La histona H1 es necesaria para la condensación de la cromatina y puede estar implicada en la activación y en la inhibición de genes específicos. La histona H1 está codificada por una familia multigénica. En los mamíferos hay seis subtipos somáticos, H1a-e y H1º, una variante específica de la línea germinal masculina, H1t, y una variante propia de los oocitos, H1ooHemos estimado las afinidades relativas de los seis subtipos somáticos de mamífero, H1a-e y H1º, por la SAR del agrupamiento de los genes de las histonas de Drosophila y por un fragmento de pUC19 de similar longitud, mediante un ensayo de competición de dos subtipos presentes en similar concentración por una cantidad limitada de DNA. El orden de afinidades por la SAR fue H1a (1,0)<H1c (3,9)<H1b (5,4)<H1e (14,4)<H1º (19,5)<H1d (20,0), donde el número entre paréntesis es la afinidad relativa expresada en relación al subtipo de unión más débil, la H1a. El orden de afinidades por el fragmento de pUC19 fue H1a (1,0)<H1c (5,3)<H1b (6,4)<H1e (16,5)<H1º (22,3)<H1d (25,5). Las afinidades relativas de los subtipos por la SAR y el pUC19 son similares. Es posible distinguir tres grupos de afinidad: la H1a de baja afinidad, la H1b y la H1c de afinidad intermedia y la H1d, H1e y H1º de alta afinidad.Experimentos de desplazamiento de un subtipo unido al DNA por otro subtipo añadido posteriormente confirman cualitativamente el orden de afinidades obtenido de los experimentos de equilibrio.Experimentos de competición entre el fragmento SAR y el fragmento de pUC19 por una cantidad limitada de uno de los subtipos de la H1 muestran que todos los subtipos somáticos, H1a-e y H1º, comparten el carácter de proteína de unión a las SAR Las afinidades de cada uno de los subtipos por el DNA están determinadas a la vez por las características de cada subtipo y de las secuencias de DNA a las que se unen.La perturbación del complemento de H1 de la cromatina nativa mediante la adición de subtipos de la H1 exógenos, en presencia de SAR para mantener la estequiometría de la H1 en la cromatina, ha permitido estimar las afinidades relativas de los subtipos H1a-e y H1º por la cromatina. El orden de afinidades expresado en relación a la H1a fue H1a (1.0)<H1b (4.1)<H1c (6.2)<H1e (15.3)<H1º (16.6)<H1d (19.0). Las afinidades relativas son similares a las obtenidas para el DNA. Como en el caso del DNA, es posible distinguir tres grupos de afinidad: la H1a de baja afinidad, la H1b y la H1c de afinidad intermedia y la H1d, H1e y H1º de alta afinidad.Los experimentos de condensación de los fragmentos de la SAR, el PUC19 y el pBR322 con PEG, que condensa el DNA por efecto del volumen excluido, demuestran que las características estructurales y/o mecanoelásticas del propio DNA determinan en gran medida la tendencia a la condensación ordenada que da lugar al espectro y. La condensación mediante ligandos catiónicos, histonas H1c y H1e, que neutralizan la carga de los fosfatos del DNA, confirma esta conclusión, pues la intensidad de los espectros y de los complejos de los diferentes DNA con estos ligandos es proporcional a la observada con PEG.En la condensación por neutralización la naturaleza del ligando también tiene un papel, que se manifiesta por la, en general, mayor intensidad del espectro y con la H1e que con la H1c, esta última con menor afinidad por el DNA. Las curvaturas estables, presentes en la SAR, ejercen un efecto desfavorable sobre la condensación. Este efecto desfavorable puede ser eliminado por la distamicina que "estira" el DNA. / The histone H1 is necessary for the condensation of the chromatin and it can be implied in the activation and in the inhibition of specific genes. The histone H1 is coded by a multigenic family. In mammalians there are six somatic subtypes, H1a-e, H1º, a specific variant of the male germinal line, H1t, and a variant characteristic of the oocytes, H1oo. We have estimated the relative affinities of the six somatic subtypes, H1a-e and H1º, by the SAR cluster of the histones genes of Drosophila and for a fragment of pUC19 of similar length, by means of a competition assay between two subtypes present in similar concentration for a limited amount of DNA. The order of the affinities for the SAR fragment was H1a (1,0)<H1c (3,9)<H1b (5,4)<H1e (14,4)<H1º (19,5)<H1d (20,0), where the number within the parenthesis is the relative affinity expressed in relation to the subtype of weaker union, the H1a. The order of the affinities for the pUC19 fragment was H1a (1,0)<H1c (5,3)<H1b (6,4)<H1e (16,5)<H1º (22,3)<H1d (25,5). The relative affinities of the subtypes for the SAR and the pUC19 are similar. It is possible to distinguish three groups of affinities: the H1a of low affinity, the H1b and the H1c of intermediate affinity and the H1d, H1e and H1º of high affinity. Experiments of displacement of a subtype bound to the DNA for another subtype added later on, confirm qualitatively the order of affinities obtained from the equilibrium experiments.Competition experiments among the SAR and the pUC19 fragments for a limited amount of one of the subtypes of the H1 show that all the somatic subtypes, H1a-e and H1º, are SAR-binding proteins. The affinities of each of the subtypes for the DNA are determined at the same time by the characteristics of each subtype and of the sequences of DNA involved in the interaction.The exchange between the H1 of the native chromatin and an exogenous subtype, in presence of SAR to maintain the stechiometry of the H1 in the chromatin, has allowed to estimate the relative affinities of the subtypes H1a-e and H1º for the chromatin. The order of the affinities expressed in relation to the H1a was H1a (1.0)<H1b (4.1)<H1c (6.2)<H1e (15.3)<H1º (16.6)<H1d (19.0). The relative affinities are similar to those obtained for the DNA. Concerning the DNA, it is possible to distinguish three groups of affinity: the H1a of low affinity, the H1b and the H1c of intermediate affinity and the H1d, H1e and H1º of high affinity. The experiments of condensation of SAR, pUC19 and pBR322 fragments with PEG that condenses the DNA by volume exclusion, show that the structural and/or the mechanical stretching properties of each DNA determine widely the tendency to the ordered condensation that gives place to the y spectrum. The condensation by means of cationic ligands like the histones H1c and H1e, that neutralize the negative charge of the phosphates in the DNA backbone, confirm this conclusion, because the intensity of the y spectra obtained for the complexes of the different DNA fragments and the histones is proportional to the one observed with PEG. In the condensation by charge neutralization, the intrinsic properties of the histone also play an important role, explaining the greater intensity of the y spectrum with the H1e than the one obtained with the H1c, this last protein with lower affinity for the DNA. The sequence-induced DNA curvature, present in the SAR fragment, partially inhibits the induction of the y spectrum. This unfavourable effect can be suppressed by the distamycin that enlarges the DNA.

