Orientador: Vadim Viviani / Banca: Márcia Regina Brochetto Braga / Banca: Jonas Contiero / Banca: Dulce Helena Ferreira de Souza / Banca: Leonardo Fernandes Fraceto / Resumo: Neste trabalho foi feita a expressão e purificação das luciferases recombinantes do elaterídeo Pyrearinus termitilluminans e dos fengodídeos Phrixotrix hirtus e Phrixotrix viviani, e a determinação e comparação de suas propriedades físico-químicas. Estimamos os Kms para luciferina e ATP, as constantes catalíticas, pH ótimo e outros dados cinéticos nas três luciferases. Através do uso de sondas fluorescentes, fizemos uma inspeção da polaridade dos sítios de ligação da luciferina. Além disso, foi feita a modelagem molecular para complementar os estudos experimentais e identificar os resíduos do sítio-ativo que afetam a polaridade e os espectros de bioluminescência nestas luciferases. Os dados sugerem que a luciferase de Pyrearinus termitilluminans tem o sítio ativo mais hidrofóbico entre as luciferases estudadas e a luciferase de Phrixotrix hirtus o mais polar. Estes dados suportam a importância da polaridade e polarizabilidade orientada na determinação dos espectros de bioluminescência. Além disto, os resultados de termoestabilidade e cinética de luminescência da luciferase de Pyrearinus termitilluminans sugerem que esta enzima seja particularmente apropriada para aplicações de bioimageamento. / Abstract: In this work, purification and comparative physical-chemical characterization of the recombinant luciferases from the elaterid Pyrearinus termitilluminans and from the phengodids Phrixotrix hirtus and Phrixotrix viviani was performed. The Kms for luciferin and ATP, the Kcat, optimum pH and other kinetics data were estimated in the three luciferases. Through fluorescent probes, we assessed the active-site polarity. Furthermore, molecular modeling was performed in order to support the experimental studies and suggest putative active site residues that could be responsible for changes of polarity. These data suggest that the luciferin binding site is more hydrophobic for Pyrearinus luciferase than in the other luciferases studied and support the polarity hypothesis as a mechanism for modulation of bioluminescence colors. / Doutor

Resumo: Este projeto é parte do projeto temático "Conservation and Sustainable Use of the Plant Diversity from Cerrado and Atlantic Forest: Chemical Diversity and Prospecting for Potencial Drugs" - Biota/FAPESP e descreve o isolamento, purificação e caracterização de peptídeos cíclicos presentes em Jatropha curcas L. Este tema foi proposto para o projeto temático por tratar-se de um assunto atual e inédito no Brasil, sendo importante no que diz respeito da descoberta de novas classes de produtos naturais. A obtenção dos peptídeos foi realizada através da partição do látex com acetato de etila e da aplicação de técnicas cromatográficas para sua purificação. Este procedimento permitiu a obtenção de dois peptídeos cíclicos, posteriormente caracterizados por análise de aminoácidos e espectrometria de massas. O seqüenciamento dessas substâncias foi realizado por Ressonância Magnética Nuclear, e permitiu identificar o peptídeo cíclico Polianina A [c(Pro-Leu- Gly-Val-Leu-Leu-Tyr)], já descrito na literatura, e um peptídeo de estrutura inédita, denominado Jatrofidina I [c(Leu-Leu-Asn-Leu-Trp-Cly-Pro-Gly)]. Análogos lineares e cíclicos desses peptídeos foram obtidos pela metodologia da síntese peptídica em fase sólida, empregando a estratégia Fmoc/tBu. Os análogos obtidos bem como os peptídeos naturais foram submetidos a diversos ensaios biológicos. Por fim, foi feita uma avaliação mensal qualitativa e/ou quantitativa do perfil ciclopeptídico de espécimes cultivadas de Jatropha curcas L.(Euphorbiaceae), gossypifolia, para verificar se ocorrem alterações na produção destas moléculas em função da época do ano. Os resultados mostraram que as 2 espécies produzem os peptídeos cíclicos durante o ano todo. É interessante notar que as descrições de peptídeos cíclicos na literatura foram obtidas de espécies de Jatropha... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This project is part of the thematic project "Conservation and Sustainable Use of the Plant Diversity from Cerrado and Atlantic Forest: Chemical Diversity and Prospecting for Potencial Drugs" - Biota/FAPESP, and deals with the isolation, purification and characterization of cyclic peptides from Jatropha curcas L. This is a quite new natural product subject in Brazil, which is also important for discovery from our biodiversity. These compounds were obtained through partition of the latex with ethyl acetate, followed of HPLC chromatography for separation and purification. This procedure resulted in two cyclic peptides, which were characterized by amino acid analysis and mass spectrometry. The structures of these compounds were elucidated by 2D Nuclear Magnetic Resonance. One compound was identified as Pohlianin A [c(Pro-Leu-Gly-Val-Leu-Leu-Tyr)], a known cyclic peptide already isolated from XXX, and one novel which was named jatrophidin I [c(Leu-Leu-Asn- Leu-Trp-Cly-Pro-Gly)]. Linear and cyclic analogues of these peptides were obtained through solid phase synthesis methodology by using of Fmoc/tBu reagents. The linear peptides as well as synthetic cyclic peptides were submitted to several biological assays. Finally, the cyclopeptidic profile of Jatropha curcas and gossypifolia was evaluated. The results showed a continuing production of these compounds in both species all over the year. These results can be relevant for further chemotaxonomy and phylogeny studies of Jatropha species that occur in Latin America, and in special Brazil. Previously, all cyclic peptide in the literature search were isolated from African and Asian Jatropha species, and our results can be useful to map the chemical composition of other Brazilian Jatropha species. / Orientador: Vanderlan da Silva Bolzani / Coorientador: Eduardo Maffud Cilli / Banca: Mário Sérgio Palma / Banca: Adriano Defini Andricopulo / Mestre

Os objetivos deste trabalho foram determinar valores hematológicos e bioquímicos para muares de três faixas etárias e compará-los com os das raças formadoras. Para o desenvolvimento do trabalho foram utilizados 288 animais, machos ou fêmeas, sendo: 10 jumentos, 30 éguas e 260 muares. Os muares foram divididos em três grupos: G1 (animais entre dois meses e um ano de idade), G2 (animais entre um e três anos de idade) e G3 (animais acima de três anos de idade). Foram realizadas as seguintes avaliações laboratoriais: hemograma, contagem de plaquetas, fibrinogênio, glicemia, ureia, creatinina, creatinoquinase, aspartato aminotransferase, gama glutamiltransferase, fosfatase alcalina, lactato desidrogenase, bilirrubinas, proteína total, albumina, triglicérides, colesterol, lactato, sódio, cloro, potássio, cálcio, fósforo, magnésio e ferro. Além do estabelecimento dos valores de referência do hemograma e bioquímica sérica para muares de três faixas etárias, conclui-se também que: hematologicamente os muares estão mais próximos dos asininos que dos equinos; há diferença significativa nos valores bioquímicos e hematológicos entre as faixas etárias; há influência sexual nos valores hematológicos e bioquímicos de maures, mas é clinicamente menos significativa do que a influência etária; o hemoparasita Theileria equi pode ser encontrado no esfregaço sanguíneo de um número significativo de muares, mesmo que estes não apresentem sintomatologia clínica. / The purpose of this study was to determine hematological and biochemical values of three age groups of mules and to compare them with the forming races. For the development of this study, it was used 288 animals, males or females, as follows: 10 donkeys, 30 mares and 260 mules. The mules were divided into three groups: G1 (animals between two months and one year old), G2 (animals between one and three years old) and G3 (animals above three years old). The following laboratory evaluations were performed: blood count, platelet count, fibrinogen, glucose, urea, creatinine, creatine kinase, aspartate aminotransferase, gamma glutamyl transferase, alkaline phosphatase, lactate dehydrogenase, bilirubin, total protein, albumin, triglycerides, cholesterol, lactate, sodium, chlorine, potassium, calcium, phosphorus, magnesium and iron. In addition to the establishment of reference values for blood count and serum biochemistry for mules of three age groups, it is also concluded that: hematologically, the mules are closer to donkeys than the horses; there is a significant difference in biochemical and haematological values between age groups; there is a sexual influence in the mules haematological and biochemical values, but it is clinically less significant than the age influence; the hemoparasite Theileria equi can be found in the blood smear in a significant number of mules, even if they do not show clinical symptoms.

