a suitable tool to guide treatment switches to CCR5 antagonists in aviremic individuals. In this study, 454 sequencing was capable to detect non-R5 viral strains in two subjects previously classified as harboring R5 HIV-1 strains by population sequencing. This compartmentalization might compromise viral tropism determinations depending on the compartment analyzed. Furthermore, the absence of evolution observed during prolonged periods of aviremia suggested that testing of stored plasma sample would be generally safe and informative. Regarding the detection of minority DRM in pol gene, 454 sequencing for ultrasensitive HIV-1 genotyping was technically non-inferior than population HIV-1 genotyping during the assessment of antiretroviral drug susceptibility. However, although this technology provided additional genotypic information beyond population sequencing in most of heavily pre-treated individuals tested, only few antiretroviral susceptibility predictions were modified. This technology was also useful to explore the origin of DRM in integrase gene, revealing that mutants detected at the time of virological failure can be originated from pre-existing minority drug resistance variants. In summary, this thesis has shown the clinical utility of ultrasensitive HIV-1 genotyping in ART-experienced HIV-1 infected individuals. However, further studies should extend our findings. 454 sequencing allowed a deep characterization of the HIV-1 diversity within a host helping to understand viral evolution and HIV-1 pathogenesis. Moreover, the standardization and automation of 454 sequencing protocols for HIV-1 sequencing would allow the implementation of this technology for HIV-1 diagnosis.

Los tumores cerebrales se desarrollan dentro del sistema nervioso central y pueden ser originados por células del mismo sistema nervioso, o bien tratarse de una metástasis con origen en un órgano distinto. Representan menos de un 2% del total de casos de cáncer diagnosticados cada año a nivel mundial, pero a pesar de ello, constituyen una fuente importante de mortalidad y discapacidad. El diagnóstico de este tipo de tumores generalmente se lleva a cabo mediante técnicas de imagen (IRM) y espectroscopía (ERM) por resonancia magnética nuclear (RMN) gracias a sus características morfológicas y aspectos bioquímicos diferenciales. La ERM está considerada como el método no invasivo que permite estudiar más adecuadamente el metabolismo de los seres vivos ya que puede determinar cualitativa y cuantitativamente una gran variedad de metabolitos en el tejido intacto, proporcionando una información extensa sobre su composición. Sin embargo queda limitada por una baja resolución espectral, en comparación con la resolución que se puede llegar a obtener con los análisis in vitro. En ese sentido, la evaluación in vitro de biopsias de tumores cerebrales mediante la técnica de espectroscopía de alta resolución “high resolution magic angle spinning spectroscopy” (HRMAS) complementa la información bioquímica obtenida in vivo y en muchos casos puede contribuir a mejorar el diagnóstico no invasivo y manejo de la enfermedad. La espectroscopía HRMAS consiste en hacer girar una muestra a altas velocidades en un ángulo de 54,7o respecto al campo magnético principal. Este tipo de adquisición reduce la anchura de las señales detectados en el espectro de RMN que viene principalmente causada por las interacciones dipolares entre núcleos de la muestra, con contribuciones adicionales de la heterogeneidad de la muestra y parámetros residuales anisotrópicos. Los métodos de manipulación de muestras de tejido para su análisis por HRMAS son relevantes y pueden interferir en los resultados. La obtención, conservación y temperatura a la que están sometidas las muestras pueden ser determinantes y desencadenar el metabolismo post mortem. A ese respecto, el uso de la irradiación por microondas focalizadas (FMW) puede ser una opción eficiente, actuando rápidamente y causando la inactivación de dicho metabolismo postmortem. Este método es ampliamente utilizado para el sacrificio de animales y capaz de preservar el metaboloma de muestras o tejidos. En esta tesis se han desarrollado distintas optimizaciones y estudios alrededor de la irradiación por FMW. En un primer momento, se estudió la influencia del método de sacrificio (sobredosis de anestesia vs. irradiación por FMW) en el patrón espectral HRMAS de tejidos obtenidos de modelos preclínicos de tumor glial de alto grado (GL261) y de isquemia cerebral en rata. Luego, se ha desarrollado una estrategia para minimizar los cambios en el patrón