La histona H1 es la responsable de la condensación de la cromatina en la fibra de 30 nm. Se ha descrito que la H1 tiene preferencia por el DNA tipo SAR. Hemos mostrado que los subtipos H1a-e, H1º y H1t individualmente muestran preferencia por las SAR. La H1 está compuesta por 3 dominios: N-terminal, globular y C-terminal. El análisis independiente de los dominios mostró que el C-terminal determina la preferencia por las SAR de la H1. Las protaminas, relacionadas evolutivamente con la histona H1 y muy ricas en arginina también tienen preferencia por las SAR. La unión preferencial a las SAR del C-terminal y la protamina se pierde en presencia de distamicina, lo que indica que la interacción involucra el surco menor del DNA. La preferencia por las SAR está determinada por los bloques AT homopoliméricos. El dominio C-terminal de las histonas H1º (C-H1º) y H1t (C-H1t) se encuentra desestructurado en disolución acuosa, pero en presencia de DNA y 140 mM de NaCl se estructura completamente. La estructura secundaria obtenida está caracterizada por la presencia de hélice &#945;, estructura &#946;, giros y lazos abiertos. El TFE también induce estructura secundaria en los dominios C-terminales con características similares a las encontradas en los complejos con DNA. La estructura de los dominios C-terminales unidos al DNA es extremadamente estable. La desnaturalización de los dominios C-terminales unidos a DNA es cooperativa. El acoplamiento entre la unión al DNA y la inducción de estructura secundaria en el C-terminal permite incluir este dominio en el grupo de las proteínas intrínsecamente desordenadas que funcionan mediante el reconocimiento molecular.Las elevadas concentraciones de solutos macromoleculares en el interior de la célula hacen que una fracción importante del volumen intracelular no esté disponible. Los dominios C-H1º y C-H1t se estructuran en presencia de Ficoll 70 (30%) y el PEG 6000 (30%) por efectos del volumen excluido. La estructura secundaria inducida es similar a la encontrada en el C-terminal unido a DNA. Los resultados de SAXS indican que la compactación del C-terminal en presencia de aglomerantes macromoleculares es propia de un estado globular. La compactación va acompañada de la aparición de un núcleo hidrófobico. Sin embargo, el dominio C-terminal no está estructurado cooperativamente en presencia de agentes aglomerantes. Estas características indican que el C-terminal en presencia de agentes aglomerantes se encuentra en un estado de glóbulo fundido. La formación del glóbulo fundido en la célula aceleraría el paso al estado nativo o unido al DNA y facilitaría la difusión y el intercambio de la H1 en la cromatina.La histona H1 es fosforilada por las quinasas dependientes de ciclinas (CDKs). Esta fosforilación es dependiente del ciclo celular con el máximo de fosfatos en la metafase de la mitosis. La mayoría de las dianas de las CDKs se encuentran en el dominio C-terminal. La fosforilación de los tres motivos TPXK del C-H1º induce un cambio estructural caracterizado por la disminución de la proporción de hélice &#945; y un aumento de la estructura &#946;. La magnitud del cambio depende de la relación proteína/DNA. A relaciones cercanas a la saturación la conformación de la proteína es del tipo todo-&#946;. La fosforilación de uno o dos de los tres sitios TPXK presentes en el C-H1º tiene efectos estructurales específicos. La fosforilación en T118 es la que afecta más profundamente la estructura con una disminución importante de la hélice &#945;, acompañada de la aparición de un porcentaje significativo de ovillo estadístico. La neutralización de la carga positiva de las lisinas por los grupos fosfato del DNA puede ser una de las causas principales de la estructuración del dominio C-terminal en los complejos con el DNA. A pH alcalino se induce estructuración en el C-H1º no fosforilado y trifosforilado, la cual refleja los cambios dependientes de fosforilación encontrados en los complejos con DNA. / H1 linker histones are thought to be primarily responsible for the condensation of the 30 nm chromatin fibre. Histone H1 preferentially binds to scaffold-associated regions (SARs). Here we show that the mammalian somatic subtypes H1a,b,c,d,e and H1_ and themale germline-specific subtype H1t, all preferentially bind to SARs. Experiments with the isolated domains show that whilst the C-terminal domain maintains strong and preferential binding, the N-terminal and globular domains show weak binding and poor specificity for the SAR. The preferential binding of SAR by the H1 molecule thus appears to be determined by its highly basic C-terminal domain. Salmine, a typical fish protamine, which could have its evolutionary origin in histone H1, also shows preferential binding to the SAR. The interaction of distamycin, a minor groove binder with high affinity for homopolymeric oligo(dA).oligo(dT) tracts, abolishes preferential binding of the C-terminal domain of histone H1 and protamine to the SAR, suggesting the involvement of the DNA minor groove in the interaction.The carboxyl-terminal domain of linker histone H1 subtypes H1º (C-H1º) and H1t (C-H1t) has little structure in aqueous solution but becomes extensively folded upon interaction with DNA. The secondary structure elements present in the bound carboxylterminal domain include &#945;-helix, &#946;-structure, turns, and open loops. The addition of TFE also induces secondary structure in the C-terminal domain that is very similar to the structure of the DNA bound. Examination of the changes in the amide I components in the 20-80 °C temperature interval showed that the secondary structure of the DNA-bound C-H1t is for the most part extremely stable. The H1 carboxyl-terminal domain appears to belong to the so-called disordered proteins, undergoing coupled binding and folding.In the cellular environment macromolecules and small molecule solutes are present at high concentrations so that a significant fraction of the intracellular space is not available to other macromolecules.The C-terminal domains C-H1º and C-H1t are significantly structured in the presence of Ficoll 70 (30%) and PEG (30%) The proportions of secondary structure motifs were comparable to those of the DNA-bound domain. The small-angle X-ray scattering showed that in crowding agents the C-terminus had the compaction of a globular state. Progressive dissipation of the secondary structure and a lineal increase in partial heat capacity (Cp) with temperature together with increased binding of ANS indicated that the C-terminus is not cooperatively folded in crowded conditions. These results indicate that the C-terminus in crowding agents is in a molten globule state. Folding of the C-terminus in crowded conditions may increase the rate of the transition toward the DNA bound state and facilitate H1 diffusion inside cell nuclei.Histone H1 is phosphorylated in a cell cycle-dependent manner by cyclin-dependent kinases (CDKs). The highest number of phosphorylated sites is found in mitosis. The majority of the phosphorylation sites for CDKs are located on the C-terminal domain. Complete phosphorylation of C-H1º is associated to a major structural change. This structural rearrengement implies the loss of almost all the &#945;-helix and a large increase in &#946;-structure. The extent of the conformational change appears to be dependent on triphosphorylation and the protein/DNA ratio. The final state of the structural change consists in an all-&#946; protein at ratios near saturation. Phosphorylation of one or two site have distintic structural effects. Phosphorylation of T118 affects the secondary structure the most, with a decrease of the &#945;-helix and the appearence of random coil.Charge neutralization provided by DNA phosphate groups is an important factor in the folding of the C-terminal domain of histone H1 when bound to DNA. Alkaline pH induces secondary structure in C-H1º unphosphorylated and triphosphorylated that reflects the structural changes associated to phosphorylation.

