L’escalfament global i la contaminació medioambiental han promogut la recerca científica i polítiques governamentals per tal de desenvolupar i aplicar processos de producció més sostenibles, un ús més racional de l’energia i la implenetació de sistemes de reciclatge. En aquest sentit, els alquil èsters d’àcids grassos – coneguts com a biodièsel – suposen una alterntaiva sostenible i renovable al dièsel convencional, i en l’actualitat ja s’usa mesclat amb dièsel. El biodièsel s’obté per transesterificació d’olis vegetals o grasses animals amb un alcohol – normalment metanol. Després de la seva combustió, el diòxid de carboni resultant és fixat per les plantes mitajançant la seva fotosíntesi, i convertit a biomassa a partir de la qual es torna a obtenir oli per fabricar-ne biodièsel. Així, l’avantatge principal del biodièsel respecte el dièsel convencional és que el seu ús és un cicle tancat de carboni, fet que evita l’augment del carboni ambiental, i a més a més no presenta els futurs problemes d’esgotament dels combustibles fòssils. En un altre ordre de coses, l’ús d’enzims s’ha estès dins la indústria, principalment perquè els processos enzimàtics són més sostenibles i tenen menys consum energètic que els processos convencionals. Malgrat tot, l’elevat preu dels enzims limita encara el seu ús i per tant és necessària més recerca. La utilització de lipases per generar biodièsel és un exemple de l’ús d’enzims per substituir mètodes convencionals. A la natura, les lipases es troben als éssers vius i la seva funció és la hidròlisi dels greixos – és a dir, triacilglicerols –, obtenint àcids grassos lliures. Recentment, l’ús de les lipases s’ha explorat com a alternativa a l’actual mètode d’obtenció de biodièsel, degut a que té un consum d’energia inferior i també perquè les lipases poden sintetitzar biodièsel a partir d’un rang de matèries primeres més ampli. Aquesta tesi s’ha focalitzat a l’estudi de la lipasa de Rhizopus oryzae, expressada recombinantment a partir de Pichia pastoris, com a biocatalitzador d’alquil èsters d’àcids grassos. En primer lloc es va estudiar la inactivació de la lipasa causada pel metanol, fet el qual és un dels principals inconvenients en l’ús de les lipases, així com també l’efecte de l’aigua en aquesta inactivació; d’aquest primer estudi, se’n va concloure que l’aigua contrarresta l’efecte negatiu del metanol, encara que la seva presència incrementa la hidròlisi dels greixos en lloc de la seva transesterificació. La presència d’àcids grassos lliures a les matèries primeres és un inconvenient important pels mètodes químics actuals d’obtenció de biodièsel, mentre que les lipases poden dur a terme sense problemes la transesterificació amb presència d’àcids lliures, convertint-los també a biodièsel. Així, la segona part de la tesi va ser centrada en estudiar si aquests àcids grassos lliures poden tenir algun efecte sobre les lipases, concloent que no només no perjudiquen l’enzim, sinó que la seva presència redeix l’efecte negatiu del metanol. Degut a la varietat de components implicats a la transesterificació enzimàtica – tri-, di-, monoacilglicerols, àcids grassos lliures, alcohol, aigua i biodièsel –, es varen realitzar experiments per determinar el mecanisme de reacció de la transesterificació. Es va concloure, que el biodièsel s’obté enzimàticament per combinació de l’alcohòlisi directa dels greixos i l’hidròlisi dels greixos i la posterior esterificació dels àcids grassos alliberats. També és va determinar que la lipasa de Rhizopus oryzae no necessita l’activació interfacial, fenomen característic de les lipases. Finalment, es va fer un estudi comparatiu de l’especificitat de la lipasa respecte acilglicerols i alcohols, demostrant que l’enzim és molt més específic per 1-monooleïna que per trioleïna, i presenta més tolerància a l’etanol que el metanol. / Global warming and environmental pollution have fostered scientific research and encouraged governmental policies to develop and implement greener production processes, a more rational energy usage and recycling life cycles. In that sense, fatty acid alkyl esters – commonly known as biodiesel – have emerged as a green and renewable alternative to conventional diesel and currently it is commercially used in blends with diesel. Biodiesel is obtained by transesterification of vegetable oils or animal fats with an alcohol – most often methanol. After its combustion, carbon dioxide is fixed and converted to new biomass by photosynthesis, from which biodiesel is again produced. Thus, the main advantage of biodiesel over diesel is that its production and utilisation is a closed carbon cycle, which does not contribute to increasing atmospheric carbon levels, and overcomes the future depletion of fossil fuels. Moreover, the employment of enzymes has become widespread within the industrial sector, especially because enzymatic procedures are greener and have less energy demand compared to traditional chemical ones. However, the high price of enzymes still limits their utilisation and further scientific research is needed. The use of lipases to produce biodiesel constitutes one example of the employment of enzymes to replace an existing chemical production process. In nature, lipases are found in living organisms, which use them to catalyse the hydrolysis of triacylglycerols – i.e. lipids –, obtaining free fatty acids after breaking ester bonds. In recent years, their employment in the synthesis of biodiesel has been explored as a suitable alternative to the present chemical catalysis processes, due to its lower energy consumption and also because lipases can produce biodiesel from a larger variety of initial raw materials, compared to conventional process. This dissertation has been focused on the study of the Rhizopus oryzae lipase, expressed recombinantly by Pichia pastoris, as biocatalyst to synthesise fatty acid alkyl esters – Rhizopus oryzae lipase and recombinant Rhizopus oryzae lipase are referred to in the present booklet as ROL and rROL, respectively. Initially, methanol inactivation of the lipase, which remains the main drawback for the employment of lipases in biodiesel production, and the effect of water on this inactivation were investigated, concluding that water can buffer methanol’s negative effect on lipase, although it increases the hydrolysis of triacylglycerols. The presence of free fatty acids in the initial raw material is a major obstacle in conventional chemical biodiesel production, whereas lipases can handle perfectly free fatty acids, esterifying them to biodiesel. Thus, in the second part of the thesis the effect of free fatty acids on the lipase was also studied, concluding that not only do they not represent a problem for enzymatic biodiesel production, but also their presence reduces lipase inactivation by methanol. Due to the variety of compounds present throughout the lipase catalysis – tri-, di-, monoacylglycerols, free fatty acids, alcohol, water and biodiesel –, experiments to elucidate the whole transesterification reaction pathway were carried out. It was found that biodiesel was obtained by a combination of reactions, namely, direct triacylglycerol alcoholysis, triacylglycerol hydrolysis and free fatty acids esterification. It was also determined that rROL does not need the so-called interfacial activation, widely attributed to lipases. Finally, a comparative study of alcohol type and lipase specificity towards acylglycerols was also performed, demonstrating that rROL exhibits better tolerance to ethanol compared to methanol, and higher specificity towards 1-monoolein than triolein.