espectral de tejido cerebral y patológico mediante protocolos de fijación por irradiación FMW previa al análisis HRMAS, en muestras que habían sido sometidas a la congelación. Dicho método se desarrolló con vistas a su aplicación a biopsias de tumores cerebrales humanos. Paralelamente, se llevaron a cabo estrategias de reconocimientos de patrones espectrales con espectros HRMAS adquiridos de muestras de tumores cerebrales humanos. Estas estrategias, aparte de validar el uso del programa SpectraClassifier (desarrollado en el grupo de investigación) como herramienta para reconocimiento de patrones, en el caso de espectros HRMAS también estudió la posible influencia de la temperatura y secuencias de adquisición sobre el rendimiento de los clasificadores desarrollados. Se ha comprobado además que la irradiación por FMW de las biopsias de tumores, aunque no se refleja en una mejora sustancial en el rendimiento del clasificador, no parece tener una influencia negativa sobre éste y puede ser utilizada como método de preservación del patrón espectral de las biopsias investigadas. / Brain tumors develop within the central nervous system and could originate from nervous system itself or they can be due to a metastasis originating from a different organ. They represent less than 2 % of all diagnosed cases of cancer each year worldwide, but despite this, they are a major source of mortality and disability. Their diagnosis is generally carried out by nuclear magnetic resonance (NMR) techniques, both imaging (MRI) and spectroscopy (MRS) due to their differential morphological and biochemical characteristics. MRS is considered one of the best noninvasive methods to study metabolism of living beings, due to its ability for assessing both qualitatively and quantitatively a panoply of metabolites in the intact tissue, providing extensive information on its composition. However, there are limitations related to the relatively low spectral resolution achieved, in comparison with the in vitro studies resolution. In this sense, the in vitro evaluation of brain tumor biopsies using the high resolution magic angle spinning spectroscopy (HRMAS) technique could complement the biochemical information obtained through in vivo studies, and could help to improve diagnosis and management of disease. The HRMAS spectroscopy technique consists in spinning the sample at high speeds with an angle of 54.7o respect to the main magnetic field. This type of acquisition reduces the width of the spectral signals which are due mainly to the dipolar interactions, which are caused, in turn, by intrinsec factors of the sample and residual anisotropic parameters. The handling methods for tissue samples which will be used in HRMAS analysis are relevant and could interfere with the final result. The collection, storage and temperature conditions of the samples could be determining and could also induce post mortem metabolism. In this respect, the use of focused microwave irradiation (FMW) could be an efficient option, acting in a fast way and inactivating any postmortem metabolism. FMW fixation is a widely used method for animal sacrifice, in order to preserve the metabolome of tissue samples. In this thesis we have developed different studies around the FMW irradiation. First, we have studied the influence of the method used for animal sacrifice (anaesthesia overdose vs. FMW irradiation) in the spectral pattern of tissue samples from preclinical high grade tumors (GL261) and samples from preclinical models of ischaemic rat brain. Afterwards, we have developed a strategy to minimize spectral pattern changes of normal and pathological brain tissue through FMW irradiation prior to HRMAS analysis in previously frozen samples. This method was developed with the objective of its application to human brain tumor biopsies. In parallel, pattern recognition studies were carried out with HRMAS spectra acquired from those human brain tumor biopsies. These studies, besides of making possible the validation of SpectraClassifier software (developed in house within the research group where this thesis was performed) as a pattern recognition tool for HRMAS spectra, also assessed the influence of temperature and acquisition sequence in the performance of the developed classifiers. It has been proved, in addition, that although the FMW irradiation of the biopsies does not have a substantial impact in the classifier performance, it does not seem to have a negative influence over it, and could be used as a spectral pattern preservation method for studies of human brain tumors biopsies.