Els diferents subtipus de la histona H1 tenen un paper molt important en la condensació de la cromatina i en la regulació gènica. En mamífers s’han identificat sis subtipus somàtics, H1a-e, dos subtipus específics de línies germinals, H1t i H1oo i dos subtipus associats a diferenciació H10 i H1x. L’H1 està formada per tres dominis, un domini globular flanquejat per un domini amino-terminal i un domini carboxi-terminal. Es va caracteritzar l’efecte de la fosforilació sobre la interacció amb el DNA del domini C-terminal de l’H10. El domini fosforilat continua mantenint la preferència d’unió per les seqüències SAR i la cooperativitat d’unió a DNA. Es va analitzar per dicroisme circular el domini i les seves espècies fosforilades amb diferents fragments de DNA. Les espècies fosforilades són capaces d’induir un espectre ψ més intens que el domini no fosforilat, mostrant una major capacitat d’agregació ordenada del DNA. Experiments de competició varen determinar que l’afinitat relativa pel DNA en fosforilar-se el domini disminueix aproximadament en un factor de 3. Es va estudiar l’estructura secundària del domini C-terminal de l’ H1e i de l’H1e sencera per espectroscòpia d’infraroig de transformada de Fourier (FTIR). La fosforilació de l’H1e provoca un canvi estructural en la proteïna: la disminució d’hèlix α i l’augment de fulla β. El grau d’estructuració secundària depèn de la posició i del nombre de fosfats. La fosforilació de la histona H1e té efectes diferencials sobre les afinitats relatives pel DNA i la capacitat d’agregació del DNA de les seves espècies fosforilades. Les espècies amb més grau de fosforilació mostren una menor afinitat pel DNA però també una major capacitat d’agregació d’aquest. A la vegada, aquestes mateixes espècies són les que contenen més estructuració en forma de fulla β, fet que afavoriria la formació d’agregats DNA-proteïna. / Linker histone H1 plays an important role in chromatin folding and genic regulation. In mammals has been identified 6 somatic subtypes, H1a-e, 2 germline-specific subtypes, H1t i H1oo and 2 subtypes related to diferenciation, H10 i H1x. H1 linker histones present a tripartite structure consisting of a central globular domain flanked by N- and C-terminal tail-like domains. We characterize the effect of phosphorylation of C-terminal domain of H10 upon the interaction with DNA. The phosphorilated domain maintains the preferential binding to SAR sequences and the cooperative binding to DNA. We analyze by circular dicroism the domain and its phosphorilated species with different DNA fragments. The phosphorilated species induces an intense ψ spectrum than the non-phosphorilated domain, showing a higher organized aggregation capacity of the DNA. Competition experiments determined that relative affinity for DNA when the domain is phosphorilated decrease approximately 3-fold. We studied the effects of phosphorylation on the secondary structure of H1e and its carboxy-terminal domain by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). Phosphorilation of H1e leads to a structural change in the protein: a decrease of α-helix and an increase of β-sheet. The secondary structuration grade depends both of position and number of phosphate groups. Histone H1e phosphorylation has different effects in its phosphorilated species upon relativity affinities for DNA and aggregation capacity of DNA. The species with more grade of phosphorilation shows less affinity for DNA but more aggregation capacity of DNA. Furthermore, these same species are which contains a more β-sheet structure, favoring the formation of DNA-protein aggregates.

Les histones linker juguen un paper important en l’organització i manteniment de la cromatina en estructures d'ordre superior i en la regulació transcripcional. La histona H1 en vertebrats té una estructura característica en tres dominis: un domini N-terminal curt i flexible; un domini globular central; i un domini C-terminal llarg. Els dominis N- i C-terminals (CTD) són molt bàsics i es troben desestructurats en solució aquosa. La distribució de càrrega és bastant uniforme al llarg de tot el CTD. La interacció amb el DNA indueix un plegament total i estable del CTD en condicions fisiològiques, fet que permet classificar aquest domini en el grup de les proteïnes intrínsecament desordenades, on el plegament i la unió al lligand estan acoblades. La fosforilació post-traduccional del CTD de la H1 té efectes en l’estructura secundària de la proteïna i en la condensació del DNA. L’estructura secundària de la H10 sencera es va analitzar per espectroscòpia d’infrarroig. La H10, igual que el CTD aïllat, també es plegà degut a la interacció amb el DNA i l’estructura secundària també va ser modulada per fosforilació. El canvi estructural induït per la fosforilació va consistir en un increment de la quantitat d’estructura β, que va esdevenir més significant amb la unió a DNA, on també es va observar una dependència d’aquest increment amb la relació proteïna/DNA. En aquest cas, la proporció d’estructura β va arribar al 54%, suggerint que el CTD en la proteïna sencera presentava una conformació tot-β. Simultàniament, es va observar una reducció significant de l’estructura en hèlix-α, fet que va suggerir una disminució d’aquest element estructural en el domini globular, probablement per la propagació de l’estructura β des del CTD cap a la resta de la proteïna. En presència de SDS, la H10 es va plegar amb percentatges d’estructura secundària similars als observats en la unió al DNA. A una relació molar SDS/proteïna 14:1, la H10 trifosforilada presentava un 55% d’estructura β, indicant que el CTD en la histona H10 també es trobava en una conformació tot-β i formava fibres amiloides. Els nuclis d’eritròcit de pollastre contenen cromatina inerta i altament compacta consistent, principalment, en DNA i proteïnes histona. En aquest estudi, es va emprar aquesta cromatina per analitzar les modificacions post-traduccionals de les histones i l’efecte de la fosforilació per CDK2 en l’agregació de la cromatina. Els nuclis es van digerir amb nucleasa micrococcal i la cromatina es va fraccionar per centrifugació en tampó de baixa força iònica en fraccions soluble i insoluble. Les modificacions post-traduccionals (PTMs) de les histones linker purificades d’ambdues fraccions es van analitzar per Tandem MS. Els sis subtipus d’histona H1 i la histona H5 van ser identificats. En aquest estudi, es van trobar vuit PTMs novells: dues a la histona H5 i sis en els subtipus d’ H1. Algunes de les modificacions van ser identificades específicament en una de les fraccions, suggerint una distribució diferencial d’algunes PTMs en la cromatina. La comparació de les PTMs novells identificades amb altres prèviament descrites en altres espècies va demostrar que la majoria d’elles estan conservades en l’evolució. Atès que les histones linker desenvolupen la seva funció en la cromatina, es va fosforilar ex vivo amb CDK2 els motius S/T-P-X-Z de les histones linker presents en la cromatina d’eritròcit de pollastre; amb l’objectiu d’estudiar l’efecte de la fosforilació en l’agregació de la cromatina. L’anàlisi proteòmic per HPCE i MALDTOF-MS va mostrar que el nombre de grups fosfat va augmentar amb el temps de fosforilació, assolint un 54% d’espècies fosforilades (mono- i di-fosforilades) en el cas de la H5 després de la fosforilació overnight. Experiments de Tandem MS van revelar que, en cap de les histones purificades de la cromatina nativa, cap dels motius S/T-P-X-Z estava fosforilat, indicant que la fosforilació detectada en les mostres tractades amb CDK2 havien estat modificats ex vivo. En H5, nomes S148 va identificar-se en totes les mostres i es trobava fosforilat després d’1 hora. En l’anàlisi per TandemMS de les H1, tots els motius consens de CDK2, excepte S171 (posició en H1.01), es van identificar en els subtipus H1.03, H1.1L i H1.1R. H1.03T16 es va trobar fosforilat després de 15 minuts; H1.1LS192 I H1.1RS186 després d’1 hora; H1.03S155, H1.1LS155 i H1.1RS153 després de 3 hores. Un cop la fosforilació ex vivo de les histones en la cromatina es va comprovar, es va procedir a estudiar l’efecte de la fosforilació en l’agregació de la cromatina induïda per MgCl2 (1.6mM) per Dynamic Light Scattering (DLS). El resultat més significant associat a la fosforilació va ser