Aquesta tesi s'emmarca dins les investigacions realitzades en el Departament d'En-ginyeria Química de la Universitat Autònoma de Barcelona en col·laboració amb la Unitat de Química i Bioquímica de Proteïnes del CID-CSIC, en el camp de la síntesi enzimàtica de pèptids.El treball es centra en desenvolupar un procés per a la síntesi enzimàtica de l'octapèptid C-terminal de la CCK (CCK-8). L'interès més rellevant d'aquesta molècula és que presenta un ampli espectre d'activitat biològica i un elevat potencial terapèutic.- La introducció de la memòria s'ha distribuït en tres parts:- Diferents aspectes cabdals en la síntesi enzimàtica de pèptids.- Característiques i funcions de la CCK i CCK-8.- Un resum dels estudis previs realitzats sobre la síntesi enzimàtica del penta-pèp-tid C-terminal de la CCK-8, els quals han servit de punt de par-tida per aquest treball.- El capítol de resultats i discussió s'ha subdividit en diferents apartats.- Inicialment es presenten les investigacions de N-a protecció/desprotecció realitzades amb penicil·lina G acilasa (PGA) d'E. coli. Aquests estudis es van començar amb la N-a protecció de diferents derivats d'aminoàcids a escala analítica amb els grups protectors fenilacetil i mandelil (PhAc, Mand). Segui-da-ment aquestes reaccions es van realitzar a escala pre-pa-ra-tiva.En segon terme es presenta l'estudi de l'enllaç peptídic R-Gly-Trp-OBzl (dipèptid 4-5 de la CCK-8, on R: PhAc, Mand) amb l'objectiu d'investigar i comparar la influència dels grups protectors PhAc i Mand sobre la reactivitat del donador d'acil. Al mateix temps s'intenta optimitzar la reacció amb una finalitat de procés.Aquest estudi es tanca amb l'aplicació de la PGA en una reacció de despro-tecció del grup N-a protector. Concretament es tria desprotegir el grup PhAc del pentapèptid PhAc-Gly-Trp-Met-Asp(OBut)-Phe-NH2, etapa necessària per tal de poder abordar la síntesi de l'octapèptid.- En un segon bloc, s'inicia l'estudi de la síntesi del tripèptid N-terminal de la CCK-8 a escala analítica, a partir de les dues estratègies de síntesi possibles (Asp+Tyr)+Met i Asp+(Tyr+Met).- Seguidament es presenta un apartat dedicat a trobar unes bones condicions per a la síntesi de l'octapèptid i tot seguit s'introdueixen les modificacions necessàries per a l'obtenció de la PhAc-CCK-8.- L'últim bloc del capítol es destina a presentar el procés global per a la síntesi enzimàtica de la PhAc-CCK-8 a escala preparativa.Tenint com a base l'esquema de síntesi del pentapèptid dels estudis previs, es proposa un nou esquema amb la idea de definir un procés global per a la síntesi d'aquesta molècula. La viabilitat d'aquest esquema es comprova a escala analítica. Posteriorment es realitza la síntesi del pentapèptid i la desprotecció del grup PhAc, amb PGA, a escala de grams.A continuació es planteja el procés per a la síntesi del tripèptid N-terminal a partir de les condicions trobades anteriorment a escala analítica. Finalment es du a terme la síntesi de la PhAc-CCK-8 a escala preparativa. / This PhD dissertation is included in the research performed in the Chemical En-gi-neering Dept. of the UAB in collaboration with the Unitat de Química i Bio-quí-mica de Proteïnes of CSIC, in the field of enzymatic peptide synthesis.The main goal of this work is to develop a process for the enzymatic syn-thesis of the C-terminal octapeptide of CCK (CCK-8).The main interest of this molecule is its wide spectrum of biological activity and a great therapeutic po-tential.- The introductory chapter has consists of three parts:- Several capital aspects in the enzymatic peptide synthesis.- Features and functions of CCK and CCK-8.- An abstract of previous studies on the enzymatic synthesis of the C-terminal pen-ta-peptide of CCK-8. This work was the starting point of the present one.- The results and discussion chapter has been subdivided into several sections.- Firstable is showed the N-a protection/deprotection studies performed with pe-ni-cillin G acylase (PGA) from E. coli. These studies started with N-a pro-tec--tion of different aminoacid derivatives at anlytical scale using phenylacetil and mandelil (PhAc, Mand) as protecting groups. After that this reactions were carried out at preparative scale.Secondly the study of peptidic bond R-Gly-Trp-OBzl (dipeptide 4-5 of CCK-8 sequence, where R: PhAc, Mand) is shown, having in mind to compare the influence of PhAc and Mand protecting groups on the acyl donor reactivity. At the same time we optimize the reaction from a process approach.This study is closed applying PGA in a deprotection reaction of the N-a group. In particular it has been chosen the deprotection of the pentapeptide PhAc-Gly-Trp-Met-Asp(OBut)-Phe-NH2, because this stage is needed to achieve the octapeptide synthesis.- A second block covers the N-terminal tripeptide synthesis of CCK-8 at analytical scale, from the only two synthetic strategies (Asp+Tyr)+Met and Asp+(Tyr+Met).- The next block is devoted to find the best reaction conditions for the octapeptide synthesis and, afterwards, the introduction of the modifications required to obtain the PhAc-CCK-8.- The last block is focused on the global process for the enzymatic synthesis of PhAc-CCK-8 at preparative scale.Taking into account previous pentapeptide synthesis studies, a novel scheme is proposed to define a global process for the syn-thesis of this molecule. The feasibility of this scheme has been tested at analytical scale. Afterwards the pentapeptide synthesis and PhAc depro-tection (using PGA as a catalyst) have been performed at gram scale.Afterwards, the N-terminal tripeptide synthesis process is studied, taking into consideration the conditions at analytical scale previously stated. Finally the synthesis of PhAc-CCK-8 at preparative scale has been achieved.

