Una de les accepcions de la farmacogenòmica es l'estudi dels efectes d'un tractament farmacològic sobre els nivells d'expressió gènica. Aquesta estratègia inclou la identificació de les variacions de gens individuals, l'avaluació de les interaccions entre els seus productes i la caracterització dels fenotips derivats de la resposta al fàrmac El metotrexat (MTX) és un fàrmac inhibidor de l'enzim dihidrofolat reductasa (DHFR) utilitzat en el tractament del càncer. El treball presentat en aquesta memòria es troba emmarcat dins de l'estudi de l'expressió gènica diferencial derivada de la resistència al MTX i pretén identificar aquells canvis adaptatius que tenen lloc en les cèl•lules sota tractaments perllongats amb el MTX. Alguns d’aquests gens diferencialment expressats poden contribuir a la resistència al fàrmac. Així doncs, s'identifica el gen S100A4 com a diana diferencialment expressada en 5 de les 7 línies cel•lulars resistents a MTX estudiades, i en cèl•lules de càncer de còlon HT-29, la via de Wnt sembla ser la responsable d’aquesta sobrexpressió. També en cèl•lules HT-29, la disminució dels nivells de proteïna S100A4 contribueix a augmentar la sensibilitat cap al MTX, fet que evidencia el paper important de la sobrexpressió de S100A4 en la resistència al MTX. En els últims anys s'ha descobert que les seqüències codificants representen només el 2% de tot el genoma i que la major part és transcrita com a molècules de RNA que no codifiquen per cap proteïna. Això implica que el que abans es considerava com a "junk DNA", en realitat és transcrit donant molècules de RNA reguladores de múltiples processos cel•lulars. Un dels tipus de RNAs no codificants més estudiats són els microRNAs (miRNAs). Actualment hi ha una extensa quantitat d'informació que descriu un clar paper dels miRNAs en tots els passos del desenvolupament del càncer, així com altres malalties. També s'estudia el paper dels microRNAs (miRNAs) en la resistència al MTX en cèl•lules de càncer de còlon. Els resultats presentats identifiquen el miR-224 i els seus gens diana, SLC4A4, CDS2 i HSPC159 com a dianes importants en la resistència al MTX en càncer de còlon. La reducció dels nivells del miR-224, acompanyada de l’augment dels seus gens diana CDS2, HSPC159 i SLC4A4, comporta una insensibilització cap al MTX, de manera que s’afavoreix la resistència al fàrmac. A més, es presenten altres miRNAs identificats com a sobrexpressats en la mateixa línia cel•lular de càncer de còlon (miR-149, miR-193b, miR-210, miR-27b, miR-320, miR-361-5p, miR-365, miR-455-3p i miR-615-3p) i s'identifiquen els gens diana putatius per a cadascun d'aquests miRNAs. La identificació dels gens diana per un determinat miRNA es realitza mitjançant algoritmes bioinformàtics que requereixen validació experimental. La interacció d’un miRNA amb el seu gen diana s’acostuma a estudiar mitjançant la co-transfecció del miRNA amb un vector reporter que contingui la regió 3’-UTR del gen. Tot i que aquest mètode suggereix una interacció física i funcional, no prova la interacció del miRNA amb el seu gen diana de forma directa. Finalment, es presenten resultats que demostren que els assajos de canvi de la mobilitat electroforètica (EMSA) constitueixen un mètode alternatiu per confirmar de manera directa i específica si un miRNA s’uneix o no al seu mRNA diana. / Pharmacogenomics study the effects of a drug on the expression levels of the genes. This strategy includes the identification of changes in individual genes, evaluating the interactions between their products and the characterization of phenotypes resulting from the response to the drug Methotrexate (MTX) is an inhibitor of the enzyme dihydrofolate reductase (DHFR) used in the treatment of cancer. The work presented in this report studies gene expression patterns derived from MTX resistance and seeks to identify the adaptive changes that occur in cells under prolonged treatment with MTX. Some of these differentially expressed genes may contribute to drug resistance. S100A4 was identified as a target gene overexpressed in 5 out of the 7 studied cell lines resistant to MTX. In HT-29 colon cancer cells, the Wnt signaling pathway appears to be responsible this overexpression. Also in HT-29 cells, S100A4 reduced protein levels contribute to increased sensitivity to MTX, which shows the important role of S100A4 overexpression on MTX resistance. MiRNAs are small non-coding RNAs that negatively regulate gene expression. There is an extensive amount of information that clearly describes the role of miRNAs in all stages of development of cancer as well as other diseases. It is also studied the role of microRNAs (miRNAs) in MTX resistance in colon cancer cells. The results presented identify the under expression of miR-224 and, therefore, the overexpression of its target genes, SLC4A4, and HSPC159 CDS2 as important targets for MTX resistance in colon cancer cells. The reduced levels of miR-224, accompanied by the increase of its target genes CDS2, HSPC159 and SLC4A4 lead to a desensitization toward MTX, which favors the drug resistance. Furthermore, the results identify a group of overexpressed miRNAs in the same colon cancer cell line (miR-149, miR-193b, miR-210, miR-27b, miR-320, miR-361-5p, miR -365, miR-455-3p and miR-615-3p) and the putative target genes for each of these miRNAs are predicted. Finally, we present results of tests showing that electrophoretic mobility shift (EMSA) are an alternative method to confirm directly and specifically whether or not miRNA binds to its mRNA target.