OBJETIVOS - Verificar o efeito do exercício agudo e da suplementação com PUFA n-3 sobre parâmetros de estresse oxidativo e inflamatórios em pacientes diabéticos tipo 2. DESENHO DA PESQUISA E MÉTODOS - Participaram do estudo 30 diabéticos tipo 2 sem complicações decorrentes da doença. Realizou-se coleta de sangue em jejum de 12 h e de urina para analises bioquímicas. Após foram submetidos a eletrocardiograma concomitante ao teste de cargas progressivas. Na semana seguinte foi realizado o 1º teste submáximo com coleta de sangue antes e após o exercício para analise de estresse oxidativo e proteína C reativa ultra-sensível (CRP-hs). Organizou-se aleatoriamente 2 grupos: placebo (recebeu cápsulas contendo gelatina) e PUFA n-3 (recebeu cápsulas ricas em ômega-3). Após período de suplementação de 8 semanas foi repetido o protocolo do teste submáximo. RESULTADOS - Não foram verificadas alterações significativas no HDL, LDL, COL, glicemia e HbA1C. Após o período de suplementação, o grupo PUFA n-3 reduziu significativamente os valores de triglicerídeos (p=0,005) e VLDL (p=0,003) e aumentou a capacidade antioxidante total (p=0,047) e a atividade da enzima superóxido dismutase (p=0,017). Não foram verificadas alterações nos marcadores de lipoperoxidação e ácido úrico. A CRP-hs aumentou após o exercício em ambos os grupos, e não alterou-se com a suplementação. CONCLUSÕES - Uma única sessão de exercício não foi capaz de gerar danos oxidativos, no entanto proporcionou aumento de CRP-hs. A suplementação com PUFA n-3 reduzir os níveis de triglicerídeos e aumentou as defesas antioxidantes sem alterar parâmetros oxidativos.

Submitted by Gizele Lima (gizele.lima@inpa.gov.br) on 2018-03-07T19:37:39Z No. of bitstreams: 2 dissertacao_Yuri_Wanick.pdf: 907578 bytes, checksum: 6ccdbd51a713c27b3641ca93f58dd714 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-07T19:37:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 dissertacao_Yuri_Wanick.pdf: 907578 bytes, checksum: 6ccdbd51a713c27b3641ca93f58dd714 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2015-09-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The terra firme forests in Central Amazon are limited by phosphorus (P) available in the soil, due mainly to the fact that they are on very old weathered soils, with low nutrients level. In addition, recent work hypothesized that the extinction of the megafauna resulted in P limitation in the forest around the Amazon River, because those animals spread horizontally in the forest P from the varzea areas which received rich sediments from Andes. We tested the hypothesized P limitation by the extinction of the megafauna. We carried out a P addition experiment using doses that were modelled to have been lost annually with the megafuana, an amount that coincides with P recycling in annual litterfall. We chosen 10 randomly locations and then two plots of 1 m × 1 m were established and received one inorganic P in a dose corresponding to 4 kg / ha. This amount equals the value of P that the forest annually returns in the form of litter and near the hypothetical value added per year by megafauna. P addition did not affect the root colonization by mychorriza (TCM) and did not stimulate the microbial biomass or microbial P or extractable soil P. The results indicate that inorganic P perhaps is not the major factor to regulate the TCM and, at least in the doses applied, and it does not stimulate the soil microbiota at least in the dry season, a period of reduced microbial activity. As we did not observe a saturation of the P fractions after fertilizer addition, we conclude that the contribution of the megafauna to P supply for forest is less important than was hypothesized. / As florestas de terra firme da Amazônia Central são limitadas pela disponibilização de fósforo (P) no ecossistema, principalmente por estarem sobre solos muito intemperizados, com baixo nível de nutrientes. Adicionalmente foi sugerido recentemente que a limitação das florestas ao entorno do Rio Amazonas é em grande parte devido à diminuição da escala da função ecológica desempenhada pela megafauna antes de sua extinção, que era a transferência horizontal de P entre as áreas de várzea que recebem sedimentos ricos em nutrientes vindos do Andes e as áreas de floresta de terra firme. Para testar esta teoria foi montado um experimento para testar se a microbiota do solo reagiria à adição da quantidade da perda anual da oferta de P que foi hipotetizado que coincide com a quantidade de P redistribuído anualmente pela serapilheira. Em 10 localidades escolhidas aleatoriamente, duas parcelas de 1 m x 1 m foram estabelecidas onde uma delas recebeu P inorgânico em dose equivalente a 4 kg/ha. Essa quantidade equivale o valor do P que a floresta retorna anualmente em forma de serapilheira e perto do valor hipoteticamente acrescentado por ano pela megafauna. Os dados obtidos com o experimento deram resultados negativos, negando o papel hipotético da perda pela megafauna. O P aplicado ao solo não alterou a taxa de colonização por micorrizas (TCM) e a massa microbiana não aumentou devido à aplicação de P, nem tampouco a quantidade de P imobilizado pela microbiota do solo, ou mesmo o P disponível na camada superior do solo durante o período de experimento. Os dados apontam que o P inorgânico não seja o principal fator regulador da intensidade da TCM e, ao menos em doses relativamente menores, não estimule a microbiota do solo durante a época de menor atividade (período seco do ano). Deste modo, não se observou que as diferentes frações de P no sistema tenham sido saturadas com a adição do fertilizante, indicando que provavelmente a megafauna tenha tido uma contribuição menor no suprimento de P para as florestas do que tem sido hipotetizado.