Las lipasas son enzima con numerosas aplicaciones en biocatálisis debido a su reacción natural, hidrólisis de enlaces éster, como a su utilización en reacciones de transesterificación y síntesis orgánica. Se destaca como productor de lipasas la levadura Candida rugosa. Existen lipasas comerciales de este microorganismo, pero tienen el inconveniente de ser una mezcla de isoenzimas que hace inviable el proceso de purificación. La alternativa es la producción heteróloga de la lipasa 2 en otro microorganismo. No obstante, esta vía topa con la peculiaridad de que C. rugosa no sigue el código genético universal para el amino ácido serina. Con objeto de obtener el gen sintético, se diseñó y optimizó la secuencia nucleotídica de rLip2 para su expresión en Pichia pastoris, su inserción en el vector de expresión pPICZα bajo el control transcripcional del promotor de la alcohol oxidasa, su transformación en P. pastoris y la selección de clones productores de rLip2 activa. Comprobada la obtención de clones productores de rLip2 funcional, se determinó el pH óptimo de producción mediante estrategias de operación en discontinuo, paso previo a la optimización de la operación en discontinuo alimentado. Al trabajar con fermentaciones en discontinuo alimentado no se detectó presencia de actividad lipásica. Análisis por Western blot revelaron que estábamos en presencia se de agregados de rLip2, que no tenían actividad lipásica. La hipótesis que se planteó para justificar la formación de los agregados de rLip2 fue la elevada salinidad del medio de cultivo. Mediante la disminución de la fuerza iónica del medio mediante ultra y diafiltración se recupero la actividad enzimática, detectando el monómero de rLip2. La producción del producto heterólogo fue 10 veces superior a del microorganismo natural. Se realizó una caracterización bioquímica y funcional determinándose el óptimo de temperatura y pH, su especificidad frente a p-nitrofenoles y triglicéridos. El estudio de estabilidad demostró que la enzima recombinante en solución era menos estable que la nativa. No obstante, al inmovilizar la rLip2 se consiguió obtener una isoenzima más estable con el valor añadido de poder ser reutilizada. Finalmente, se realizaron aplicaciones biocatáliticas de rLip2 en reacciones de síntesis enantioméricas para la resolución de mezclas rácemicas de compuestos de interés farmacéutico. Si bien para la resolución racémica del trans-2-fenil-1-ciclohexanol, la rLip2 no fue tan efectiva como la isoenzima nativa, para la resolución del ibuprofeno, se obtuvieron mejores resultados en términos de conversión, exceso y factor enantiomérico que con la nativa. / Lipases are enzymes with a wide range of applications in biocatalysis due to its natural reaction, hydrolysis of ester bounds, as well as to their use in transesterification and synthesis reactions. The yeast Candida rugosa is a well known lipase producer; there are several C. rugosa lipase preparations commercially available, but they have the inconvenience of being a mixture of several lipase isoenzymes with similar physicochemical properties, i.e. hampering the efficiency of their separation process. Thus, the recombinant production of C. rugosa lipases, particularly of the lipase 2 isoenzyme (Lip2), in another host microorganism is an attractive alternative. However, this strategy is hampered by the fact that C. rugosa may use a non-universal codon for Serine. We designed and synthesised a codon-optimised lip2 gene for its expression in Pichia pastoris. The synthetic gene was inserted into the pPICZα expression vector under the transcriptional control of the alcohol oxidase promoter, and cloned into P. pastoris. Transformants were selected in small scale cultivations for active rLip2 expression. In the following step, we determined the optimum pH for lipase production in preliminary bioreactor batch cultivations. However, when the producing strain was tested in fed-batch bioreactor cultivations, no lipolytic activity was detected in culture supernatants. Nevertheless, Western Blot analyses revealed that rLip2 was being produced as aggregates, with no apparent lipolytic activity. This observation suggested that the formation of rLip2 aggregates was related to the high ionic strength of the culture medium. Thus, cleared culture supernatants were subjected to ultra/diafiltration. By reducing the ionic strength of the cleared supernatant, the enzymatic activity could be recovered, also detecting the monomeric rLip2 form. Notably, the recovered lipase activity was 10-fold higher to that recovered from a cultivation process at the same scale with the native enzyme producer. The recombinant enzyme was biochemically and functionally characterized. In particular, we determined its optimum temperature and pH for activity, as well as its specificity towards p-nitrophenols and tryglycerides. Also, the stability study revealed that the recombinant enzyme is less stable than the native enzyme preparation. Nevertheless, when the rLip2 was immobilized on a solid support, stability was substantially improved, having the possibility of reuse as an additional advantage. Finally, the potential of rLip2 as a biocatalyst was tested in two different reactions of enantiomeric synthesis, for the resolution of racemic mixtures of compounds of pharmaceutical interest. Although rLip2 resulted to be less efficient than the native lipase preparation for the racemic resolution of trans-2-phenyl-1-ciclohexanol, the recombinant enzyme showed an improved performance (in terms of conversion, enantiomeric excess and enantiomeric factor) in relation to the native enzyme preparation for the resolution of ibuprofen.