la disminució del diàmetre hidrodinàmic de les molècules agregades. Aquestes diferències van esdevenir més important amb l’augment del temps de fosforilació i amb la mida dels fragments de cromatina. Els resultats obtinguts van demostrar que la fosforilació de les histones linker impedia l’agregació de la cromatina. / Linker histones play an important role in establishing and maintaining chromatin higher-order structure and in transcriptional regulation. Histone H1 in vertebrates has a characteristic three-domain structure consisting of a short flexible N-terminal domain, a central globular domain and a long C-terminal domain. The amino- and carboxyl-terminal (CTD) domains are highly basic and mainly unstructured in aqueous solution. The charge distribution is quite uniform along the CTD. Because of that, chromatin condensation is mediated through charge-neutralization of the negatively charged linker DNA, facilitating chromatin condensation into the 30nm fibre and also intermolecular aggregation. Interaction with DNA induces the complete folding of the CTD under physiological conditions in a very stable manner, which allows to classify this domain as an intrinsically disordered protein, with coupled binding and folding. Post-translational phosphorylation of the CTD of H1 has effects on secondary structure and DNA condensation. Secondary structure of the entire H10 was analysed by infrared spectroscopy. H10, as the isolated CTD, also folded upon DNA interaction and the secondary structure was modulated by phosphorylation. The structural change following phosphorylation was characterized by an increase in the amount of β‐structure that was more significant when bound to DNA and was dependant on the protein/DNA ratio. The proportion of β‐structure reached 54 % suggesting that the CTD was in an all‐β conformation in the entire protein. Concomitant with the increase in β‐structure, there was a remarkable decrease of α‐helix that suggested the loss of some of the α‐helix in the globular domain; probably associated to the propagation of the β‐structure from the CTD towards the rest of the protein. In the presence of SDS, H10 folded with percentages of secondary structure motifs similar to those found when bound to DNA. At a molar ratio 14:1 (SDS/protein) the triphosphorylated protein had 55% of β‐structure indicating that the CTD within histone H10 was also in an all‐β conformation and formed amyloid fibres. Mature chicken erythrocyte nuclei contain highly condensed and inert chromatin, mainly consisting of DNA and histone proteins. Chicken erythrocyte chromatin was used to analyse linker histones post-translational modifications and the effect of phosphorylation by CDK2 on chromatin aggregation. The nuclei were digested with micrococcal nuclease and fractionated by centrifugation in low-salt buffer into soluble and insoluble fractions. Post-translational modifications (PTMs) of the purified linker histones of both fractions were analyzed by Tandem MS. All six histone H1 subtypes (H1.01, H1.02, H1.03, H1.10, H1.1L and H1.1R) and histone H5 were identified. In our study, we identified eight novel post-translational modifications: two were identified in histone H5 and six in histone H1 subtypes. Some of the identified modifications were specific of one chromatin fraction suggesting the differential distribution of some PTMs within chromatin. Comparison of the PTMs found with other previously reported for other species showed that most of them are conserved through evolution. Since histone H1 develops its function within chromatin; chicken erythrocyte chromatin was phosphorylated ex vivo with CDK2 in the S/T-P-X-Z motifs present in linker histones in order to study the effects of ex vivo phosphorylation of linker histones on chromatin aggregation. Proteomic analyses by HPCE and MALDITOF-MS showed that the the number of phosphate groups increased with the time of phosphorylation, reaching, in the case of H5, 54% of phosphorylated species (mono and diphosphorylated) after overnight phosphorylation. Tandem MS after proteolytic digestion revealed that in all linker histones the S/T-PX-Z motifs were unphosphorylated in native chromatin indicating that the phosphorylated peptides found at other times of reaction were modified ex vivo. In H5, only S148 was identified in all samples and was phosphorylated after 1 hour. In the Tandem MS analysis of histone H1 subtypes, all the CDK2 consensus sequences, except S171(H1.1R numbering) were identified for H1.03, H1.1L and H1.1R. H1.03T16 was found phosphorylated after 15 minutes; H1.1LS192 and H1.1RS186 after 1 hour; H1.03S155, H1.1LS155 and H1.1RS153 after3 hours. Once ex vivo phosphorylation of linker histones within chromatin was confirmed, the effect of linker histones ex vivo phosphorylation on chromatin aggregation induced by MgCl2 (1.6 mM) was analysed by Dynamic Light Scattering (DLS). The most remarkable result associated to ex vivo phosphorylation of linker histones within chromatin was a decrease in the hydrodynamic diameter of the aggregated molecules. The differences became greater with the increase of phosphorylation time and with the size of the chromatin fragments. These results indicated that linker histones phosphorylation impaired chromatin aggregation.

Este proyecto de tesis se ha focalizado en determinar con precisión, en células de Saccharomyces cerevisiae, la diferencia de enlace del ADN estabilizada por nucleosomas canónicos in vivo, así como la contribución topológica del centrómero y de diferentes promotores génicos sensibles a topoisomerasa II. Para ello, tanto la secuencia TRP1ARS1 como derivados de esta, se han introducido en diferentes cepas de S. cerevisiae: JCW25 (TOP1 TOP2 TOP3), JCW26 (TOP1 top2ts TOP3) y JCW27 (Δtop1 TOP2 TOP3), se han extraído en forma de cromatina y se han analizado mediante técnicas electroforéticas para determinar su topología in vivo. Gracias al pequeño tamaño de estos anillos de ADN (nunca superior a 2kb), las distribuciones de topoisomeros generadas han permitido identificar cualquier modificación en la estructura de la cromatina. Topología región TRP1ARS1: La secuencia de 1453 pb de la región TRP1ARS1 (TA1) se ha ciclado y usado para la transformación de las diferentes cepas de S. cerevisiae. Un análisis topológico de los nucleosomas ensamblados en esta región ha determinado una diferencia de enlace (ΔLk), respecto al anillo relajado, de -9.6 unidades. Este valor indica una estabilización de -1.37 unidades por nucleosoma, contrastando con el valor generalmente aceptado de -1 unidad por nucleosoma conocido como “linking number paradox”. Centrómero: El centrómero puntual de S. cerevisiae se caracteriza por: una secuencia de entre 111 y 120bp con tres elementos diferenciados (CDEI, CDEII y CDEIII) y por un hemisoma (H2A+H2B+cenH3+H4) con la histona H3 modificada (CenH3). Sobre las secuencias CDEI y CDEIII se unen dos complejos proteicos, Cbf1 y CBF3 respectivamente, capaces de doblar el ADN in vitro. Durante esta tesis se ha estudiado la topología del centrómero del cromosoma 4 de S. cerevisiae (CEN4), clonado en el anillo TA1, observando que produce una ganancia de +0.6 unidades de ΔLk. Este valor se ha establecido al comparar la topología del anillo TA1+CEN4 con la observada en anillos donde CEN4 ha sido mutado en CDEIII, impidiendo la unión de CBF3 y como consecuencia anulando su función, o sustituido por la secuencia High2 que estabiliza de forma muy eficiente un nucleosoma. El análisis topológico de anillos CEN4 de diferente tamaño y de anillos con la secuencia centromérica invertida, en cepas deficientes en topoisomerasa I y II, han ratificado que la estabilización de ΔLk =+0.6 es una propiedad robusta e intrínseca del complejo centromérico. Además, del estudio comparativo de los centrómeros CEN2, CEN4, CEN7 y CEN12 se ha descartado que la estabilización de +0.6 unidades dependa de la fase rotacional de CDEI y CDEIII y por tanto, se deba a una interacción entre ambos complejos proteicos. A partir de todos estos datos, se puede concluir que la estabilización de ΔLk = +0.6 estaría determinada por un enrollamiento dextrógiro del ADN en el hemisoma formado en CDEII o bien, por la combinación de distintos planos de curvatura del ADN en los segmentos CEI, CDEII y CDEIII. Promotores: Aprovechando