Plasmonics nanostructures are becoming remarkably important as tools towards manipulating photons at the nanoscale. They are poised to revolutionize a wide range of applications ranging from integrated optical circuits, photovoltaics, and biosensing. They enable miniaturization of optical components beyond the "diffraction limit'' as they convert optical radiation into highly confined electromagnetic near-fields in the vicinity of subwavelength metallic structures due to excitation of surface plasmons (SPs). These strong electromagnetic fields generated at the plasmonic "hot spots'' raise exciting prospects in terms of driving nonlinear effects in active media. The area of active plasmonics aims at the modulation of SPs supported at the interface of a metal and a nonlinear material by an external control signal. The nonlinear material changes its refractive index under an applied control signal, thereby resulting in an overall altered plasmonic response. Such hybrid nanostructures also allow for the creation of new kinds of hybrid states. This not only provides tools for designing active plasmonic devices, but is also a means of re-examining existing conventional rules of light-matter interactions. Therefore, the need for studying such hybrid plasmonic nanostructures both theoretically and experimentally cannot be understated. The present work seeks to advance and study the control of SPs excited in hybrid systems combining active materials and nanometallics, by an external optical signal or an applied voltage. Different types of plasmonic geometries have been explored via modeling tools such as frequency domain methods, and further investigated experimentally using both near-field and far field techniques such as scanning near field optical microscopy and leakage radiation microscopy respectively. First, passive SP elements were studied, such as the dielectric plasmonic mirrors that demonstrate the ability of gratings made of dielectric ridges placed on top of flat metal layers to open gaps in the dispersion relation of surface plasmon polaritons (SPPs). The results show very good reflecting properties of these mirrors for a propagating SPP whose wavelength is inside the gap. Another passive configuration employed was a plasmonic resonator consisting of dielectric-loaded surface plasmon polariton waveguide ring resonator (WRR). Also, a more robust variant has been proposed by replacing the ring in the WRR with a disk (WDR). The performance in terms of wavelength selectivity and efficiency of the WDRs was evaluated and was shown to be in good agreement with numerical results. Control of SPP signal was demonstrated in the WRR configuration both electro-optically and all-optically. In the case of electro-optical control, the dielectric host matrix was doped with an electro-optical material and combined with an appropriate set of planar electrodes. A 16% relative change of transmission upon application of a controlled electric field was measured. For all-optical control, nonlinearity based on trans-cis isomerization in a polymer material is utilized. More than a 3-fold change between high and low transmission states of the device at milliwatt control powers ( ~100 W/cm^2 intensity) was observed. Beyond the active control of propagating surface plasmons, further advancement can be achieved by means of nanoscale plasmonic structures supporting localized surface plasmons (LSP). Interactions of molecular excitations in a pi-conjugated polymer with plasmonic polarizations are investigated in hybrid plasmonic cavities. Insights into the fundamentals of enhanced light-matter interactions in hybrid subwavelength structures with extreme light concentration are drawn, using ultrafast pump-probe spectroscopy. This thesis also gives an overview of the challenges and opportunities that hybrid plasmonic functionalities provide in the field of plasmon nano optics. / Las nanoestructuras plasmónicas han adquirido una importante relevancia como herramientas capaces de manipular los fotones en la nanoescala, y pueden llegar a revolucionar un amplio abanico de aplicaciones tales como los circuitos ópticos integrados, la fotovoltaica o los dispositivos biosensores. Dichas estructuras hacen posible la miniaturización de los componentes ópticos más allá del “límite de difracción” de la luz, ya que convierten la radiación óptica en campos electromagnéticos fuertemente confinados en la proximidad de estructuras metálicas de tamaño inferior a la longitud de onda mediante la excitación de plasmones de superficie (SPs). Estos campos electromagnéticos tan intensos generados en los llamados “puntos calientes” plasmónicos brindan perspectivas muy interesantes para la generación de efectos no lineales en medios activos. El área de investigación denominado plasmónica activa busca la modulación de los SPs sostenidos por la intercara entre un metal y un material no lineal mediante una señal de control externa. El índice de refracción del material no lineal cambia bajo la aplicación de la señal de control, lo cual da lugar a la modificación de la respuesta plasmónica. Estas nanoestructuras híbridas también hacen posible la aparición de nuevos tipos de estados híbridos, lo cual proporciona tanto herramientas para diseñar dispositivos plasmónicos activos como mecanismos que permiten re-examinar las reglas convencionales de la interacción luz materia. Por lo tanto, es necesario el estudio de dichas nanoestructuras plasmónicas híbridas de manera teórica y experimental. En este trabajo de tesis se analiza el control de los SPs excitados en sistemas híbridos que combinan materiales activos y nanoestructuras metálicas mediante una señal óptica externa o un voltaje aplicado. Se han investigado distintos tipos de geometrías plasmónicas utilizando herramientas de simulación basadas en métodos en el dominio de la frecuencia, y posteriormente se han caracterizado experimentalmente dichas geometrías mediante técnicas de campo cercano y de campo lejano tales como la microscopía óptica de campo cercano y la microscopía basada en pérdidas radiativas, respectivamente. En primer lugar se estudiaron elementos plasmónicos pasivos, en particular espejos plasmónicos dieléctricos que demuestran la capacidad que tienen las redes periódicas de caballones de material dieléctrico colocados sobre una superficie metálica plana para abrir intervalos prohibidos en la relación de dispersión de los plasmones de superficie propagantes o plasmones-polaritones de superficie (SPPs). Los resultados muestran que dichos espejos poseen muy buenas propiedades reflectantes para SPPs cuya energía está en el intervalo prohibido. Otra configuración pasiva analizada fueron los resonadores plasmónicos basados en anillos de guía de onda plasmónica fabricada a partir de estructuras dieléctricas sobre metal (WRR, del inglés waveguide ring resonator ). Asimismo, se propone una versión más robusta de resonador plasmónico, basada en la sustitución del anillo del WRR por un disco (WDR, del inglés waveguide disk resonator). Se ha evaluado el funcionamiento de los WDRs en términos de selectividad en longitud de onda y de eficiencia, y los resultados obtenidos presentan un buen acuerdo con las predicciones numéricas. Pasando a las configuraciones activas, se demuestra el control de la señal plasmónica en configuración WRR por medios tanto electro-ópticos como completamente ópticos. En el caso del control electro-óptico, el material dieléctrico que compone el WRR estaba dopado con un componente electro-óptico y a la estructura pasiva se le añadió un conjunto de electrodos planos. Bajo la aplicación de un campo eléctrico externo, se midió un cambio relativo en la transmisión a través de la guía plasmónica del 16%. En cuanto al control puramente óptico, se utilizó la no linealidad de un material polimérico con origen en una isomerización trans-cis. En este caso se detectó un factor 3 entre los estados de alta y baja transmisión del dispositivo con potencias de control del orden de milivatios (intensidad del haz óptico de control de unos 100W/cm2 aproximadamente). Además del control activo de los plasmones de superficie propagantes, la utilización de nanoestructuras plasmónicas que poseen resonancias plasmónicas localizadas puede dar lugar a nuevos fenómenos. En esta tesis también se han estudiado las interacciones entre las excitaciones moleculares en un polímero pi-congujado con las polarizaciones plasmónicas en nanocavidades plasmónicas híbridas. Utilizando espectroscopia de tipo bombeo-sonda con pulsos ultrarrápidos, se han analizado diversos aspectos del aumento en la interacción luz-materia para estructuras híbridas de dimensiones inferiores a la longitud de onda sometidas a concentraciones de luz muy altas. Por último, esta tesis también proporciona una visión general de los desafíos y posibilidades que las funcionalidades plasmónicas híbridas ofrecen en el campo de la nano-óptica basada en plasmones de superfície.