En la actualidad existe un creciente interés en el desarrollo de procesos industriales biocatalíticos eficientes desde el punto de vista económico y medioambiental. Uno de los procesos más prometedores para la industria es la biocatálisis de la formación de enlaces C-C para la producción de compuestos de estereoquímica definida, de aplicación en diversos campos y, en especial, en la industria farmacéutica.El presente trabajo de Tesis Doctoral es una aportación al desarrollo de un bioproceso catalítico empleando ramnulosa-1-fosfato aldolasa recombinante como biocatalizador para la producción estereoselectiva de un compuesto precursor de inhibidores de glicosidasas de acción terapéutica mediante adición aldólica de dihidroxiacetona fosfato y (S)-Cbz-alaninal.En primer lugar, se ha procedido a la obtención de un modelo cinético de la reacción catalizada por la enzima soluble en un medio acuoso con dimetilformamida como cosolvente para permitir la disolución simultánea de ambos reactivos. Este modelo cinético incluye la reacción secundaria de degradación enzimática de dihidroxiacetona fosfato que tiene lugar paralelamente a la reacción de síntesis.En segundo lugar, y con el fin de aumentar la estabilidad de la enzima y mejorar la operación en biorreactor, se estudió la inmovilización de la enzima en dos tipos de soportes: soportes de afinidad metálica y nanopartículas de oro. El primer soporte permite realizar la purificación e inmovilización en un solo paso de la enzima, con el consiguiente ahorro de etapas y aumento del rendimiento global del proceso. El segundo tipo de soporte permite reducir las limitaciones difusionales que aparecen con frecuencia en los soportes porosos convencionales y obtener elevadas cargas enzimáticas específicas. Los biocatalizadores inmovilizados por ambas técnicas se emplearon en la catálisis de la adición aldólica de interés en un medio acuoso con dimetilformamida como cosolvente, evaluando su estabilidad en el medio.Por último, se estudiaron otras estrategias de reacción para mejorar la solubilidad simultánea de los reactivos de la reacción. Por un lado se analizó el empleo de novedosos medios de reacción, los líquidos iónicos, como alternativa al empleo de cosolventes orgánicos en la biocatálisis de interés. Por otro lado, se evaluó la aplicación de un biorreactor de membrana empleando un medio bifásico acuoso/orgánico en el mismo sistema biocatalítico. / Nowadays, there is a growing interest in the development of efficient industrial bioprocesses from an economic and environmental point of view. One of the most promising processes for the industry is the biocatalytic C-C bond formation that yields compounds with defined stereochemistry for diverse applications, especially in the pharmaceutical industry.This PhD Thesis is a contribution to the development of a catalytic bioprocess for the production of precursors of compounds with therapeutic potential as inhibitors of glycosidases for a wide range of diseases. The biocatalytic reaction employed was the aldol addition between dihydroxyacetone phosphate and (S)-Cbz-alaninal using recombinant rhamnulose-1-phosphate aldolase as biocatalyst.First, a kinetic model for the aldol addition catalyzed by soluble enzyme was obtained. The reaction was carried out in an aqueous medium with dimethylformamide as a cosolvent in order to achieve a suitable solubility of both reactants. This kinetic model includes the secondary reaction of enzymatic degradation of dihydroxyacetone phosphate that takes place simultaneous to the synthetic reaction.Secondly, enzyme immobilization was studied with the aim of increasing enzyme stability and improving bioreactor operation. Two types of supports were used: metal-chelated supports (IMAC) and gold nanoparticles. The use of metal-chelated supports allows simultaneous purification and immobilization in only one-step, reducing the number of steps of the process and increasing the global yield. Gold nanoparticles as supports for enzyme immobilization allow obtaining high enzymatic loads due to its high surface-to-volume ratio. Moreover, the diffusional limitations that frequently appear while working with conventional porous supports can be also reduced. Immobilized biocatalysts were produced by both immobilization techniques and they were applied in the biocatalysis of the selected aldol addition in an aqueous medium with dimethylformamide as a cosolvent. The stability of these biocatalysts in the reaction conditions was determined as well.Finally, other reaction strategies were employed in order to improve the simultaneous solubility of dihydroxyacetone phosphate and (S)-Cbz-alaninal. Ionic liquids, considered as promising reaction solvents, were assessed as an alternative to organic cosolvents in the selected biocatalysis. On the other hand, a membrane bioreactor with an aqueous/organic biphasic medium with high solubility of both substrates was studied with the same biocatalytic system.

En aquest treball hem investigat el rol de la p120-catenina en la via de senyalització de Wnt. Hem demostrat per primera vegada la importància d’aquesta catenina en l’activació de la GTPasa Rac1 i en la translocació de la β-catenina al nucli en resposta a la via canònica de Wnt. La via de Wnt ha estat àmpliament estudiada degut a la seva forta implicació en funcions essencials de cèl·lules epitelials normals i patològiques. Tot i que s’han descrit moltes proteïnes implicades en la via de Wnt, queden encara molts detalls per descriure sobre la regulació de l’activitat d’aquestes. Recentment, s’ha descrit que Rac1 és essencial per la translocació de la β-catenina al nucli (Wu X, et al. Cell 2008,133:340-53). El Rac1 actiu controla la localització nuclear de la β-catenina durant la via canònica de Wnt. Tot i així, el mecanisme d’activació d’aquesta GTPasa no ha estat investigat. En aquest treball es demostra que la p120-catenina és necessària per l’activació de Rac1, actuant com a proteïna acobladora de Rac1 i el seu activador Vav2. La interacció de les dues proteïnes amb la p120-catenina és estimulada per la fosforilació de CK1 i la defosforilació en residus tirosina, dues modificacions post-traduccionals que són activades pel factor Wnt3a. Quan sobre-expressem en cèl·lules diferents mutants de la p120-catenina que no uneixen ni Vav2 ni Rac1, o específicament Rac1, aquests no són capaços d’estimular l’activitat de Rac1. A més a més, sabent que la depleció de la p120-catenina en Xenopus produeix defectes en el procés de gastrulació, hem analitzat la capacitat dels diferents mutants de p120-catenina en rescatar aquest fenotip. Al contrari que la proteïna salvatge, els mutants de la p120-catenina que no uneixen Rac1 i Vav2, o que només uneixen Vav2, no són capaços de rescatar la depleció de p120-catenina. Així doncs, els nostres resultats indiquen que la p120-catenina és necessària per l’activació de Rac1 estimulada per Wnt, a través de la unió de Vav2 i de Rac1. Mitjançant la combinació d’experiments in vitro, transfeccions de cultius cel·lulars i anàlisis in vivo en embrions de Xenopus, proposem un mecanisme detallat del control de l’activitat transcripcional de la β-catenina i la via de senyalització de Wnt. / In this work we have investigated the involvement of p120-catenin in Wnt signaling. We demonstrate for the first time the relevance of this catenin in the activation of Rac1 GTPase and in the translocation of β-catenin to the nucleus in response to canonical Wnt signals. The Wnt pathway has been broadly studied due to its involvement in essential functions in normal and pathological epithelial cells. Although the involvement of many proteins in the process has been genetically demonstrated, many details of its activation remain to be clarified yet. Recently, Rac1 has been shown to be essential for β-catenin translocation to the nucleus (Wu X, et al. Cell 2008,133:340-53). Rac1 activation controls the nuclear localization of β-catenin during canonical Wnt signaling. However, the mechanism of activation of this GTPase has not been investigated. Here we report that p120-catenin is required for Rac1 activation, acting as an anchor protein for both Rac1 and its activator Vav2. The interaction of both proteins with p120-catenin is stimulated upon phosphorylation by CK1 and dephosphorylation in tyrosine residues, two p120-catenin post-translational modifications promoted by Wnt3a. When over-expressed, p120-catenin point mutants unable to bind Rac1 and Vav2, or specifically Rac1, fail to stimulate Rac1 activity. Moreover, since p120-catenin depletion disrupts gastrulation in Xenopus, we analyzed p120-catenin mutants for their ability to rescue such phenotype. In contrast to the wild-type protein, p120-catenin point mutants unable to bind Rac1 and Vav2, or to bind Vav2 alone, failed to rescue p120 depletion. Therefore, our results indicate that p120-catenin is required for Rac1 activation upon Wnt signaling, through binding to Vav2 and Rac1 proteins. Combining in vitro binding experiments, cell culture transfections and in vivo analysis in Xenopus embryos, we provide a more detailed picture of the mechanism controlling β-catenin transcriptional activity and Wnt signaling.