El desenvolupament de la capacitat metastàtica és deguda a l’adquisició de característiques específiques que acompanyen a la cèl·lula tumoral durant la progressió tumoral, tant en el microentorn local com en llocs distants. El nostre grup s’ha centrat en la identificació de proteïnes que intervenen en la patogènesi de la òrgan-especificitat de la metàstasi del càncer de mama (1,2,3). Basant-nos en resultats genòmics i proteòmics previs que indicaven una sobreexpressió de la proteïna ERp57 en cèl·lules amb habilitat per metastatitzar a l’os, vam analitzar el caràcter òrgan-específic d’aquest fenotip funcional i la seva implicació en la patogènesis de la metàstasi òssia. La modulació dels nivells d’aquesta proteïna podria mediar l’adaptació metabòlica al microentorn ossi, ja que la seva expressió pot regular-se pels baixos nivells de glucosa i d’oxigen d’aquest microentorn (4). La sobre-expressió d’ERp57 intervé en la fallida del reconeixement immunitari de les cèl·lules metastàtiques a os, dificultant el transport de molècules d’HLA I a la membrana cel·lular i afavorint la retenció en el Golgi. Per una altra banda, ERp57 remodela el citoesquelet de vimentina. Aquest fet suggereix un paper en la transició mesènquima-epiteli, imprescindible per a l’establiment de la cèl·lula metastàtica en el nou òrgan. La infra-expressió d’ERp57 és suficient per interrompre el procés metastàtic a os, indicant la rellevància de la seva funció en la reprogramació metabòlica que facilita l’adaptació de les cèl·lules de càncer de mama que metastatitzen a l’os. La combinació de l’espectroscòpia de Raman (RS) amb tècniques d’anàlisi multivariat ens ha proporcionat un mètode quantitatiu poderós per a la discriminació de fenotips metastàtics, basant-nos en les seves característiques metabòliques (5). L’ús de RS ens ha permès distingir un fenotip lipídic associat a la òrgan-especificitat de la metàstasi. La determinació de les bandes dels àcids grassos totals o TFA (2845 cm-1) i dels àcids grassos insaturats o TUFA (3015 cm-1) distingeix les cèl·lules de càncer de mama amb capacitat per metastatitzar a l’os d’altres amb capacitat per a metastatitzar a cervell o pulmó. L’anàlisi de dades genòmiques de pacients va corroborar aquest fenotip amb una sobre-expressió de gens del metabolisme lipídic en metàstasi cerebral de càncer de mama. Aquestes cèl·lules presenten un augment òrgan-específic en els nivells de síntesi lipídica i en la presència d’àcids grassos saturats, així com en la capacitat oxidativa d’àcids grassos. Aquest fenotip confereix major supervivència en situacions d’hipoglucèmia. L’autofàgia col·labora amb aquests processos afavorint la degradació de proteïnes malplegades i aportant intermediaris per al cicle de Krebs. Finalment, estudis de morfologia i dinàmica mitocondrial recolzen les dades metabòliques i suggereixen que aquestes característiques poden ser conseqüència de l’expressió diferencial de proteïnes que regulen el mitocondri en cada microentorn. Aquestes noves troballes indiquen nous fronts terapèutics per combatre la progressió metastàtica en el càncer de mama. / The development of the metastatic capacity is owed to the acquisition of specific features that accompany the tumoral cell during the tumoral progression, in the local microenvironment or in distant places. Our group has focused on the identification of proteins that take part in the pathogenesis of the organ-specificity of breast cancer metastasis (1,2,3). We based our study on previous genomic and proteomic results, which showed an over-expression of ERp57 in cells metastatic to bone. We analyzed the organ-specificity of this functional phenotype and its implication in the pathogenesis of bone metastasis. The modulation of this protein could favor the metabolic adaptation to the bone, as ERp57 expression is regulated by the low glucose and oxygen levels found in this microenvironment (4). ERp57 over-expression is involved in the failure of immune recognition of bone metastatic cells, hampering the transport of HLA I molecules to the cell membrane and contributing to Golgi retention. On the other hand, ERp57 reorganizes the vimentin cytoskeleton. This fact suggests a role in the mesenchimal-epithelial transition, which is an essential step for the establishment of the metastatic cell in the new organ. ERp57 under-expression blocks bone metastasis formation suggesting the importance of this protein in the metabolic reprogramming that mediates bone metastatic breast cancer cells adaptation. The combination of Raman spectroscopy (RS) with multivariate analysis techniques has provided a powerful quantitative method for the discrimination of metastatic phenotypes based on metabolic features (5). RS allowed us to distinguish a lipid phenotype associated to the organ-specificity of the metastasis. The determination of total fatty acids or TFA band (2845 cm-1) and total unsaturated fatty acids or TUFA band (3015 cm-1) could distinguish breast cancer cells with the ability to metastasize to bone from those metastatic to brain or lung. The analysis of patients’ genomic data confirmed this phenotype, showing an over-expression of genes related to lipid metabolism in breast cancer brain metastasis. These cells present an organ-specific increase in lipid synthesis and in saturated fatty acids, as well as an increase in the lipid oxidative capacity. This phenotype confers a greater survival advantage in hypoglycemic conditions. Autophagy collaborates with these processes facilitating the degradation of misfolded proteins and providing intermediaries for the Krebs cycle. Finally, studies of morphology and mitochondrial dynamics confirm the metabolic data and they suggest that these features could be a consequence of the differential expression of proteins that regulate the mitochondrion in each microenvironment. These findings point to new therapeutic options to fight against metastatic progression in breast cancer.