Els receptors acoblats a proteïna G són una família de proteïnes de membrana que està implicada en moltes malalties d'una gran importancia en la nostra societat actual. Degut a la manca d'estructures tridimensionals d'aquests receptors s'ha desenvolupat un protocol per tal d'estudiar-los in silico. Aquest protocol utilitza les simulacions de dinàmica molecular per a estudiar l'estructura i la funció dels GPCRs tot tenint en compte l'entorn hidrofòbic de la bicapa lipídica en el que es troben i l'efecte dels residus de serina i treonina en la conformació de les hèlixs alfa d'aquests receptors. A partir del protocol s'ha construit i validat a través del disseny racional de fàrmacs un model tridimensional per receptor 5-HT1A que a més a més és vàlid per a la majoria dels receptors de les amines biogèniques. Aquest model s'ha utilitzat per a identificar el mode d'unió dels receptors serotoninèrgics amb els seus lligands. La modelitzaió del mode d'unió dels receptors amb els seus lligans ha permès el disseny de nous lligands amb més afinitat i selectivitat. Tot el treball computacional s'ha validat a través de la síntesi i avaluació farmacològica dels lligands així com amb experiments de mutagènesi dirigida. / G-protein coupled receptors (GPCRs) are membrane proteins that transduce and amplify extracellular chemical signals to the interior of the cell. Due to its prominent role in cell signalling, GPCR malfunction is involved in a wide variety of diseases. Because of the lack of X-ray resolved GPCR structures, this thesis presents a protocol to study the structure and function of these proteins in silico. This protocol is based on molecular dynamics simulations, and takes into account explicitly the hydrophobic environment of the receptors due to the surrounding cellular membrane. In addition, it considers the influence of serine and threonine residues in the global conformation of the hydrophobic transmembrane alpha-helices that constitute the structural feature common to all GPCRs. Based on this protocol, a three dimensional model for 5-HT1A receptor has been constructed, which is valid for most of the biogenic amine receptor family. The computational models of the binding site of serotoninergic receptors have been validated through the synthesis and pharmacological evaluation of new ligands, and through site-directed mutagenesis experiments. This way, these three-dimensional models have allowed to identify and characterize the binding site of the serotoninergic receptors 5-HT1A, 5-HT4 and 5-HT7, and to design new ligands with improved affinity and selectivity for these receptors.

En aquesta tesi s'apliquen eines bioinformàtiques a l'estudi de determinats sistemes biològics. En particular, l'estudi teòric de la influència de determinats aminoàcids sobre l'estructura i la dinàmica dels elements d'estructura secundària de les proteïnes s'aplica a la modelització per homologia dels receptors acoblats a proteïna G (GPCRs) i a l'estudi dels seus mecanismes d'activació.Se sap que determinats residus, com prolina, serina o treonina, provoquen distorsions locals en l'estructura de les hèlices a. L'anàlisi de bases de dades de seqüències de segments transmembrana mostra com certes combinacions d'aquests residus són més comunes que d'altres, i que algunes d'elles estan sobre-representades de manera significativa, mentre que d'altres estan clarament sots-representades. La restricció d'aquesta anàlisi de seqüències a la regió transmembrana dels GPCRs de la Classe A mostra com aquestes combinacions es troben en posicions específiques i, a més, es troben conservades en certes subfamílies de receptors.L'estructura i la dinàmica de les hèlices transmembrana que contenen aquestes combinacions de prolina i serina o treonina s'han estudiat mitjançant simulacions de dinàmica molecular en un entorn hidrofòbic explícit. Els resultats mostren com algunes d'aquestes combinacions indueixen distorsions importants en l'estructura de l'hèlix a, degut al seu efecte desestabilitzador de la xarxa de ponts d'hidrogen que dóna estabilitat a l'hèlix.Aquests resultats s'han aplicat a la construcció d'un model tridimensional del receptor de quimiocines CCR5 , utilitzant tècniques de modelització molecular per homologia. En aquest model es proposa que les hèlices transmembrana (TMH) 2 i 3 del receptor CCR5 són estructuralment diferents del patró de rodopsina. TMH2 està més doblegada degut a la presència d'un motiu Thr-X-Pro, que, a més, fa que aquesta hèlix es doblegui cap a TMH3. Així doncs, es proposa que, en aquest receptor, aquestes dues hèlices interaccionen. Aquesta interacció estaria mediada per la presència de residus hidrofòbics conservats i específics en les dues hèlices. Aquestes hipòtesis han estat posades a prova mitjançant experiments de mutagènesi dirigida, gràcies a la col·laboració amb l'Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Nucléaire (IRIBHN), Université Libre de Bruxelles. Els resultats experimentals permeten establir la hipòtesi que la interfície TMH2-TMH3 participa en l'activació induïda per quimiocines del receptor CCR5.Com a conclusió, aquesta tesi pretén mostrar com, mitjançant la utilització d'eines bioinformàtiques, és possible traduir les seqüències primàries de proteïnes i les interaccions a nivell atòmic en estructures tridimensionals de proteïnes. A més, aquesta tesi mostra que, encara que l'estructura tridimensional de la rodopsina bovina és un patró útil per la modelització per homologia de GPCRs, s'han de tenir en compte de manera explícita les especificitats de seqüència de cada receptor per tal de construir models de receptors particulars. Aquestes especificitats de seqüència consisteixen en patrons de seqüència conservats en determinades famílies, que es tradueixen en divergències estructurals. Entre aquests patrons de seqüència, es proposa que els residus de serina i treonina, sols o combinats amb residus de prolina propers, poden modular la geometria de les TMHs, degut a la seva capacitat d'interferir amb la xarxa de ponts d'hidrogen que dóna estabilitat a les hèlices a.Finalment, es proposa que la influència dels motius de serina, treonina i prolina en l'estructura de les TMHs pot estar relacionada amb els processos d'activació dels GPCRs de la Classe A i, possiblement, d'altres proteïnes de membrana. En els GPCRs, aquests motius poden haver evolucionat per tal d'adaptar uns mecanismes d'activació conservats als lligands característics de cada família de receptors. / This thesis is framed in the study of particular biological systems through the use of bioinformatics. In particular, the theoretical study of the influence of certain amino acids on the structure and dynamics of the secondary structure elements of proteins has been applied to homology modelling of G protein-coupled receptors (GPCRs) and to the study of their mechanisms of activation.Certain residues, as proline, serine or threonine, are known to induce local distortions in the a-helical structure. Analysis of sequence databases of transmembrane segments evidence that certain combinations of these residues are more common