Les tècniques proteòmiques basades en l’espectrometria de masses (MS) permeten la caracterització de la complexa i dinàmica natura del proteoma. Aquestes eines han contribuit a entendre millor certes funcions biològiques i respostes cel·lulars i a obtenir biomarcadors específics per a l’estudi d’algunes malalties. En aquest treball, es van utilitzar tècniques proteòmiques de quantificació i validació, basades en l’espectrometria de masses (MS), en diferents estudis de recerca biomèdica. En el primer estudi es va comparar el perfil de proteïnes del fluid vitri de pacients diabètics amb retinopatia diabètica proliferativa (PDR) amb el de pacients no diabètics amb forat macular idiopàtic (MH). L’anàlisi proteòmica comparativa es va fer amb el sistema d’electroforesi diferencial en gel bidimensional basat en el marcatge fluorescent (2D-DIGE). Per MS es van identificar 11 proteïnes diferencials entre els pacients amb PDR i els individus no diabètics. Cinc de les proteïnes diferencials és van validar per western blot en fluids vitris i per RT-PCR en retines. L’anàlisi proteòmica 2D-DIGE va servir per a identificar potencials candidats involucrats en la patogènesis de la PDR. En el segon estudi es va estudiar l’efecte del gen REgulador AutoImmune (AIRE) mitjançant la comparació dels proteomes de cèl·lules epitelials transfectades o no amb AIRE. L’anàlisi comparativa es va realitzar combinant dues tècniques de proteòmica quantitativa: la 2D-DIGE i l’etiquetatge isotòpic codificat de proteïna (ICPL) en combinació amb cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses (LC-MS). Els resultats van mostrar un nivell incrementat de varies xaperones en les cèl·lules que expressaven AIRE, mentre que diferents proteïnes de interacció del citoesquelet es van trobar disminuïdes. A més, algunes proteïnes relacionades amb apoptosi tenien abundàncies diferencials entre unes cèl·lules i les altres. Aquests resultats es van confirmar per western blot i citometria de flux. Finalment, assajos d’apoptosi amb annexin V i etopòsid van demostrar que les cèl·lules positives en AIRE patien més apoptosi espontània i eren menys resistents a la inducció d’apoptosi. Els resultats obtinguts van corroborar el paper d’AIRE com a inductor d’apoptosi. En el tercer estudi, amb l’objectiu de identificar possibles proteïnes biomarcadores de l’activitat TGFβ en gliomes es van analitzar les proteïnes secretades en els cultius cel·lulars primaris derivats de tumors (PCTCs), tractats o no amb TGFβ, mitjançant experiments quantitatius de LC-MS sense marcatge i ICPL. Es van identificar varies proteïnes candidates per a les que es van desenvolupar mètodes d’anàlisi de seguiment d’una reacció seleccionada (SRM) per a poder validar-les en mostres de líquid cefaloraquidi (CSF) i plasma de pacients amb glioma. Per l’anàlisi dels CSFs els resultats van mostrar una clara correlació entre les proteïnes candidates i els nivells de TGFβ en aquestes mostres. Igualment, al analitzar les proteïnes candidates per SRM en mostres de plasma de pacients amb glioma en fases alternades de tractament amb un inhibidor de TGFβ es va observar que els nivells de les proteïnes d’interès eren modulades pel tractament. Aquestes proteïnes conformarien una firma proteica que podria ser útil per al diagnòstic i el seguiment del tractament dels pacients. En conjunt, els resultats obtinguts en cada un dels tres estudis demostren la utilitat de l’anàlisi proteòmica en diferents aspectes de la investigació biomèdica. / Proteomic techniques based on mass spectrometry (MS) allow the characterization of the complex and dynamic nature of the proteome. These tools have contributed to better understand certain biological functions and cellular responses and to obtain specific biomarkers useful for the management of some diseases. In this work, quantitative and validation proteomic techniques, based on mass spectrometry, were applied to different biomedical research projects. In the first study, the protein profile of the vitreous fluid of diabetic patients with proliferative diabetic retinopathy (PDR) and non diabetic patients with macular hole (MH) was compared. Comparative proteomic analysis was performed using differential in gel electrophoresis based on fluorescent labeling (2D_DIGE). Eleven differential proteins between PDR and non diabetic patients were identified by MS. Five differential proteins were validated by western blot analysis of vitreous fluid and by RT-PCR of retinas. 2D-DIGE proteomic analysis allowed the identification of potential candidates involved in the pathogenesis of PDR. In the second study, the effect of AutoImmune Regulator (AIRE) gen was studied by comparison of the proteomic profile of epithelial cells transfected or not with AIRE. The comparative analysis was done using to proteomic techniques: 2D-DIGE and Isotopic Coded Protein Labeling (ICPL) in combination with liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS). Results showed an increased level of some chaperons in the cells expressing AIRE, while some cytoskeleton interacting proteins were decreased. Moreover, proteins related wit apoptosis had differential abundances between samples. These results were confirmed by western blot and flow cytometry. Finally, apoptosis assays with annexin V and etoposide demonstrated that AIRE-positive cells suffer more spontaneous apoptosis and are less resistant to apoptosis induction. These results confirm the role of AIRE as an inducer of apoptosis. In the third study, the main objective was the identification of biomarker proteins of TGFβ activity in gliomas. Secreted proteins from primary cultures of tumor cells (PCTCs), treated or not with TGFβ, were analyzed by label free and ICPL LC-MS quantitative experiments. Some candidate proteins were identified. Selected reaction monitoring (SRM) methods were designed to analyze these candidate proteins in cerebrospinal fluid (CSF) and plasma of glioma patients. CSF analysis showed a clear relationship between the protein levels and the TGFβ concentration. When the SRM methods were applied to the plasma of glioma patients under alternate periods of treatment with a TGFβ inhibitor, the levels of proteins of interest were observed to be modulated by the treatment. These proteins can thus constitute a protein signature useful for diagnostic and treatment monitoring. Overall, the results obtained in each of the projects show the usefulness of the proteomic analysis in different aspects of de biomedical research