la metodología usada para el análisis topológico del centrómero y del anillo TA1, se ha comenzado el estudio de la estructura de promotores de genes sensibles a topoisomerasa II. Se ha observado que la estructura de la cromatina de estos promotores no estabiliza el mismo número de enlace que segmentos de cromatina del mismo tamaño formados por nucleosomas típicos (cromatina control). Además,.la ianctivación de la topoisoemrasa II produce en estos promotores cambios topológicos distintos a los de la croamtina control lo que sugiere la posible presencia de mecanismos de regulación de la transcripción mediados por la topoisomerasa. / This thesis has focused on the accurate measure, in Saccharomyces cerevisiae cells, of the DNA linking number stabilized by canonical nucleosomes in vivo, as well as the centromere and several promoter regions topological contributions. To that end, TRP1ARS1 sequences, as well as its derivatives, were introduced in different S. cerevisiae strains: JCW25 (TOP1 TOP2 TOP3), JCW26 (TOP1 top2ts TOP3) y JCW27 (Δtop1 TOP2 TOP3), extracted as chromatin and analyzed by electrophoretic techniques in order to determine its in vivo topology. Thanks to the little size of these DNA ring (never bigger than 2kb), the distributions of the topoisomers have allowed to identified any modification of the chromatin structure Topology of TRP1ARS1: The TRP1ARS1 (TA1)1453 bp sequence has been cycled and used to electroporate different S. cerevisiae strains. The topological analysis of the nucleosomes located in this region has resulted in a Linking number difference (ΔLk) of -9.6 units. This value points to the stabilization of -1.37 per nucleosome, contrasting with the assumed value of -1 unit per nucleosome, known as the “linking number paradox” Centromere: S. cerevisiae centromere is characterized by 11-120 bp sequence, with three differentiated elements (CDEI, CDEII y CDEIII), as well as a hemisome (H2A+H2B+cenH3+H4) harboring the variant H3 histone CenH3. Over CDEI and CDEII sequences two protein complexes are bound, Cbf1 and CBF3 respectively, which are able to bend the DNA in vitro. Along this thesis, the topology of centromere of chromosome IV (CEN4) of S. cerevisiae, cloned in TA1 ring, has been studied resulting in a gain of +0.6 units of ΔLk. This value has been established when comparing the topology of TA1+CEN4 with the observed in DNA rings where CDEIII of CEN4 has been mutated, preventing CBF3 bound and as a consequence, abolishing centromere function, or where CEN4 has been substituted by High2 sequence which establishes a well-positioned nucleosome. The topological analysis of CEN4 rings of different size, in different strains of S. cerevisiae with altered topoisomerase activity, have confirmed that the stabilization of ΔLk =+0.6 is a strong and intrinsic characteristic of the centromeric complex. Besides this, the comparative study of CEN2, CEN4, CEN7 and CEN12 centromeres has discarded the stabilization of +0.6 units depending on the rotational phase of CDEI and CDEIII so, it is not due to an interaction between both protein complexes. From these data, it can be concluded that the stabilization of ΔLk = +0.6 would be determined by a right-handed loop around the hemisome formed over CDEII or, by the mixed of different DNA curvature planes in the regions of CDEI, CDEII y CDEIII. Promoters: Taking the advantage of the methodology used in the topological analysisi of the centromere, a study of promoters structure which are located in genes affected by topoisomerase II activity has just been started. It has been observed a difference between the linking number established by these promoters and a non-promoter fragment of chromatin used as a control. Furthermore, the inactivation of Topo II causes in these promoters topological changes that differ from the chromatin used as a control which suggests a trasncription regulation mechanism by Topo II.

A la present tesi es proporciona una descripció del mecanisme i la cinètica d'algunes reaccions d'interès troposfèric. En aquests temps on les emissions antropogèniques a l'atmosfera estan creixent a un ritme imparable, es fa necessària una revisió de l'impacte que les activitats humanes tenen sobre el nostre medi. Per a entendre i prevenir els fenòmens atmosfèrics, es creen models on s'inclouen el màxim de variables. Els estudis teòrics com els que es presenten a aquesta tesi, proporcionen informació sobre els mecanismes de reacció, i sobre dades cinètiques, com per exemple les constants de velocitat, que posteriorment poden ajudar al plantejament dels models predictius.Un aspecte comú a totes les reaccions estudiades és el fet de que corresponen a processos d'oxidació de compostos orgànics volàtils (VOCs) pel radical OH. En concret, s'ha treballat amb alquens (etè, propè, isobutè i cloretè) i compostos parcialment oxigenats (glicolaldehid, metil vinil cetona i metacroleïna). Els principals objectius perseguits al treball de tesi són els següents:1. Explicar, mitjançant la teoria de l'estat de transició convencional, l'aparició d'energies d'activació negatives en el cas de les reaccions entre diversos alquens i el radical OH, així com determinar la regioselectivitat per als alquens substituïts.2. Proporcionar, en el cas del sistema glicolaldehid + OH, la constant de velocitat a diferents temperatures per a una reacció multiwell i multichannel mitjançant la teoria de l'estat de transició canònica variacional, amb túnel multidimensional quan ha estat necessari.3. Facilitar una descripció teòrica del comportament amb la pressió i la temperatura de les constants de velocitat dels sistemes metil vinil cetona + OH i metacroleïna + OH, mitjançant la teoria de l'estat de transició microcanònica convencional i la resolució de l'equació master.4. Obtenir les entalpies de formació teòriques i les energies de dissociació d'enllaç per a la metil vinil cetona i la metacroleïna, així com per als seus productes d'oxidació, per tal de proporcionar informació sobre la força dels diferents enllaços que es formen o es trenquen en l'oxidació pel radical OH. / In the current thesis it is provided a description of the mechanism and the kinetics of some reactions of tropospheric interest. In these times where the anthropogenic emissions to the atmosphere are growing to an unstoppable pace, makes necessary a review of the impact that the human activities have on our environment. To deal and to anticipate the atmospheric phenomena, models are created where the maximum of variables is included. The theoretical studies like that appearing in this thesis, provide information about the mechanisms of reaction, and about kinetics information, as for example the rate constants, which later can help to the description of the predictive models.A common aspect to all the studied reactions is the fact that they correspond to processes of oxidation of volatile organic compounds (VOCs) by the OH radical. Specifically, it has been worked with alkenes (ethene, propene, isobutene and chloroethene) and partially oxygenated compounds (glycolaldehyde, methyl vinyl ketone and methacrolein). The principal aims chased in this work of thesis are the following ones:1. To explain, by using the conventional transition state theory, the appearance of negative energies of activation in the case of the reactions between diverse alkenes and the radical OH, as well as to determine the regioselectivity for the replaced alkenes.2. To provide, in the case of the system glycolaldehyde + OH, the rate constant at different temperatures for a multiwell and multichannel reaction by means of the canonical variacional transition state theory, with multidimensional tunneling when it has been necessary.3. To offer a theoretical description of the behavior with the pressure and the temperature of the rate constants of the systems methyl vinyl ketone + OH and metacrolein + OH, by using the microcanonical conventional transition state theory and the resolution of the master equation.4. To obtain the theoretical enthalpies of formation and the bond dissociation energies for the methyl vinyl ketone and the metacrolein, as well as for their products of oxidation, in order to provide information about the force of the different bonds that are formed or broken in the oxidation by the OH radical.