El trabajo descrito en esta tesis doctoral se enmarca dentro del proyecto MELOGEN (GEN2013‑ 20237, 2004‑2007) uno de cuyos objetivos era la construcción de una plataforma de TILLING en melón. La disponibilidad de recursos genéticos y genómicos para el melón se ha incrementado a lo largo de los últimos años e incluso la secuencia del genoma está disponible. Sin embargo, las herramientas genómicas para determinar la funcionalidad de los genes en esta especie son todavía limitadas. El TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) es un método de genética inversa mediante el cual se pueden crear e identificar nuevas mutaciones en genes candidatos y observar su efecto fenotípico. Además, también se pueden detectar fenotipos de interés para posteriormente identificar la mutación responsable de los mismos. En este trabajo se ha desarrollado una población de TILLING en Cucumis melo a partir de la línea doble haploide del tipo “Piel de Sapo” M62‑113. Aplicando inicialmente el mutágeno químico EMS (Etil Metano Sulfonato) sobre 17.000 semillas se ha desarrollado una colección de mutantes compuesta por 3.268 familias M2. A partir de 400 familias M2 se observaron diversos fenotipos mutantes en las diferentes etapas de crecimiento de la planta. Algunos de estos mutantes se han descrito con detalle generando un catálogo de los fenotipos observados en cada familia, algunos de los cuales pueden tener interés comercial. Para medir la tasa de mutación de la población se han analizado cuatro genes, la fitoeno desaturasa PDS, los factores de iniciación de la traducción eIF4E y eIF(iso)4E y el receptor de etileno ETR1. Los mutantes detectados han permitido calcular la tasa de mutación de la población, una mutación cada 1,5 Mb. En el caso de PDS se ha podido obtener un mutante con fenotipo albino, demostrando así la efectividad del método TILLING en melón. Además, paralelamente se analizaron los mismos genes en otra población mutagenizada independiente. También se realizó un estudio de EcoTILLING con 113 accesiones de melón y se identificaron 19 haplotipos distintos en el gen eIF4E, uno de ellos, con un SNP que provoca un cambio de aminoácido y que sólo se encuentra en la accesión PI 505602 y dos haplotipos en el gen ETR1, uno de los cuales también contiene un SNP que provoca un cambio de aminoácido. El TILLING facilitará los estudios de genética inversa en melón y abre la puerta a futuros estudios de genómica funcional en un genoma recientemente secuenciado. Este trabajo ha representado también el primer paso para poder desarrollar nuevas poblaciones de TILLING en melón con mayores tasas de mutación y en otros fondos genéticos. / The work described in this thesis is part of the MELOGEN project (GEN2013‑20237, 2004‑2007) one of whose goals was to build a melon TILLING platform. The availability of genetic and genomic resources in melon has increased over recent years, and even the sequence of the genome is available. However, genomic tools to determine the functionality of genes in this species are still limited. TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) is a reverse genetics method by which you can create and identify new mutations in candidate genes and observe their phenotypic effect. Furthermore, it is also possible to detect phenotypes of interest in order to identify their responsible mutation. In this project we developed a TILLING population in Cucumis melo L. in the double haploid M62‑113 line from the ʺPiel de Sapoʺ type. Applying the chemical mutagen EMS (Ethyl methane sulfonate) over 17,000 seeds we have developed a collection of mutants consisting of 3268 M2 families. Phenotypic mutants were observed in 400 M2 families in different stages of plant growth during the development of the population. Some mutant phenotypes have been described and identified in detail by generating a catalogue of phenotypic changes. Some of these phenotypes may have a commercial interest. We have analysed four genes to identify the rate of mutation in the population: Phytoene desaturase (PDS), Eukaryotic translation initiation factors (eIF4E and eIFiso4E) and the Ethylene receptor (ETR1). Mutants detected allowed to calculate the mutation rate of the population, one mutation per 1.5 Mb. For PDS we were able to obtain a mutant with an albino phenotype, demonstrating the effectiveness of TILLING method in melon. Moreover, in parallel the same genes were analyzed in another independent mutagenized population. A study of Ecotilling was also performed in 113 melon accessions and 19 different haplotypes in the eIF4E gene were obtained. One of them contained a SNP that causes an amino acid change and was only found in the accession PI 505602 and two other haplotypes were found in the ETR1 gene, one of which also contains a SNP that causes an amino acid change. TILLING will facilitate reverse genetics studies in melon and opens the possibility of performing future functional genomics studies in a newly sequenced genome. This work has also represented the first step to developing new melon TILLING populations with higher rates of mutation and in other genetic backgrounds.