A regulação dependente de Ca2+ da atividade ATPásica da acto-miosina em concentrações fisiológicas de actina, tropomiosina e troponina ocorre exclusivamente na presença de troponina T (TnT). Nosso grupo demonstrou que um polipeptídeo correspondente aos primeiros 191 aminoácidos da TnT ativa a atividade ATPásica da acto-miosina na presença de tropomiosina e na ausência das outras duas subunidades do complexo troponina (TnI/TnC). Com o objetivo de mapear e caracterizar esse domínio ativatório da TnT, construímos fragmentos de TnT correspondentes às regiões compreendidas entre os resíduos de aminoácidos: 1-157 (TnTl-157), 1-76 (TnTl-76), 77-157 (TnT77-57), 77-191 (TnT77-191) e 158-191 (TnT158-191). Estudos das interações desses fragmentos com actina e tropomiosina demonstraram que: i) o fragmento TnTl-76 não se liga à tropomiosina ou a actina; ii) a região da TnT correspondente aos resíduos 158-191 liga-se à actina cooperativamente, mas não se liga à tropomiosina; iii) a região correspondente seqüência de aminoácidos 77-157 é necessária para a interação da TnT com o resíduo de aminoácido 263 da tropomiosina; iv) TnT77-191 ativa a atividade ATPásica da acto-miosina com a mesma intensidade que TnTl-191. Também observamos que TnTl-157, TnTl-76, TnT77-157, TnT158-91 e combinações de TnT158-191 com TnTl-157 e TnT77-157 não afetam a atividade ATPásica da acto-miosina. Concluímos que a região da TnT delimitada pelos aminoácidos 77 e 191 é essencial para a ativação da atividade ATPásica da actomiosina e que essa ativação é mediada pelas interações dessa região da TnT com a tropomiosina e a actina. / The Ca2+-regulation of the actomyosin ATPase activity at physiological ratios of actin, tropomyosin and troponin occurs only in the presence of troponin T. Our group has previously demonstrated that a recombinant polypeptide corresponding to the first 191 amino acids of TnT (TnTl-191) activates the aetomyosin Mg2+-ATPase activity in the presence of tropomyosin and in the absence of TnI/TnC. In order to further map and characterize this activation domain, we constructed a set of recombinant or synthetic TnT fragments, corresponding to amino acids 1-157 (TnTl-157), 1-76 (TnTl-76), 77-57 (TnT77-157), 77-191 (TnT77-191) and 158-191 (TnT158-191). Binding assays using these fragments demonstrated that: i) amino acids 1-76 of TnT do not bind to tropomyosin or actin; ii) amino acids 158-191 bind to actin cooperatively, but not to tropomyosin; iii) the sequence 77-157 is necessary for TnT\'s interaction with residue 263 of tropomyosin; iv) TnT77-191 on its own activates de actomyosin ATPase activity to the same extent as previously described for TnTl-191. TnT1-157; TnTl-76; TnT77-157; TnT158-191 and combinations of TnT158-191 with TnTl-157 or TnT77-157 showed no effect on the ATPase activity. We conclude that interactions of amino acids 77-191 of TnT with tropomyosin and actin are essential for the activation of actomyosin ATPase activity, and that this activation may be mediated in part by a direct interaction between TnT residues 158-191 and actin.