El plegament de la cromatina a l’interior dels cromosomes metafàsics segueix sent un dels problemes més difícils de resoldre de la biologia estructural. La majoria dels models de plegament més acceptats, que presenten la fibra de cromatina com a unitat bàsica, van ser proposats en condicions de molt baixa força iònica. Mitjançant múltiples tècniques microscòpiques, es va observar que els cromosomes metafàsics contenen un nou element bàsic de plegament: la placa de cromatina. Com a objectiu general, el treball experimental realitzat en aquesta tesi pretén ampliar el coneixement sobre l’estructura interna dels cromosomes metafàsics utilitzant condicions iòniques properes a les observades a la metafase. En primer lloc, s’ha estudiat l’estructura dels cromosomes dins les cèl·lules mitjançant microscòpia de polarització. Per altra banda, s’ha realitzat un ampli estudi de la capacitat d’autoassociació de fragments de cromatina de cromosomes metafàsics de cèl·lules humanes en condicions properes a la metafase. Mitjançant microscòpia de polarització, s’ha vist que els cromosomes metafàsics en medi aquós dins els sacs cel·lulars, són estructures òpticament isotròpiques. L’isotropia observada permet concloure que els cromosomes metafàsics no estan formats per piles paral·leles de nucleosomes. Aquesta possibilitat no exclou però l’associació de les cares laterals dels nucleosomes, que podrien donar lloc a piles amb diferents orientacions. Els resultats obtinguts mitjançant microscòpia electrònica de transmissió de fragments de cromatina obtinguts per digestió amb nucleasa micrococal de cromosomes metafàsics de cèl·lules humanes, mostren que únicament adopten una conformació estesa quan la concentració iònica del medi és molt baixa (10 mM Pipes, 10 mM EDTA). En condicions iòniques properes a la metafase (10 mM Pipes, 120 mM K+, 20 mM Na+, 17 mM Mg2+), els fragments de cromatina obtinguts tenen la capacitat intrínseca de formar estructures laminars per autoassociació. A més, no s’observen fibres de cromatina. Les plaques formades per autoassociació presenten les mateixes característiques que les emanades directament de cromosomes metafàsics: són estructures compactes, de superfície llisa i multilaminars. L’alçada de les plaques formades per autoassociació de fragments de cromatina metafàsica determinada a partir de mostres platinades unidireccionalment és de 6.8 ± 1.0 nm per làmina. Aquest valor coincideix amb l’alçada de les plaques emanades de cromosomes parcialment desnaturalitzants, observades al grup. L’aparició d’estructures laminars de gruix superior en mostres sotmeses a incubacions llargues a 25 i 37ºC, indica l’elevada tendència de les làmines de cromatina d’apilar-se i formar estructures multilaminars. Els cossos circulars compactes de 30 nm observats als voltants de les plaques obtingudes, sumat a la presència d’altres estructures circulars més petites sobre les plaques, suggereix que els cossos de 30 nm són estructures intermediàries durant el procés de formació de plaques. Tenint en compte que l’alçada d’un nucleosoma és de 11 nm i que no hi ha evidències que suggereixin una col·locació en columnes dels nucleosomes a les plaques, els resultats indiquen que els nucleosomes es distribueixen de forma parcialment inclinada a l’interior de les plaques. A partir dels resultats obtinguts, es pot suggerir que els nucleosomes a les plaques estan orientats irregularment. La interdigitació entre les làmines successives permet la interacció entre les cares laterals dels nucleosomes i dóna estabilitat a les plaques. La tendència a l’autoassociació de fragments de cromatina metafàsica per formar estructures multilaminars molt estables, suggereix que les cromàtides contenen cromatina plegada en una forma laminar al seu interior. / The three-dimensional organization of the chromatin filament in metaphase chromosomes is one of the most challenging problems of structural biology. The most accepted structural models for chromatin organization in the metaphase chromosome are those that present the chromatin fibber as a basic unit. However, they were proposed by the use of low ionic strength buffers. Through the use of several microscopy techniques, it was observed that metaphase chromosomes were built by a new structural element: the chromatin plate. The main goal of this thesis was to gain further insight on internal structure of metaphase chromosomes under metaphase ionic conditions. Firstly, it was analysed the entire chromosome structure within the cell using polarizing microscopy; and secondly, it was analysed the assembly process of digested chromatin fragments from human metaphase chromosomes under metaphase ionic conditions. Through the use of polarizing microscopy, it was observed that metaphase chromosomes in aqueous solutions under different ionic conditions are optically isotropic. These results exclude the possibility that nucleosomes are oriented regularly forming parallel columns inside metaphase chromosomes. Despite of this, it does not exclude the face-to-face and lateral side-by-side interactions of different nucleosomes, that can already generate columns with several orientations. The results obtained in the self-assembly process of chromatin fragments obtained after the digestion of micrococcal nuclease of human metaphase chromosomes observed with transmission electron microscopy, showed that they appear to be in an extended conformation just under low ionic strength condition (10 mM Pipes, 10 mM EDTA). When fragments are treated under metaphase ionic conditions (10 mM Pipes, 120 mM K+, 20 mM Na+, 17 mM Mg2+), it was observed that chromatin filaments generate laminar structures. In addition, there is no presence of chromatin fibbers. Self assembled plates show the same structural properties than the ones that emanate directly from metaphase chromosomes (i.e., flat and smooth surface, well-defined edges, stacking of several layers). Furthermore, the height of the plates obtained by self-assembly determined in unidirectional shadowing experiments is 6.8 ± 1.0 nm. This value is equal to the height of the plates emanated from partially denatured chromosomes, which was observed previously in our group. The presence of thick plates in the experiments performed at 25 and 37ºC indicate that the self assembled plates can be formed by stacked layers. Circular structures of 30 nm were observed surrounding the plates but also closely associated with them. Their presence suggested that these structures are intermediates of the plate generation process. Taking into account that the nucleosome height is 11 nm and that there are no evidences that suggest the presence of nucleosome columns inside the plates, results indicate that nucleosomes are slightly inclined in the chromatin plates. In conclusion, the results obtained in this thesis suggest that there is an irregular orientation of the nucleosomes inside the chromatin plates. The interdigitation of adjacent layers allows face-to-face and lateral side-by-side interactions between nucleosomes of successive layers, which confers stability and compactness to the laminar structure. The metaphase chromatin tendency to generate multilayered stable structures after a self-assembly process suggests that chromatids are composed of chromatin folded in a laminar way