Los peces planos comprenden un grupo de especies de gran interés biológico y comercial. En respuesta al descenso de la pesca y al ritmo de capturas, en los últimos años han surgido diversas iniciativas dirigidas a la acuicultura de estas especies. Este proyecto de tesis doctoral se ha centrado en el lenguado del Senegal (S. senegalensis), una especie de alto valor añadido y un candidato con mucho potencial para la acuicultura. Quedan aún muchas incógnitas acerca de su reproducción, que deberán ser respondidas para optimizar su cultivoUno de los problemas detectados en el cultivo de S. senegalensis es la poca efectividad para inducir la reproducción de los machos, y en especial para conseguir un esperma de buena calidadEste proyecto de tesis se propone investigar los mecanismos fisiológicos implicados en la espermatogénesis y la producción de esperma de S. senegalensis mediante el análisis del proteoma del testículo de individuos salvajes y en cultivo bajo diferentes condiciones y la caracterización de proteínas potenciales implicadas en este proceso.Inicialmente se han estudiado el proteoma de S. senegalensis mediante secuenciación peptídico por espectrometría de masas. Posteriormente se ha analizado el proteoma de testículos de individuos salvajes en diferentes estadios de espermatogénesis mediante electroforesis bidimensional y espectrometría de masas. Resuelto este apartado, se abordaron los estudios comparativos del proteoma de individuos criados en cautividad con y sin tratamientos hormonales. Los estudios proteómicos se complementaron con análisis de nivel de expresión mRNA con microarrays. Finalmente, la información obtenida a durante el proyecto referente a la expresión de proteínas, la expresión de mRNA y la histología se ha integrado en una plataforma informática visual diseñada especialmente para S. senegalensis. / The flatfishes represent a group of species with a high biological and economical interest. Due to the decrease in fish hatchings, in the last years different several projects related to the aquaculture of these species were proposed. The project of this doctoral thesis has focused on the Senegal sole (Solea senegalensis), a flatfish specie with a great commercial interest and a candidate with high potential for aquaculture. However, lots of questions about its reproduction haven't been so far properly addressed, and they should be approached in order to optimize the culture of the Senegal sole. The main problems detected for this specie in captivity are the low spermiation volume and the impaired quality of spermatozoa motility males.This thesis aims to investigate the molecular mechanisms involved in the spermatogenesis and sperm production of S. senegalensis through the analysis of the testis proteome of wild and cultured animals under several conditions, in order to unveil the candidate proteins related to these processes.Initially, the proteome of S. senegalensis has been approached by de novo peptide sequencing based on mass spectrometry. Afterwards, the testis proteome from wild and cultured individuals in several spermatogenic stages was compared using two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. Once this point was performed, a comparative study of testis proteome from individuals cultured with and without hormonal treatment was approached. Both proteomic studies were complemented with mRNA expression analysis using microarrays.Finally, the information related to protein expression obtained during the different parts of the project, the mRNA expression and the histological analysis were integrated in a bioinformatic visual atlas specifically designed for S. senegalensis.

La conjugación bacteriana es uno de los mecanismos de transferencia horizontal genética más importante y la causa principal de la rápida adquisición de resistencia a los antibióticos en las bacterias. La capacidad de las bacterias para conjugarse fue descubierta en 1946 en cultivos de E. coli y, años más tarde, en bacterias Gram-positivas. El proceso de conjugación comienza con el corte de un enlace fosfo-diester específico por medio de una relaxasa que juega un papel clave en la iniciación de dicha transferencia.En el plásmido R388 de E. coli, TrwC es la transferasa que cataliza la etapa inicial y final de la transferencia conjugativa del ADN. La estructura cristalina del dominio N-terminal de la relaxasa TrwC en complejo con un oligonucleótico de 27 bases que contiene la horquilla de reconocimiento y el enlace fosfo-diester a cortar ha sido determinada por difracción de rayos X. Asimismo, se han resuelto las estructuras de una serie de complejos ternarios proteína-ADN-metal con diferentes cationes divalentes ocupando el sitio activo. Un análisis sistemático, mediante difracción anómala, permitió determinar sin ambigüedad la naturaleza del metal localizado en el sitio activo, encontrándose que Zn2+, Ni2+ y Cu2+ se unían a la tríada de histidinas. La comparación de las estructuras de los diferentes complejos sugiere la existencia de dos caminos que permiten la salida de la cadena de ADN del centro activo y que probablemente son utilizados en diferentes etapas de la reacción de proceso de conjugación. La información estructural permitió proponer (i) un mecanismo enzimático en el que el ión metálico polariza el enlace fosfo-diester a cortar facilitando el ataque por parte de la tirosina catalítica, y (ii) la serie de eventos que ocurren durante el procesamiento del ADN a transferir y que explican la función biológica de la relaxasa.Asimismo se ha estudiado y caracterizado por difracción de rayos X el dominio N-terminal de la relaxasa MobM del plásmido pMV158 de Streptococcus agalactiae en complejo con un oligonucleótido de 26 bases que mimetiza la secuencia del oriT justo hasta el sitio de corte (nic). El plegamiento global de la proteína muestra un núcleo central formado por cinco hebras betas anti-paralelas flanqueadas por dos pares de hélices alfa. Este plegamiento es estructuralmente homólogo al observado en la relaxasas de bacterias Gram-negativas, pese a la baja homología de secuencia existente entre dichas proteínas. La cadena de ADN se une a MobM mediante numerosas interacciones electrostáticas alojándose a lo largo de la amplia cavidad que la superficie de la proteína presenta. Los contactos intermoleculares se agrupan en cuatro regiones; los dos más importantes involucran dos giros betas consecutivos de la cadena proteica que penetra en el surco menor del ADN y un largo lazo flexible que rodea el extremo de simple cadena del ADN. / Bacterial conjugation is one of the most important horizontal gene transfer mechanisms and the main cause of the rapidly spread of the antibiotic resistance in bacteria. The ability of bacteria to conjugate was discovered in 1946 in E. coli cultures and years later in Gram-positive bacteria. The conjugative process begins with the cleavage of a specific phosphodiester bond through a relaxase protein, playing a key role in the initiation of the transfer.TrwC is the DNA strand transferase that catalyzes the initial and final stages of conjugative DNA transfer in the plasmid R388 from E. coli. We have solved the crystal structure of the N-terminal relaxase domain of TrwC in complex with a 27 base-long DNA oligonucleotide that contains both the recognition hairpin and the scissile phosphate. In addition, a series of ternary structures of protein-DNA complexes with different divalent cations at the active site have been solved. Systematic anomalous difference analysis allowed us to determine unambiguously the nature of the metal bound. Zn2+, Ni2+ and Cu2+ were found to bind the histidine-triad metal binding site. Comparison of the structures of the different complexes suggests two pathways for the DNA to exit the active pocket. They are probably used at different steps of the conjugative DNA-processing reaction. The structural information allows us to propose (i) an enzyme mechanism where the scissile phosphate is polarized by the metal ion facilitating the nucleophilic attack of the catalytic tyrosine, and (ii) a probable sequence of events during conjugative DNA processing that explains the biological function of the relaxase.We also investigated the N-terminal relaxase domain of the protein MobM from plasmid pMV158 from Streptococcus agalactiae, and herein we report the X-ray crystal structure of the complex between this domain and a 26-mer oligonucleotide that mimics the oriT sequence just upstream the nic site. The overall fold of the protein shows a core domain comprising five anti-parallel beta-strands flanked by pairs of alfa-helices. This fold resembles that of Gram-negative relaxases in spite of the very low sequence homology. The DNA molecule binds to MobM through a number of electrostatic interactions following a large crevice over the surface of the protein. Intermolecular contacts are clustered in four main regions; the two most important ones involve a bulge formed by two consecutive beta-turns, and a long unstructured loop that wraps around the single stranded DNA part.