than others, and that some of them are significantly over-represented, while others are clearly under-represented. The focusing this sequence analysis on the transmembrane region of Class A GPCRs illustrates that these combinations are located in some specific locations and conserved within certain subfamilies of receptors.The structure and dynamics of transmembrane a-helices containing these combinations of proline and serine or threonine have been studied using molecular dynamics simulations in an explicit hydrophobic environment. The results show how some of these combinations induce significant distortions in the a-helical structure, due to their effect on the hydrogen bond network that stabilizes the helix.These results have been applied to the building of a three-dimensional model of the chemokine CCR5 receptor, using homology modelling techniques. In this model, transmembrane helices (TMH) 2 and 3 of CCR5 are proposed to be different from the bovine rhodopsin template. TMH2 is more bent due to the presence of a Thr-X-Pro motif, which, in turn, induces this helix to lean towards TMH3. As a consequence, an interaction between these two helices is proposed for this particular receptor. This interaction would be mediated through the presence of specific and conserved hydrophobic and aromatic residues in both helices. These hypothesis have been tested through site-directed mutagenesis experiments, thanks to a collaboration with the Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Nucléaire (IRIBHN), Université Libre de Bruxelles. The experimental results let us to hypothesize that the TMH2-TMH3 interface is involved in the chemokine-induced activation of the CCR5 receptor.As a conclusion, this thesis aims to show how through the use of bioinformatics tools, primary sequences of proteins and interactions at an atomic level can be translated to three-dimensional protein structures. In addition, this thesis illustrates that, even though the three-dimensional structure of bovine rhodopsin is a very useful template for homology modelling of GPCRs, the sequence specificities of each receptor have to be explicitly taken into account in order to build models. These sequence specificities consist in sequence patterns conserved within certain families, which are translated into structural divergences. Among these sequence patterns, we hypothesize that serine and threonine, alone or combined with nearby proline residues, can modulate the geometry of TMHs, due to its capability to interfere with the hydrogen bond network that stabilize a-helices.Finally, we propose that the influence of serine, threonine and proline motifs in the structure of TMHs may be related to processes of activation in the Class A of GPCRs, and, possibly, other membrane proteins as well. In GPCRs, these motifs may have evolved in order to adapt a conserved mechanism of activation of the G protein to the cognate ligands of each receptor family.

Carbohydrates had historically been associated to two biological functions: energy storage and structural support. However, in the last decades, new complex structures of oligosaccharides have been found to play vital roles in many biological processes, such as signal transduction, immune response, cell differentiation and cancer development, among others. Advances in the functional understanding of carbohydrate-protein interactions represented a breakthrough in the field of glycobiology and glycochemistry, opening a new branch of potential therapeutic targets (carbohydrate acting enzymes), glycomimetic drugs and biomarkers. The bottleneck in the field of glycochemistry is the synthesis of complex saccharides; hence many efforts have been devoted to the development of novel enzymatic strategies for carbohydrate synthesis. Glycoside transferases (GT) and glycoside hydrolases (GH) are the enzymes that catalyze the formation and the cleavage of the glycosidic linkage respectively. They are used in complex oligosaccharides synthesis, and recently they have been engineered to produce enzymes with particular substrate specificities or even activities. In spite of these advances, the understanding of the molecular mechanisms of enzymatic carbohydrate synthesis and degradation is far from complete. Structural studies have shown that the puckering of the sugar ring at the cleavage point must change during catalysis. Knowing the conformational catalytic itinerary has an impact in the design of GHs inhibitors. However, these itineraries are not known for all families of GHs. On the other hand, the saccharide puckering is not an issue in GTs, but the reaction mechanism is not known. In fact, the glycosidic bond formation in GTs remains one of the most intriguing and unanswered questions in the field of glycobiology. The coming of age of powerful theoretical methods such as quantum mechanics / molecular mechanics (QM/MM) and ab initio molecular dynamics (AIMD) has enabled the elucidation of complex reactive processes in proteins and enzymes. In particular, the modeling of the Michaelis complex and the reaction mechanisms of GHs highlighted the interplay between electronic and structural changes that preactivate the substrate for catalysis. Some of these changes can already be anticipated by analyzing the conformational energy landscape of the substrate. Part of the research of this Thesis complements previous studies of our group by analyzing the factors that govern substrate distortion in GHs. In this respect, it extends the use of conformational free energy landscapes of simple sugars to predict the conformation of the substrate in Michalis complexes. Additionally, the molecular mechanism of retaining glycoside transferases is elucidated. This Thesis is organized as follows: Chapter I contains an introduction of the enzymes studied (GHs and GTs) and presents the main objectives of this work. The theoretical methods used are detailed in Chapter II. Chapters III to V are focused on enzyme-substrate interactions affecting the conformation of the substrate in GHs. Concretely; in Chapter III we test how mutation of the acid/base catalytic residue, the use of a substrate-like thio-analogue inhibitor or fluorometric aglycons affects the distortion of the substrate. In Chapter IV we study the influence of the enzyme-substrate interactions through the 2-OH, in particular the effect of the commonly used 2-deoxy-2-fluoro substitution. The conformational itinerary of this inhibitor during catalysis is modeled in Chapter V. In Chapter VI, the conformational flexibility of β-D-mannopyranose and α-L-fucopyranose molecules is investigated. The topologies of their corresponding conformational free energy landscapes are related with the observed crystallographic structures of β-mannosidases and α-fucosidases, and the predictive potential of such calculations is discussed. Chapter VII focuses on trehalose 6-phosphate synthase (a family 20 retaining GT that belongs to fold type B). The mechanism of glycosidic bond formation in this enzyme is elucidated. Finally, in Chapter VI, the main conclusions of this work are summarized.