Los tumores del sistema nervioso central (SNC) abarcan menos de un 2 % del total de casos de cáncer diagnosticados cada año a nivel mundial (aproximadamente 175.000) representado entre 0,4 y 25,4 de casos por 100.000 adultos. A pesar de ello, constituyen una fuente importante de mortalidad y discapacidad. Actualmente los conocimientos que se tienen sobre el desarrollo de los tumores es reducido, porque en la mayor parte de los casos los tumores cerebrales se detectan en estado avanzado de desarrollo (como consecuencia, principalmente, de la aparición de síntomas que llevan al paciente a indagar sobre su estado). Es por esto que se tienen pocos datos de las fases iniciales de desarrollo de estos tumores. Por tanto, es necesario esclarecer el fenotipo molecular de la progresión de tumores cerebrales in vivo, con el objeto de conocer mejor su evolución y poder así mejorar su detección, ya que cuanto más se tarde en alcanzar el diagnóstico correcto, más se reducen las posibilidades de la persona afectada de sobrevivir al tumor. El trabajo de esta tesis, se ha centrado en intentar comprender los lípidos móviles. Cuando se habla de lípidos móviles (ML, en la abreviatura clásica anglosajona) visibles por espectroscopía de RMN, se hace referencia básicamente a las resonancias provenientes de las cadenas de ácidos grasos de lípidos neutros en triacilgliceroles, apareciendo las más características a 0,9, 1,3, 2,0 y 5,3 ppm. El interés por entender el origen celular de estas resonancias proviene de su aparición en numerosas muestras biológicas, tanto asociadas con malignidad y muerte celular como con procesos benignos como diferenciación y variación de la velocidad de proliferación. Actualmente no se conoce el significado celular de los cambios vistos en espectroscopia de resonancia magnética en los lípidos móviles, aunque se cree que se trata más bien de cambios biofísicos más que bioquímicos, ya que se ha comprobado que su concentración no varía, lo que varía es la detección mediante MRS. Para obtener más información sobre el origen celular de los lípidos móviles, se trabajó con cultivos celulares de células de glioma de rata (C6) que se estudiaron con HR-MAS a diferentes velocidades para estudiar el efecto de dicha velocidad en la “visualización” de dichos lípidos móviles. Así mismo, se desarrollaron modelos in vitro de gotículas celulares y se inmovilizaron dichos modelos para ver cómo afectaba a la “visualización” de lípidos móviles. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protón (¹H MRS) se presenta como una posible alternativa para la caracterización de tumores cerebrales, ya que es una técnica que permite obtener información, de forma no invasiva, de la presencia de algunos productos del metabolismo celular. Con estos datos se pretende esclarecer el fenotipo molecular de tumores cerebrales in vivo, lo que nos permitiría reconocer patrones que nos ayuden a identificar los diferentes tipos de tumores cerebrales. Siguiendo este objetivo, en esta tesis se trabajó con modelos preclínicos de ratón con glioblastoma, oligodendroglioma de grado II y III y parénquima cerebral sano y se desarrollaron cuatro clasificadores de tipo y grado tumoral nuevos para tumores cerebrales preclínicos en ratón mediante el uso del programa Spectra Classifier aplicado a matrices de datos de imagen espectroscópica (IERM). / Central nervous system tumors (CNS) represent less than 2% of all cases of cancer diagnosed each year worldwide (approximately 175,000), which means between 0.4 and 25.4 cases per 100,000 adults. Despite this, they constitute an important source of mortality and disability. Current knowledge about the etiology of these tumors is scarce, because in most cases they are detected when they are already in an advanced state, when symptoms appear. Due to this fact, there is not much information about the early stages of development of those tumors. Therefore, it is necessary research on the progression of the molecular phenotype of brain tumors in vivo, in order to better understand their evolution and improve their detection, because the time spent to achieve the correct diagnosis may reduce the survival possibilities of the person afflicted by the pathology. Work in this thesis has mostly focused on mobile lipids. Mobile lipids (ML), visible by NMR spectroscopy, are resonances from fatty acyl chains of neutral lipids in triacylglycerols, the most characteristic of them resonating at frequencies of 0.9, 1.3, 2.0 and 5.3 ppm. The interest in understanding the cellular origin of those resonances arises from their presence in many biological tissues, associated with malignancy and cell death, as well as with benign processes such as differentiation or with changes in the proliferation rate. Currently, the cellular meaning of the changes observed with magnetic resonance spectroscopy in ML remains unknown. One hypothesis is that it could be associated to biophysical rather than biochemical changes, since it is not the concentration of ML that changes, but their detectability by MRS. In order to obtain more information about the cellular origin of ML, the work of this thesis was performed on rat glioma cells (C6) and High-resolution, Magic Angle Spinning (HR-MAS) NMR spectroscopy, at different spinning rates, to evaluate how such spinning rate affects the "visualization" of ML. Also, an in vitro model of artificial liipid droplets was developed. These artificial lipid droplets were than immobilized into a solid support to see how this would perturbate their NMR "visibility". Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (¹ H MRS) in vivo, is also a feasible alternative for the preoperative characterization of brain tumors, since it is a technique that allows to obtain information, in a non-invasive way, about the presence of products of cellular metabolism. In vivo ¹ H MRS data were also used in this thesis to clarify the molecular phenotype of brain tumors in vivo, thus allowing to recognize patterns that may be of help to identify the different types of brain tumors. To reach this goal, magnetic resonance spectroscopic imaging data from preclinical mouse models with glioblastoma, grade II and III oligodendroglioma and healthy brain parenchyma were used to develop four tumor type and grade classifiers using the program Spectra Classifier.

Actualment, el cribratge virtual juga un paper central en el món del descobriment de fàrmacs. L’anàlisi in silico permet el cribatge de milions de molècules petites i la tria de les més prometedores per a les proves experimentals. Per trobar candidats que puguin esdevenir fàrmacs, és crucial reunir una sèrie d’eines computacionals individuals i complementàries. En aquesta tesi, es descriu un procediment automatitzat de cribatge virtual que combina el modelat de farmacòfors i el seu ús en cerques, mètodes d’alt rendiment d’acoblament molecular, puntuació de consens i estimació d'energia lliure d'unió mitjançant el mètode d’energia d'interacció lineal (LIE) a partir de simulacions de dinàmica molecular. Un dels objectius d'aquesta tesi ha estat el de construir una metodologia flexible i versàtil de cribratge virtual, que permeti la integració de diferents eines en les diferents etapes de l’estudi. El procediment, que es va iniciar com la combinació d'un senzill filtre per tamany, la simulació de l’acoblament molecular i una puntuació de consens, ha derivat en un procediment computacional elaborat i automatitzat amb l'addició de cerques basades en farmacòfor i l'estimació de l'energia lliure d'unió mitjançant el mètode LIE. Aquest mètode integrat té l’objectiu de compensar les debilitats individuals de les diferents tècniques usades i permet avaluar i comparar el rendiment i la l’exactitud d'aquestes tècniques. Una altra fita important ha estat l'aplicació del procediment computacional a proteïnes diana concretes per tal d’avaluar-ne la capacitat de trobar molècules que puguin ser candidats a fàrmacs. Tests experimentals realitzats per a la β-Glucosidasa àcida i la hidrolasa de Bleomicina humanes indiquen que diverses molècules petites seleccionades pel procediment computacional tenen activitat inhibitòria micromolar. El mètode LIE emprat en aquest treball es va aplicar sobre més de deu mil complexos proteïna-lligand per a tres proteïnes diana diferents, el que és, al nostre entendre, la primera aplicació del mètode LIE a aquesta escala. / Virtual screening plays a central role in the world of drug discovery today. In silico testing allows to screen millions of small molecules and to choose only the most promising ones for experimental testing. To find potential drug candidates, it is crucial to bring together individual and complementary computational tools. In this thesis, I describe an automated virtual screening procedure that combines pharmacophore modeling and searches, high-throughput molecular docking, consensus scoring and binding free energy estimation with the linear interaction energy (LIE) method through molecular dynamics simulations. One goal of this thesis was to build an evolving and versatile virtual screening methodology, which enables integration of different tools at different steps. The procedure that started as a combination of a simple size filter, molecular docking and consensus scoring, advanced into an elaborate and automated computational workflow with the addition of pharmacophore searches and binding free energy estimation with LIE. This integrated method intends to compensate for weaknesses of individual structure-based techniques and allows the evaluation and comparison of the performance and accuracy of these techniques. Another important goal was to apply the computational workflow to target proteins and find hits that could be drug candidates. Experimental testing performed for human acid β-Glucosidase and bleomycin hydrolase indicate that several small molecules selected by the computational workflow display micromolar inhibitory activity. The standard LIE method used in this work was applied to more than ten thousand ligand-protein complexes for three different targets, which is, to our knowledge, the first time application of LIE at such large scale.