Carnitine palmitoyl transferase 1 (CPT1) enzymes catalyze the conversion of long-chain acyl-CoA to acyl-carnitines, thus facilitating the entry of long-chain fatty acids to the mitochondria, where they undergo β-oxidation. There are three isoforms: the liver isoform CPT1A (Esser, V. 1993), the muscle isoform CPT1B (Yamazaki, N. 1995) and the brain-specific isoform CPT1C (Price, N. 2002). CPT1A and CPT1B are localized in the outer mitochondrial membrane and are rate-limiting enzymes in fatty-acid β-oxidation. The CPT1C isoform, was first described in 2002, is expressed exclusively in the central nervous system, with a homogeneous distribution in all areas such as hippocampus, cortex, hypothalamus, cerebellum and others. CPT1C enzyme highly differs from the two other isozymes. Its C-terminal region is longer than that of the other CPTs (Price, N. 2002). It is located in the endoplasmic reticulum (ER) of cells, rather than in mitochondria, and so it does not facilitate fatty acid oxidation (Sierra, A.Y. 2008). Analysis of amino sequence of CPT1C reveals that all important residues for CPT1 activity are conserved in CPT1C enzyme, despite this, no catalytic activity was found (Price, N. 2002; Wolfgang, M.J. 2006), but it binds the CPT1 physiological inhibitor malonyl-CoA with the same affinity as CPT1A (Wolfgang, M.J. 2006). Finally, CPT1C is only present in mammals and appears to stem from a relatively recent CPT1A gene duplication (Price, N. 2002). The other isozymes are expressed in such organisms as fish, reptiles, amphibians or insects. This suggests a specific role for CPT1C in more evolved brains. At the physiological level, CPT1C contributes to the control of food intake and energy homeostasis (Wolfgang, M.J. 2006; Gao, X.F. 2009). Two independent groups developed a CPT1C-KO mouse, and both lines showed decreased food intake respect to wild-type animals (WT). However, when fed a high-fat diet, they were more susceptible to obesity and diabetes, presenting lower rates of peripheral fatty acid oxidation. All these effects were attributed to the hypothalamic function of CPT1C, since ectopic over-expression of CPT1C in hypothalamus protected mice from adverse weight gain caused by high-fat diet (Dai, Y. 2007). Moreover, the involvement of CPT1C in energy homeostasis has also been confirmed in transgenic animals over-expressing CPT1C specifically in brain (Reamy, A.A. 2011). At the molecular level, in collaboration with the group of Dr. Gary Lopaschuk, we showed that CPT1C is involved in the anorectic action of leptin, by modulating ceramide synthesis in the arcuate nucleus (ARC) of the hypothalamus (Gao, S. 2011). Interestingly, recent findings in tumor cells showed a new, unexpected role of CPT1C in the metabolic transformations reported in tumor cell growth (Zaugg, K. 2011). The authors demonstrated that CPT1C is frequently expressed in human lung tumors and protects cancerous cells from death induced by glucose deprivation or hypoxia. The results suggest that CPT1C might provide unidentified fatty-acid derived products that would be beneficial for cell survival under metabolic stress. However, despite these recent findings about CPT1C, little is known about its catalytic activity or its physiological function in other brain areas. We demonstrate that CPT1C has low CPT1 activity although it has similar affinity for its substrates: carnitine and palmitoyl-CoA than CPT1A isoform. The present study also shows that CPT1-KO mice have reduced long-chain acyl-carnitine levels in the hippocampus, hypothalamus or cerebellum. We examined whether CPT1C is expressed in the peripheral nervous system: in the ventral horn of the spinal cord (motor neurons) and in the sensitive ganglions, in addition to the brain. We found that CPT1C is expressed in both regions, albeit at lower levels than in the brain. We also examined CPT1C expression along mouse development, and we found that CPT1C protein expression is present in early stage of embryos at day 15, is increased postnatally and reaches its expression peak in adulthood. Moreover, CPT1C is expressed in pyramidal neurons of hippocampus and is located in ER throughout the neuron, even inside dendritic spines. We used molecular, cellular and behavioral approaches to determine CPT1C function. First, we analyzed the implication of CPT1C in ceramide metabolism. CPT1C over-expression in primary hippocampal cultured neurons increased ceramide levels, an effect that was blocked by treatment with myriocin, an inhibitor of the de novo synthesis of ceramide. Correspondingly, CPT1C knock-out (KO) mice showed reduced ceramide levels in hippocampus, cerebellum, striatum and motor cortex, mainly during fasting. At the cellular level, CPT1C deficiency altered dendritic spine morphology by increasing immature filopodia and reducing mature mushroom and stubby spines. Total protrusion density and spine head area in mature spines were unaffected. Treatment of cultured neurons with exogenous ceramide reverted the KO phenotype, as did ectopic over-expression of CPT1C, indicating that CPT1C regulation of spine maturation is mediated by ceramide. To study the repercussions of the KO phenotype on cognition and motor function, we performed the hippocampus-dependent Morris Water Maze (MWM) test and some motor tests on mice. Results show that CPT1C-KO mice are hypoactive and exhibit clear deficits in motor function, especially in coordination skills and strength. Moreover, CPT1C deficiency strongly impairs spatial learning without affecting memory or cognitive flexibility. So, all these results demonstrate that CPT1C regulates the de novo synthesis of ceramide in ER of hippocampal neurons and this is a relevant mechanism for the correct maturation of dendritic spines and for proper spatial learning. / ESTUDIO DE LA FUNCIÓN FISIOLÓGICA DE LA ENZIMA CPT1C La isoforma carnitina palmitoil transferasa 1C (CPT1C) se expresa únicamente en cerebro y ha sido implicada en la regulación hipotalámica de la ingesta de alimentos y la homeostasis energética. No obstante, su función molecular y su papel en otras áreas del cerebro son desconocidas. Hemos demostrado que CPT1C se expresa en las neuronas piramidales del hipocampo y se localiza en el retículo endoplásmico a lo largo de la neurona, incluso dentro de las espinas dendríticas. Hemos utilizado métodos moleculares, celulares y conductuales para determinar la función de CPT1C. En primer lugar, analizamos la implicación de CPT1C en el metabolismo de la ceramida. La sobre-expresión de CPT1C en neuronas de hipocampo aumentó los niveles de ceramidas, un efecto que fue bloqueado por el tratamiento con miriocina, un inhibidor de la síntesis de novo de la ceramida. En consecuencia, los ratones CPT1C knock-out (CPT1C-KO) demostraron una reducción de los niveles de ceramidas en el hipocampo, cerebelo, estriado y corteza motora principalmente durante el ayuno. A nivel celular, la deficiencia en CPT1C afecta a la morfología de las espinas dendríticas mediante el aumento de filopodios inmaduros y reduciendo el número de espinas maduras. La densidad de protrusiones totales o el área de la cabeza de la espinas dendrítica no se vieron afectadas. El tratamiento de las neuronas en cultivo con ceramida exógena, como la sobre-expresión ectópica de CPT1C, revirtieron el fenotipo de las espinas CPT1C-KO, lo que indica que CPT1C regula la maduración de las espinas dendríticas a través de las ceramidas. Para estudiar las repercusiones del fenotipo CPT1C-KO en la cognición y en la habilidad motora se realizaron diferentes test conductuales. Los resultados del test cognitivo demostraron que la deficiencia de CPT1C perjudica al aprendizaje espacial. Por otra parte, la realización de test motores demostraron que los ratones CPT1C son hipoactivos y tienen disminuida tanto la coordinación motora como la fuerza muscular. Todos estos resultados demuestran que CPT1C regula la síntesis de novo de ceramidas en el retículo endoplásmico de las neuronas y éste es un mecanismo necesario para la correcta maduración de las espinas dendríticas y para el adecuado procedimiento del aprendizaje espacial y la función motora.

Carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1) catalyzes the conversion of long chain fatty acyl-CoAs into acylcarnitines, the first step in the transport of long chain fatty acids from the cytoplasm to the mitochondrial matrix, where they undergo &#946;-oxidation. This reaction is not only central to the control of fatty acid oxidation, but it also determines the availability of long chain acyl-CoA for other processes. There are three different CPT1 isozymes: CPT1A (expressed in liver, pancreas, kidney, brain, blood, and embryonic tissues), CPT1B (expressed only in brown adipose tissue, muscle, and heart) and the recently described CPT1C. CPT1C protein sequence is highly similar to that of the other two isozymes. Expression studies indicate that CPT1C is localized exclusively in the central nervous system, with homogeneous distribution in all areas (hippocampus, cortex, hypothalamus, and others). It has also been reported that CPT1c is localized in neurons but not in astrocytes of adult brain.1. CPT1C strucutral modelA 3-D structural model of the isozyme has been constructed by homology modeling. Residues contacting both substrates have been determined and compared to the same amino acid positions in CPT1A. The results obtained from the analysis show that the residues involved in the catalysis of the reaction in CPT1A and residues contacting both substrates are conserved mainly conserved in CPT1C or show semi-conservative substitutions. 2. CPT1 enzymatic activityExpression of rat CPT1C in Saccharomyces cerevisiae yields no catalytic activity when testing different conditions (longer periods of time, increased temperature, increased substrate concentration, testing of microsomal fraction or chimeric protein CPT1·ACA). Thus, the yeast expression system is not suitable for studying CPT1C enzymatic activity.3. Subcellular localizationEndogenous and overexpressed CPT1C is basically localized in the endoplasmic reticulum of mammalian cells (HEK293T, PC12, SH-SY5Y, primary cultures of fibroblasts and neurons). Some evidences indicated that CPT1C could also be found, in lower amounts, in mitochondrial associated membranes (MAMs).The specific sequence of CPT1C N-terminal domain (first 150 amino acids) drives the protein to the endoplasmic reticulum.4. CPT1C N-terminus processingThe N-terminal end of endogenous CPT1C in wild type mouse brain is processed (at least until Val27) and is not detected in mouse brain cortex lysates.5. CPT1C membrane topologyThe N- and C-terminal domains of CPT1C are facing the cytosolic side of the endoplasmic reticulum membrane, whereas the loop domain is facing the endoplasmic reticulum lumen.6. CPT1C interacting partnersThe data provided by the yeast two-hybrid assay do not indicate a unique binding partner of CPT1C. Instead the assay retrieved proteins involved in different functions: protein degradation, membrane trafficking, cell structure, signal transduction and metabolism.KEYWORDS: Carnitine palmitoyltransferase, Endoplasmatic reticulum, Subcelular localization, CPT1 activity, Structural model, Membrane topology / La carnitina palmitoiltransferasa 1 (CPT1) es una enzima que cataliza la conversión de aciles-CoA de cadena larga en acil-carnitinas, reacción crucial para el control de la oxidación de ácidos grasos. Existen tres isoformas diferentes de CPT1: CPT1A (isoforma más ubicua), CPT1B (expresada en tejido adiposo, músculo y corazón) y CPT1C que es la isoforma más recientemente descrita.La secuencia de la proteína CPT1C es muy parecida a la de las otras dos isoformas. Estudios de expresión indican que CPT1C se localiza exclusivamente en el sistema nervioso central. También se ha descrito que CPT1C se localiza en neuronas de cerebro adulto pero no en astrocitos.Las conclusiones obtenidas de los resultados presentados en esta tesis son (por apartados):1. Modelo structuralA través de técnicas de modelaje por homología se ha construido un modelo tridimensional teórico de la proteína. De su estudio se concluye que los residuos implicados en la catálisis de la reacción y los residuos en contacto con los sustratos están bien conservados en la secuencia de CPT1C.2. Actividad enzimáticaLa expresión de CPT1C en la levadura Saccharomyces cerevisiae no muestra actividad CPT1 aunque se testen diferentes condiciones (tiempos de reacción más largos, incrementos en la concentración de sustratos, pruebas en fracciones microsomales o pruebas con proteínas quiméricas como la CPT1·ACA)3. Localización subcelularLa proteína CPT1C se localiza básicamente en el retículo endoplasmático de células de mamífero (HEK293T, PC12, SH-SY5Y y en cultivos primarios de fibroblastos y de neuronas). La secuencia concreta de los 150 primeros aminoácidos dirige la porteína al retículo endoplasmático.4. Procesamiento del extremo N-terminal de CPT1CEl extremo N-terminal de la proteína CPT1C endógena sufre un procesamiento.5. Topología en la membrana de CPT1CLos dominios N- y C-terminal (centro catalítico) están orientados hacia la cara citosólica de la membrana del retículo endoplasmático.6. Proteínas de unión Los resultados obtenidos del ensayo de dobles híbridos no indican que CPT1C interaccione con una sola proteína de unión. Del ensayo se obtuvieron proteínas implicadas en diferentes funciones: degradación de proteínas, tráfico de membranas, estructura celular, vías de transducción de la señal y metabolismo.