El cáncer de mama es una enfermedad con elevada incidencia, prevalencia y mortalidad que puede estar influida por factores nutricionales, entre los que destacan los lípidos de la dieta. A su vez, en cáncer se han descrito alteraciones del epigenoma. Los patrones epigenéticos son susceptibles de ser modificadas por factores ambientales. Así, el objetivo del presente trabajo ha sido definir cambios epigenéticos implicados en el desarrollo del cáncer de mama, así como determinar si el estilo de vida, y especialmente los hábitos dietéticos en relación al consumo de lípidos, influyen en este tipo de neoplasia a través de la alteración de patrones epigenéticos. Dicho objetivo se ha desarrollado en dos líneas de investigación, una en cáncer de mama humano y otra en cáncer de mama experimental. El estudio en humanos se ha realizado en una población de mujeres sanas y de enfermas de cáncer de mama, caracterizadas a nivel clínico y de estilo de vida, a partir de muestras de sangre periférica de las sanas y de sangre periférica, glándula mamaria y tumor de las enfermas. En dichas muestras se determinó la metilación del ADN a nivel global y de un panel de 12 genes implicados en los “hallmarks” del cáncer (BRCA1, p16, RARβ2, ESR1, PGR, RASSF1A, NES1, TWIST1, MASPINA, CDH1, CXCL12 y HLA-A). Por su parte, el estudio experimental se ha desarrollado en el modelo de cáncer de mama inducido con DMBA en la rata Sprague-Dawley, a partir de muestras de glándula mamaria y tumor de animales alimentados con diferentes dietas hiperlipídicas (rica en aceite de maíz o rica en aceite de oliva virgen extra). Por lo que respecta al efecto del cáncer sobre los patrones epigenéticos, los resultados obtenidos mostraron que la influencia que ejerce la propia enfermedad sobre el epigenoma alteraría mecanismos epigenéticos comunes, en términos generales, entre el cáncer de mama humano y el experimental. Estas alteraciones se caracterizarían, entre otras, por el incremento de la metilación gen-específica asociado a un aumento de la actividad ADN metiltransferasa, la disminución de la expresión de genes supresores tumorales (RASSF1A y TIMP3) y la alteración de modificaciones postraduccionales de las histonas (H3K4me2, H3K27me3, H4K20me3 y H4K16ac). Estos cambios, además, podrían estar influidos por factores dietéticos y de estilo de vida, como el consumo de alcohol, la realización de actividad física, la ingesta calórica total así como de proteínas y vitaminas B2, B6 y B12 y, especialmente, de lípidos (tanto en cantidad total como en función del tipo). Asimismo, la influencia de estos y otros factores de riesgo relacionados con la reproducción sobre el desarrollo de cáncer de mama, tales como la edad en la primera gestación y de aparición de la menopausia, podría ser, entre otros mecanismos, a través de la alteración de los patrones epigenéticos. El interés de hallar que determinados factores de riesgo, incluido el estilo de vida, alteran dichos patrones se basa en que los mecanismos epigenéticos, a diferencia de los genéticos, son modificables. Así, los resultados del presente trabajo permiten formular opiniones científicas sobre la importancia que tienen los hábitos dietéticos y el estilo de vida en relación a la salud o al riesgo de enfermedad. En este sentido, se podrían definir factores de riesgo y/o protectores a los que está sometida la población en base a sus hábitos alimenticios en relación al consumo de grasas. Por todo ello, este trabajo en su conjunto se enmarcaría en el campo de la prevención primaria y secundaria del cáncer de mama. / Breast cancer is a disease with high incidence, prevalence and mortality, that may be influenced by nutritional factors, and especially dietary lipids. Furthermore, disruption of epigenome is a major change occurring in all types of cancers. Epigenetic patterns are reversible and may be modified by environmental factors. Thus, the aim of this study was to define epigenetic changes involved in breast cancer and determine if lifestyle, particularly dietary habits in relation to fat intake, influence this type of neoplasia through the alteration of epigenetic patterns. This objective has been developed in two lines of research, one in human breast cancer and the other in an experimental model of breast cancer. The human study was conducted in a population of healthy volunteers and breast cancer patients, who were characterized clinically and in which we evaluated their lifestyle. We obtained blood from healthy volunteers and blood, mammary gland and tumor from breast cancer patients. In such samples we determined global DNA methylation and gene-specific methylation of a panel of 12 genes with an important role on the key hallmarks of cancer (BRCA1, p16, RARβ2, ESR1, PGR, RASSF1A, NES1, TWIST1, MASPINA, CDH1, CXCL12 and HLA-A). On the other hand, the experimental study was developed in the rat dimethylbenz(a)anthracene (DMBA)-induced breast cancer model, using samples from mammary gland and tumor from animals fed different high fat diets (rich in corn oil or in extra virgin olive oil). In relation to the effect of cancer on the epigenetic patterns, the results showed that the influence of the disease on the epigenome alter common epigenetic mechanisms, in general, in human and experimental breast cancer. These alterations would be characterized, among others, by the increase of gene-specific DNA methylation associated with an increase in DNA methyltransferase activity, the decrease of tumor-suppressor genes expression and the alteration of post-translational histone modifications (H3K4me2, H3K27me3, H4K20me3 and H4K16ac). These changes could be influenced by dietary and lifestyle factors, such as alcohol consumption, physical activity, calorie intake, protein and vitamins B2, B6 and B12 consumption, and especially lipid intake (including total amount and type of lipid). In addition, the influence on the development of breast cancer of these and other risk factors related to reproduction, such as age at first pregnancy and onset of menopause, could be done, among other mechanisms, through the alteration of epigenetic patterns. Finding that certain risk factors, including lifestyle, alter these patterns is of interest since epigenetic mechanisms, unlike genetic, are modifiable. Thus, the results of this study allow to formulate scientific opinions about the importance of dietary habits and lifestyle in relation to health or disease risk. In this sense, they could be defined risk and/or protective factors to which the population is exposed based on their dietary habits in relation to fat intake. Therefore, this work as a whole would be framed in the field of primary and secondary prevention of breast cancer.