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Doutoramento em Bioquímica / PhD Degree - Biochemistry / Resumo PT / Resumo UK

Orientador: Priscila Lupino Gratão / Coorientador: Carlos Alberto Martínez Huamán / Abstract: Drought and heat stresses are considered the main climatic factors damaging the plant growth. In addition, according to Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC), the effect of combined drought and heat stresses will also be exacerbated in the next years, resulting in crop yield and economic losses. In spite of the consequences of the drought and heat combinations, the investigations to reduce its detrimental effects are scarce, particularly under climate change conditions. In this sense, we carried out two experiments in field conditions to determine the plant antioxidant responses to drought (wS), elevated temperature (+2 °C above air temperature) (eT) and combined drought and elevated temperature stresses. We used Panicum maximum during the first experiment and Stylosanthes capitata during the second one. In order to increase the temperature, we used the Temperature Free-Air Controlled Enhancement (T-FACE) facility. Samplings of P. maximum were taken 13, 19 and 37 days after the treatments have begun in the first experiment; meanwhile, the samplings of S. capitata were taken 17, 24 and 46 days in the second experiment. In both experiment, the samplings were taken at 6:00 am and 12:00 pm. The following combined stresses displayed an increase of chlorophyll and carotenoid contents in P. maximum (particularly at 19 days after the treatments have begun). Furthermore, the occurrence of precipitation after the second sampling reflecting induced the decreased in MDA and ca... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Tesis Magíster en Bioquímica, Área de Especialización en Bioquímica Toxicológica y Diagnóstico Molecular, y Memoria para optar al Título de Bioquímico / dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+) es una coenzima con múltiples funciones. Participa en el metabolismo redox como molécula transportadora de electrones en procesos metabólicos, actúa como indicador del estado energético celular, y es también sustrato de numerosas enzimas implicadas en la desacetilación de reguladores transcripcionales y la movilización de Ca2+ intracelular, entre otros. Diversas investigaciones sugieren que la disminución de los niveles de NAD+ es un factor importante en la progresión de enfermedades cardiovasculares. En diferentes modelos de miocardiopatías se ha observado una disminución en la expresión de la enzima marcapaso de la síntesis de NAD+, Nampt. También se ha descrito que los niveles de NAD+ están disminuidos en condiciones de riesgo cardiovascular como son el envejecimiento, dislipidemia y diabetes mellitus tipo 2. El objetivo de este trabajo fue determinar los efectos de la disminución de NAD+ en el metabolismo y la capacidad adaptativa de los cardiomiocitos. Se utilizó el inhibidor de Nampt, FK866, para disminuir los niveles de NAD+ en cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas. Se evaluó la viabilidad, el metabolismo mitocondrial y la respuesta adaptativa del cardiomiocito a estímulos de insulina, peróxido de hidrógeno (H2O2) y norepinefrina (NE). Los resultados mostraron que la disminución de NAD+ por FK866 redujo el metabolismo mitocondrial sin afectar la viabilidad de los cardiomiocitos. Además, disminuyó la fosforilación de Akt en respuesta a insulina, la sobrevida frente a H2O2 y previno el aumento del área celular y sarcomerización en respuesta a NE. Para evaluar la relación de causalidad entre la disminución de NAD+ y estos efectos, se rescataron los niveles de NAD+ mediante la administración de nicotinamida mononucleótido (NMN). Se observó la recuperación de los parámetros metabólicos y la sobrevida a H2O2, pero no se restableció la respuesta hipertrófica. En conclusión, este trabajo muestra que NAD+ es esencial para el metabolismo mitocondrial del cardiomiocito, y sugiere su participación en la vía de señalización de insulina y en la respuesta adaptativa a H2O2 y NE. / The nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) is a coenzyme with multiple functions. In redox metabolism participates as an electron carrier in metabolic processes, is a cellular energetic status indicator and it is also substrate of many enzymes involved in transcription factor deacetylation and Ca2+ mobilization, among others. Several reports suggest that NAD+ levels are an important factor in cardiovascular diseases progression. In different cardiomyopathy models the expression of the NAD+ synthesis rate-limiting enzyme, Nampt is diminished. Also NAD+ levels are decreased in cardiovascular risk conditions such as aging, dyslipidemia and type 2 diabetes mellitus. The aim of this work was to determine the effects of NAD+ decrease on cardiomyocytes’ metabolism and adaptive capability. The Nampt inhibitor, FK866, was used to reduce NAD+ levels in primary cultures of neonatal rat cardiomyocytes, and viability, mitochondrial metabolism, and cardiomyocytes adaptive response to insulin, hydrogen peroxide (H2O2) and norepinephrine (NE) stimuli were assessed. The results showed that the NAD+ reduction induced by FK866 decreased mitochondrial metabolism without affecting cardiomyocytes viability. Insulin-stimulated Akt phosphorylation and H2O2-survival were also diminished and cellular area increase and sarcomerization induced by NE was prevented. The causality between NAD+ decrease and those effects was assessed through NAD+ levels recovery by nicotinamide mononucleotide (NMN) administration. Both metabolism and H2O2-survival were reestablished, but not the hypertrophic response. In conclusion this work reveals that NAD+ is essential for cardiomyocyte mitochondrial metabolism, and suggest its participation on insulin signaling pathway and adaptive responses to H2O2 and NE. / Fondap; Fondecyt