Aquesta tesis s’emmarca en el camp de les carboxipeptidases citosòliques de mamífers, centrant-­‐se particularment en els membres 2 i 3 d’aquesta subfamília de metalocarboxipeptidases. Aquest treball constitueix el primer estudi sobre la funció d’aquests enzims a través d’aproximacions in silico, in vitro i in vivo. Aquesta tesis consta de les parts descrites a continuació. El primer capítol introdueix el camp de les matalocarboxipeptidases, els microtúbuls, les modificacions post-­‐traduccionals de la tubulina i estableix els objectius de la tesi. El segon capítol és una compilació dels procediments experimentals i materials utilitzats en el treball experimental. El tercer capítol presenta la caracterització funcional de la carboxipeptidasa citosòlica 3 humana. Els resultats d’aquest estudi han estat la base pel quart capítol, on es descriu la funció de la CCP2. Ambdues CCP2 i CCP3 isoformes de ratolí s’estudien mitjançant enginyeria de proteïnes i utilitzant els models de ratolí knockout de CCP2 i CCP3. Els capítols III i IV es subdivideixen en un resum del capítol, els resultats que descriuen el detall dels descobriments i una discussió. A continuació es presenta una discussió general sobre CCP2 i CCP3, el seu rol en la cèl·∙lula i en el context de la subfamília de carboxipeptidases que, en mamífers, consta de sis gens codificants per enzims amb activitat deglutamilasa. La tesis finalitza amb un resum de les conclusions. El capítol IV juntament amb els experiments de modelat estructural del capítol III són la base de la següent publicació científica: Tort O, Tanco S, Rocha C, Bièche I, Seixas C, Bosc C, Andrieux A, Moutin MJ, Avilés FX, Lorenzo J, Janke C. The cytosolic carboxypeptidases CCP2 and CCP3 catalyze posttranslational removal of acidic amino acids. MBoC. doi:10.1091/mbc.E14-­‐06-­‐1072 / This thesis is situated in the field of the mammalian cytosolic carboxypeptidases, particularly focusing in members 2 and 3 from this subfamily of metallocarboxypeptidases. This work gives insight for the first time into the role of those enzymes by in silico, in vitro and in vivo approaches. The thesis is divided in parts as described below. The first chapter introduces the fields of metallocarboxypeptidases, microtubules, tubulin posttranslational modifications and settle the objectives of the thesis. The second chapter is a compilation of the experimental procedures and materials used for the experimental work. The third chapter presents the functional characterization of human cytosolic carboxypeptidase 3. The results from this study were the basis for chapter four, where the function of CCP2 is described and both CCP2 and CCP3 mouse isoforms are studied by protein engineering and using CCP2 and CCP3 knock-­‐out mouse models. Chapters III and IV are subdivided into a summary of the chapter, the results describing the findings in detail and a discussion. The following chapter sets a general discussion on CCP2 and CCP3, their role in the cell and in the context of a family, in mammals, of six genes coding deglutamylating enzymes. A final section includes a summary of the conclusions. Chapter IV together with the modeling experiments form Chapter III is the basis of the following scientific paper: Tort O, Tanco S, Rocha C, Bièche I, Seixas C, Bosc C, Andrieux A, Moutin MJ, Avilés FX, Lorenzo J, Janke C. The cytosolic carboxypeptidases CCP2 and CCP3 catalyze posttranslational removal of acidic amino acids. MBoC. doi:10.1091/mbc.E14-­‐06-­‐1072