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Bioquímica / La Enzima Convertidora de Endotelina - 1c (ECE-1c) es una metaloproteasa de membrana que participa en la síntesis de Endotelina-1 y se ha demostrado que tiene un rol en invasión en cáncer de mama, ovario y próstata. La región N-terminal de ECE-1c posee tres sitios putativos de fosforilación por la proteína kinasa CK2. En esta tesis se estudió la fosforilación de ECE-1c por CK2 y cómo esto afecta la migración e invasión celular en un modelo de cáncer de colon. La hipótesis de esta tesis fue “La proteína kinasa CK2 fosforila y estabiliza a ECE-1c, promoviendo la invasividad de células de cáncer colorrectal”. El objetivo general fue determinar si la proteína kinasa CK2 fosforila a ECE-1c en su extremo N-terminal afectando su estabilidad y si esto tiene un efecto en el potencial invasivo de células de cáncer colorrectal. Para responder a esto se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1. Determinar si CK2 fosforila a ECE-1c en su región N-terminal in vitro y en líneas celulares de cáncer colorrectal; 2. Estudiar si CK2 regula mediante fosforilación la estabilidad ECE-1c en células no tumorales y de cáncer colorrectal; y 3. Evaluar si CK2 regula vía ECE-1c la migración e invasividad in vitro de células de cáncer colorrectal. Un análisis in silico mostró que la región N-terminal de ECE-1c contiene tres sitios putativos de fosforilación por CK2: Thr9, Ser18 y Ser20. En base a este antecedente se realizaron ensayos in vitro utilizando ATP radiactivo y la región N-terminal de ECE-1c fusionada a GST como sustrato, mostrando que CK2 es capaz de fosforilar dicha región. Estos resultados fueron confirmados al analizar los sustratos fosforilados con espectrometría de masas, mostrando que los residuos fosforilados in vitro fueron Ser18 y Ser20. Para demostrar si la fosforilación ocurre en un contexto celular, se inmunoprecipitó ECE-1 en tratamiento con el inhibidor de CK2, TBB, desde células de cáncer de colon DLD-1. La marca de fosforilación se detectó con un anticuerpo antifosfo-S/T/Y, mostrando que la inhibición de CK2 disminuye la marca de fosforilación de ECE-1 total. Posteriormente se evaluó si los niveles de ECE-1 eran afectados por la inhibición de CK2 en células embrionarias HEK-293T y de cáncer de colon DLD- 1. Tal como se esperaba, la inhibición de CK2 utilizando TBB o CX-4945 disminuyó los niveles proteicos de la ECE-1 endógena y de la región N-terminal de ECE-1c fusionada a GFP en ambas líneas celulares. Adicionalmente, se realizaron ensayos de estabilidad proteica utilizando cicloheximida y se mostró que la inhibición de CK2 con TBB disminuyó la estabilidad de la región N-terminal de ECE-1c fusionada a GFP en células embrionarias HEK-293T y de cáncer de colon DLD-1. Por otro lado, las mutantes de ECE-1c fosfomimética (DDD) y no fosforilable (AAA) por CK2 expresadas en células CHO-K1, demostraron tener mayor y menor estabilidad proteica, respectivamente. Finalmente, ensayos funcionales de migración-3D e invasión celular utilizando cámaras de transwell/matrigel, mostraron que ECE-1c es capaz de aumentar el potencial migratorio/invasivo de células de cáncer de colon DLD-1. Además, la sobreexpresión de la mutante no fosforilable por CK2 (AAA) no fue capaz de modificar la capacidad migratoria ni invasiva de esta línea celular. En conclusión, estos resultados sugieren que CK2, por fosforilación en el extremo N-terminal, aumenta la estabilidad de ECE-1c, lo que conduce a un aumento en la invasión de células de cáncer de colon. Estos hallazgos dan luces de un nuevo mecanismo por el cual CK2 promueve la progresión maligna de esta devastadora enfermedad / Endothelin Converting Enzyme - 1c (ECE-1c) is a membrane metalloprotease involved in endothelin-1 synthesis and has been shown to have a role in invasion promotion in breast, ovarian and prostate cancer. N-terminal region of ECE-1c has three putative phosphorylation sites for CK2. In this thesis, we studied whether ECE-1c phosphorylation by CK2 affects cell migration and invasion in a colon cancer model. The hypothesis of this thesis was "CK2 protein kinase phosphorylates and stabilizes ECE-1c, thereby promoting invasiveness of colorectal cancer cells." The overall objective was to determine whether CK2 protein kinase phosphorylates ECE-1c at its N-terminal affecting its stability and whether this has an effect on the invasive potential of colorectal cancer cells. In order to answer this, the following specific objectives were considered; 1. To determine whether CK2 phosphorylates ECE-1c at its Nterminal region in vitro and in colon cancer cell lines; 2. To study whether CK2 phosphorylation regulates ECE-1c stability in non-tumor and colorectal cancer cells; and 3. To evaluate whether CK2 regulates migration and invasion of colorectal cancer cells via ECE-1c phosphorylation. An in silico analysis showed that the N-terminal region of ECE-1c has three putative phosphorylation sites for CK2: Thr9, Ser18 and Ser20. Based on this background, we performed an in vitro phosphorylation assay using radioactive