En el presente trabajo se han determinado las propiedades de la lipasa recombinante de Rhizopus oryzae contenida en un extracto proteico obtenido mediante el cultivo de Pichia pastoris (rROL). Posteriormente, se ha estudiado la inmovilización de la lipasa recombinante en soportes de diferente naturaleza, como son el polvo de polipropileno (EP100) y el Eupergit®. Con el objetivo de realizar una comparación, se realizaron los mismos estudios de caracterización e inmovilización con la lipasa nativa contenida en un extracto proteico obtenido del cultivo de Rhizopus oryzae (nROL). Los análisis de caracterización revelaron dos isoformas de la lipasa recombinante con idéntico N-terminal y con masas muy similares. Por otra parte, el extracto nativo mostró tres isoformas de nROL. En cuanto a los estudios de especificidad frente a triacilglicéridos, se determinó un comportamiento igual de nROL y rROL, mientras que con los análisis frente a ésteres de p-nitrofenol se dedujo la presencia de la esterasa en el extracto nativo. En los estudios de inmovilización, tanto nROL como rROL fueron hiperactivadas a ciertas relaciones de actividad ofrecidas por miligramo de soporte. Además, la estabilidad en función de la temperatura y el pH reveló que nROL es más estable que rROL tanto inmovilizada como en solución. Se estudió la síntesis de un aromatizante utilizándose tres derivados inmovilizados: rROL-EP100, rROL-Eupergit®CM y rROL-Sepabeads. Se analizó el efecto de diversas variables sobre la velocidad inicial de reacción y conversión final. El derivado que mostró unos mejores resultados fue el obtenido a partir del EP100 aunque rROL-Sepabeads fue el derivado inmovilizado más estable. Mediante la metodología de la superficie de respuesta, pudo analizarse el efecto de la concentración de ácido butírico y la relación molar butírico:etanol sobre la velocidad inicial de síntesis, la conversión y la producción. Los resultados de velocidad inicial y conversión mostraron un claro efecto inhibidor e inactivación a elevadas concentraciones de butírico. De igual modo un exceso de etanol también resultaba inhibidor. Las condiciones óptimas se determinaron en base a un modelo para maximizar la producción de butirato de etilo. Finalmente, rROL mostró capacidad catalítica en otras reacciones de interés industrial como son, la síntesis de la cortexolona-21-acetato, lípidos estructurados de baja carga calórica además de triacilglicéridos sustitutivos de las grasas presentes en leches maternas. / Extracts of mature Rhizopus oryzae lipase overexpressed in Pichia pastoris (rROL) and commercial ones from the native microorganism (nROL) have been characterized. Specific activity of rROL extract was more than 40 fold higher than nROL. The presences of multiple bands of lipases around 34 kDa were both extracts. The influence of ionic strength on optimum temperature and pH was also determined from both extracts, significant differences were observed. Finally, the specificity against triacylglycerol esters and p-nitrophenols esters was also analyzed. Similar behaviour was obtained in front of triacylglycerol esters; however rROL shown an opposite behaviour compared to nROL in front of p-nitrophenol esters with preferences for long chain derivatives because of the presence of an esterase in the commercial product. Two different kinds of support, the polypropylene powder EP100 and Eupergit®C, were tested to immobilize the enzymes. The study of the stability of soluble and immobilized enzymes was performed by means of the Box-Hunter experiment design. The stability of a soluble extracts as well as immobilized derivatives was analyzed and the studies showed higher stability or nROL. In order to apply rROL a flavour synthesis, it was immobilized in three different kinds of support (EP100, Eupergit®CM and Octadecyl-Sepabeads) with the aim of using it in the production of ethyl butyrate. The effect of different parameters on initial reaction rate and yield has been studied for each biocatalyst. The results showed the EP100 derivative as the best choice in terms of initial rate and yield but Sepabeads derivative was the most stable. Moreover, by means of a response surface methodology, the effect of butyric acid concentration and molar ratio butyric acid:ethanol on yield, initial synthesis rate and production was studied. An inhibitory effect as well as inactivation of the enzyme was detected at high concentration of butyric acid. The ethanol also showed an inhibitory effect. The optimum conditions were selected in order to maximise the production. Finally, rROL was used to synthesize cortexolone-21-acetate as well as different kinds of structured lipids, obtaining good results

La incidència d’infeccions gonocòciques i pneumocòciques roman alta en països en vies de desenvolupament i està augmentant a moltes parts del món. La necessitat de tractaments per a l’individu i per al control de la malaltia a nivel comunitàri és punyent però escollir el tractament adequat ha esdevingut complex com a conseqüència de la capacitat de Neisseria gonorrhoeae i Streptococcus pneumoniae de desenvolupar resistència envers antibiòtics. Aquesta tesi de doctorat investiga mecanismes relacionats amb la transferència genética horitzontal i amb l’arrest del creixement a N. gonorrhoeae and S. pneumoniae. La primera part de la tesi està dedicada a l’estudi de la transformació natural a N. gonorrhoeae i descriu els procediments que han portat a l’expressió, purificació i caracterització bioquímica de ComE, ComA i DprA, tres proteïnes que tenen un paper en la presa i el processament de DNA ambiental. La segona part de la tesi descriu la caracterització estructural mitjançant cristal·lografia de rajos X de RelBE2 de S. pneumoniae, un sistema toxina-antitoxina cromosòmic de tipus II que s’ha relacionat amb la moderació de la traducció i amb l’arrest del creixement en condicions d’escassetat de nutrients, i proposa un model per a la seva regulació. / The incidence of gonococcal and pneumococcal infections remains high in developing countries and is increasing in many parts of the world. The need not only for treatment of the individual but also for control of the diseases at a community level is acute but the selection of appropriate treatments has become a complicated issue by the ability of Neisseria gonorrhoeae and Streptococcus pneumoniae to develop resistance to antibiotics. This PhD thesis investigates mechanisms related to horizontal gene transfer and growth arrest in N. gonorrhoeae and S. pneumoniae. The first part of the thesis is devoted to the study of natural transformation in N. gonorrhoeae and describes the procedures that have lead to the expression, purification and biochemical characterization of ComE, ComA and DprA, three proteins involved in the uptake and processing of environmental DNA. The second part of the thesis describes the structural characterization by X-ray crystallography of S. pneumoniae RelBE2, a chromosomally-encoded type II toxin-antitoxin system that has been linked to translation moderation and growth arrest under starvation conditions, and proposes a model for its regulation.