ATP and the N-terminal region of ECE-1c fused to GST as substrate, showing that CK2 phosphorylates this region. These results were confirmed by analyzing phosphorylated substrates with mass spectrometry, showing that the phosphorylated residues were Ser18 and Ser20. To show whether phosphorylation occurs in a cellular context, we performed and immunoprecipitation assay inhibiting CK2 with TBB in DLD-1 colon cancer cells, detecting ECE-1 phosphorylation mark. Phosphorylation was detected with an antifosfo-S/T/Y antibody showing that CK2 inhibition decreases ECE-1 phosphorylation mark. Subsequently we assessed whether ECE-1 levels were affected by CK2 inhibition in HEK-293T cells and DLD-1 colon cancer cells. As expected, CK2 inhibition using TBB or CX-4945 decreased protein levels of endogenous ECE-1 and N-terminal region of ECE-1c fused to GFP in both cell lines. Additionally, assays of protein stability were performed using cycloheximide and showed that inhibition of CK2 with TBB decreased stability of the N-terminal region of ECE-1c fused to GFP in HEK-293T and DLD-1 colon cancer cells. In this context, ECE-1c mutants phosphomimetic and not phosphorylatable by CK2 expressed in CHO-K1 cells were shown to have more or less protein stability, respectively. Finally, functional assays and 3D-cell migration and invasion using Transwell chambers, showed that ECE-1c is capable of increasing the migration/invasiveness potential in DLD-1 cells. In addition, the nonphosphorylatable by CK2 mutant was not able to increase migration or invasive capacity. In conclusion, these results suggest that colon cancer cell invasion is promoted by protein kinase CK2 through the increase of endothelinconverting enzyme-1c protein stability by phosphorylation of its N-terminal end. These findings shed lights on a novel mechanism by which CK2 promotes malignant progression of this devasting disease / Conicyt; Fondecyt

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctor en Bioquímica / Los astrocitos colaboran con las neuronas en el normal desarrollo de sus actividades metabólicas, y más aún son capaces de participar activamente en su protección frente a estímulos potencialmente dañinos. Se ha demostrado, que la enzima glutatión-S-transferasa M2-2 (GSTM2-2) de astrocitos es capaz de conjugar glutatión con aminocromo, un producto de oxidación de la dopamina, y por ello es que se propone como hipótesis que la enzima Glutation-S-transferasa M2-2 producida por astrocitos les confiere protección, y protege neuronas tipo dopaminérgicas de los efectos tóxicos de aminocromo. Para validar esta hipótesis es que en primera instancia se determinó la capacidad de los astrocitos humanos U373MG (glioblastoma) de captar aminocromo mediante utilización de aminocromo tritiado, observándose una incorporación máxima a los 40 minutos, la que es parcialmente inhibida por tratamientos con exceso de dopamina, imipramina y nomifensina. Mediante western blot se determinó que la presencia del aminocromo en los cultivos celulares provoca un aumento en la cantidad proteína, además de detectarse aumento en la actividad enzimática, ambos cambios de manera dependiente de la concentración, en donde 100 μM de aminocromo aumenta 2,1 veces la cantidad de la enzima en 3 horas. Se detectó mediante western blot la presencia de la proteína GSTM2-2 en los medios condicionados de células U373MG, aumentando 2,7 veces al exponer las células a aminocromo 50 μM por 3 horas en relación al control sin aminocromo. La línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y es susceptible a toxicidad inducida por aminocromo, determinada por citometría de flujo, por lo que se probaron los medios condicionados de las células U373MG que contenían la enzima GSTM2-2 sobre cultivos de SH-SY5Y, evidenciándose la capacidad de proteger a células SH-SY5Y de la muerte inducida por exposición a 10 μM de aminocromo, y dicha protección frente a la muerte celular es dependiente de la internalización de la proteína GSTM2-2 por parte de las células SH-SY5Y, tal como se demostró (i) por captación de 14C-GSTM2-2 liberado por células U373MG, proceso inhibido por un antisuero contra GSTM2-2, (ii) muerte celular de SH-SY5Y tratadas con aminocromo, en presencia de medios condicionados de U373MG tratados con antisuero contra GSTM2-2, (iii) muerte celular de SH-SY5Y tratadas con aminocromo, en presencia de medios condicionados de células U373MGsiGST6, que expresan un siRNA contra GSTM2-2. En conclusión, nuestros resultados demuestran que las células U373MG protegen las células SH-SY5Y contra la toxicidad inducida por aminocromo, por un mecanismo que involucraría la liberación de GSTM2-2 al medio condicionado y la subsecuente internalización de esta enzima por parte de las células SH-SY5Y. Estos resultados sugieren un nuevo mecanismo de protección de neuronas dopaminérgicas mediado por astrocitos / Astrocytes collaborate with neurons in the normal development of their metabolic activities, and to a greater extent, they are able to actively participate in their protection from potentially harmful stimuli. It has been shown that the enzyme glutathione S-transferase M2-2 (GSTM2-2) from astrocytes is able to conjugate glutathione to aminochrome, an oxidation product of dopamine. Therefore the hypothesis proposed is that the enzyme glutathione S-transferase M2-2 produced by astrocytes protect them, and also protects dopaminergic neurons from the toxic effects of aminochrome. To validate this hypothesis, we assessed the ability of human astrocytes U373MG (glioblastoma) to capture aminochrome by using tritiated aminochrome, reaching an incorporation peak at 40 minutes, which is partially inhibited by treatment with excess dopamine, imipramine and nomifensine. Using western blot, we determined that the presence of aminochrome in cell cultures causes an increase in the protein amount, besides the increasing enzymatic activity, both changes depending on the aminochrome concentration, with 100 μM aminochrome increasing 2.1 times the amount of the enzyme in 3 hours. The presence of protein GSTM2-2 was detected by western blot in conditioned media from U373MG cells, increasing 2.7 times after the exposure to 50 uM aminochrome for 3 hours compared to the control without aminochrome. The neuroblastoma cell line SH-SY5Y is susceptible to aminochrome-induced toxicity, determined by flow cytometry, then U373MG cells conditioned media containing the enzyme GSTM2-2 cultures were tested on SH-SY5Y, demonstrating the ability to protect SH-SY5Y against aminochrome-induced cells death, and that protection against cell death is dependent on internalization of the GSTM2-2 protein by SH-SY5Y cells. This internalization was demonstrated by (i) uptake of 14C-GSTM2-2 released by U373MG cells, process inhibited by an antiserum against GSTM2-2, (ii) cell death of SH-SY5Y treated with aminochrome, in the presence of conditioned media from U373MG treated with antiserum against GSTM2-2, (iii) cell death of SH-SY5Y treated with aminochrome, in the presence of conditioned media of U373MGsiGST6 cells expressing siRNA against GSTM2-2. In conclusion, our results demonstrate that U373MG cells protect SH-SY5Y cells against aminochrome-induced toxicity, by a mechanism which would involve the release of GSTM2-2 to the conditioned medium and subsequent internalization of this enzyme by SH-SY5Y cells. These results suggest a novel mechanism of protection of dopaminergic neurons mediated by astrocytes / Conicyt; Fondecyt

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Memoria para optar el título de Bioquímico / TonEBP es el factor transcripcional de eucariontes responsable de regular la transcripción de genes involucrados en la respuesta al estrés osmótico. Las proteínas codificadas por estos genes permiten la acumulación de osmolitos orgánicos compatibles, tales como sorbitol. Este se genera a partir de glucosa por la acción de aldosa reductasa (AR). Se desconoce si TonEBP está presente en el cardiomiocito neonato como en el adulto y si se regula por cambios en la osmolaridad externa como también por estrés oxidativo. Los resultados inmunocitoquímicos y de Western blot mostraron que basalmente TonEBP y AR están en el citosol y núcleo de manera homogénea en cardiomiocito de rata neonata, sin embargo en cardiomicitos adultos TonEBP y AR basalmente se encuentran sólo en la periferia celular. Cultivos primarios de cardiomiocitos expuestos a estrés hiperosmótico (Sorbitol 600 mOSm) por 8, 16 y 24 h, mostraron un aumento de TonEBP y de su translocación al núcleo. Los niveles de AR y su actividad también aumentaron significativamente a las 8, 16 y 24 h postestímulo. En cambio, los cultivos expuestos a estrés hiposmótico (30% de dilución del medio de cultivo, 202 mOsm), la cantidad de proteína de TonEBP y AR disminuyeron respecto al control y no se detectó actividad de AR. Dado que nuestro laboratorio previamente demostró que el estrés hiperosmótico inducido por sorbitol genera ROS y aumenta los niveles intracelulares de Ca2+, también se estudió sus efectos en la regulación de TonEBP. Los resultados mostraron que la translocación de TonEBP al núcleo es independiente del calcio y que las ROS son necesarias pero no suficiente para su completa activación. Bajo estas últimas condiciones, TonEBP migró al núcleo pero no se activó dado que no aumentaron sus niveles de proteína ni los de su gen blanco AR. En su conjunto, estos resultados sugieren que TonEBP está presente en el cardiomiocito y tanto este factor transcripcional como AR modifican sus niveles y actividad en respuesta a cambios en la osmolaridad externa en forma independiente del calcio. El estrés oxidativo estimuló su translocación al núcleo pero no su activación / The transcription factor TonEBP has been implicated in regulation of gene transcription involved in the response to osmotic stress. These genes allow the accumulation of intracellular organic osmolytes and protect to the cell against hypertonicity, normalizing both cell volume and inorganic ion concentration. Sorbitol, one of these compatible organic osmolytes, is generated from glucose by action of Aldose Reductase (AR). It remains unknown whether TonEBP is present in the neonate and adult cardiac myocytes and if it is regulated by changes in the external osmolality and also by oxidative stress. Both immunofluorescence and Western blot results showed that in basal conditions, TonEBP and AR were localized in the cytosol and nucleus in equal amount of cultured neonatal cardiac myocytes. But in adult rats in basal conditions, TonEBP and AR were localizated only in the external membrane cellular. When these cells were exposed to hyperosmotic stress (Sorbitol 600 mOSm) by 8, 16 and 24 h, TonEBP levels increased and it is translocated to the nucleus. Levels of AR and their activity also increased significantly after 8, 16 and 24 h post-stimulus. However, cells exposed to hyposmotic stress (30% dilution in culture medium, 202 mOsm), the amounts of TonEBP and AR decreased respect to controls and AR activity was not detected. On the other hand, our laboratory has previously shown that hyperosmotic stress induced by Sorbitol generates ROS and induces increase in intracellular calcium levels. We tested whether these variables regulates TonEBP. The results showed that nuclear translocation of TonEBP was independent of calcium but ROS were necessary but not sufficient for a complete TonEBP activation. Under these conditions, TonEBP is translocated to the nucleus but that was not induced and neither increased AR levels. Collectivelly, these results suggest TonEBP is present in cultured cardiac myocytes and response to changes in the external osmolality independent of calcium. Nevertheless oxidative stress was not sufficient for a complete activation of TonEBP