Los inhibidores de peptidasas representan un mecanismo fisiológico para la regulación de las enzimas proteolíticas. Mientras que mayoría de los inhibidores monodominio tienen un único sitio reactivo mediante el cual interaccionan con sus peptidasas dianas de un tipo catalítico específico, algunos de ellos inhiben dos moléculas de peptidasa simultáneamente, dando lugar a la formación de complejos ternarios. Para estudiar este tipo de inhibidores se analizó la función de uno de ellos, sermetstatina. Este inhibidor forma un dímero que une fuertemente serín peptidasas y metalopeptidasas. La estructura del dímero de inhibidor fue determinada revelando que sermetstatina presenta una conformación en α/β-sándwich alargado constituido por cinco hebras β antiparalelas conectadas entre sí (β3-β2-β1-β4-β5; conectividad -1, -1, +3, +1) que dan lugar a una hoja β girada ∼30o, en cuya cara cóncava se acomodan dos hélices α (α1 y α2) y una hélice 310. Además, las estructuras de los complejos heterotetraméricos de sermetstatina con la serín peptidasa subtilisina y la metalopeptidasa esnapalisina fueron también determinadas, mostrando que la inhibición ocurre a través de lazos reactivos distales independientes. La interacción entre subtilisina y sermetstatina se produce mediante el lazo reactivo 2, posicionado adecuadamente por su hélice de anclaje, y la hendidura del centro activo de la enzima. El lazo se inserta a modo de cuña mimetizando un substrato en conformación extendida y canónica en la hendidura del centro activo de la enzima, siguiendo el mecanismo estándar de inhibición. Por otro lado, la interacción entre esnapalisina y sermetstatina se produce mediante el extremo N-terminal, el lazo reactivo 1, la hélice α1 y la región Lβ4β5 del inhibidor; y la hendidura del centro activo de la enzima y exositios presentes en la superficie de la proteasa. Este modo de inhibición sigue un mecanismo novedoso en inhibidores de metalopeptidasas, siendo este una reminiscencia distante del modo inhibitorio de los TIMPs en su unión con MMPs así como del modo inhibitorio del inhibidor de serralisina sobre la metalopeptidasa serralisina. Estas estructuras y el modelo del complejo heterohexamérico proporcionan por primera vez una visión detallada del mecanismo molecular de la inhibición simultánea de peptidasas pertenecientes a dos clases mecanísticamente diferentes por un inhibidor monodominio. En resumen, en el presente trabajo se ha determinado que sermetstatina es un inhibidor de doble faz genuino monodominio que ha evolucionado a partir de inhibidores de serín peptidasas de la familia MEROPS I16 con un único sitio reactivo que siguen el mecanismo estándar de inhibición. Dicha evolución ha dado lugar a una proteína bifuncional capaz de inhibir simultáneamente diferentes serín peptidasas y una metalopeptidasa específica a través de dos sitios reactivos distales compatibles. / Protein inhibitors provide a physiological mechanism for the regulation of proteolytic enzymes. While most single-domain inhibitors have one reactive site with which they target peptidases of a specific catalytic class, selected specimens inhibit two peptidase molecules simultaneously, thus giving rise to ternary complexes. To study such inhibition, the function of one of these proteins, sermetstatin, was analyzed. This inhibitor strongly binds as a dimer to serine peptidases and a metallopeptidase. The structure of the isolated inhibitor dimer was determined revealing that sermetstatin is an elongated α/β-sandwich. It consists of a five-stranded antiparallel β-sheet (β3-β2-β1-β4-β5; connectivity -1,-1,+3,+1) twisted by ∼30o, whose concave face accommodates two α-helices (α1 and α2) and a 310-helix. In addition, the structures of the heterotetrameric complexes with the serine peptidase subtilisin and the metallopeptidase snapalysin were equally determined, showing that inhibition occurs through two independent distal reactive sites. The subtilisin-sermetstatin interaction is made by reactive-site loop 2, adequately positioned by its scaffold helix, and the active-site cleft of the enzyme. The loop is inserted wedge-like mimicking a substrate in extended, “canonical” conformation in the active-site cleft of the enzyme following the “standard mechanism”. On the other hand, the snapalysin-sermetstatin interaction involves the N-terminal tail, reactive site loop 1, helix α1 and Lβ4β5 of the inhibitor; and the active-site cleft of the enzyme and some exosites on the protease surface. This inhibition modus follows a novel mechanism for metallopeptidase inhibitors only distantly reminiscent of the inhibitory mode of tissue inhibitors of metalloproteinases on their target matrix metalloproteinases and of serralysin inhibitors on their cognate serralysin MPs. These structures and the derived model for the heterohexameric complex provide for the first time a detailed view of the molecular mechanism of simultaneous inhibition of proteinases belonging to two distinct mechanistic classes by a single-domain protein. In summary, it was determined that sermetstatin is a genuine Janus-faced single-domain inhibitor which has evolved from single-site standard-mechanism serine peptidase inhibitors of family I16 to give a protein capable of simultaneous inhibition of serine peptidase in general and a specific metallopeptidase through distinct but compatible sites.