El reloj circadiano es un mecanismo celular endógeno presente en prácticamente todos los organismos. Una función clave del reloj es la sincronización del metabolismo, fisiología y desarrollo con los cambios medioambientales diurnos y estacionales generados por la rotación de la tierra sobre su propio eje. Se ha propuesto que las oscilaciones circadianas proporcionan una ventaja adaptativa al permitir que los organismos anticipen las transiciones durante el ciclo diurno/nocturno y coordinen procesos simultáneos, secuenciales o temporalmente incompatibles. En los últimos años, numerosos estudios bioquímicos, moleculares y genéticos han proporcionado una visión cada vez más completa de la función y organización circadiana en plantas. Los ritmos circadianos se generan en primera instancia mediante las regulaciones recíprocas entre componentes centrales del reloj que producen una ritmicidad en expresión génica, procesamiento de mRNA, abundancia de proteína y actividad. A pesar de estos avances, aún se dispone de muy poca información sobre los componentes y mecanismos que conectan las señales medioambientales con las rutas de salida del reloj, y en concreto, con los ritmos del metabolismo celular en plantas. El trabajo realizado durante esta Tesis Doctoral se ha centrado en el estudio del papel de los componentes circadianos REVEILLE 8 (RVE8) y NIGHT LIGHT-INDUCIBLE AND CLOCK-REGULATED (LNKs) en la regulación de la oscilación rítmica de la biosíntesis de antocianinas a lo largo del día. Al amanecer, RVE8 activa la expresión de genes de la ruta de síntesis de antocianinas mediante la unión directa a los promotores de algunos de los genes de esta ruta metabólica. La regulación positiva de RVE8 es antagonizada hacia la mitad del día por la acción represora de las proteínas LNK, tal y como se deduce del dramático incremento en la expresión de genes de antocianinas en plantas dobles mutantes lnk1/lnk2. Mediante técnicas de inmunoprecipitación de cromatina usando plantas con la expresión de RVE8 y LNKs alterada, se observa que la unión de RVE8 a los promotores disminuye en presencia de los LNK y aumenta en su ausencia, lo que pone de manifiesto un mecanismo mediante el cual las proteínas LNK antagonizan la función activadora de RVE8 sobre los genes implicados en la biosíntesis de antocianinas. Dado que RVE8 y LNKs han sido descritos como co-activadores transcripcionales de genes del reloj, nuestro estudio define un cambio en la actividad reguladora de la interacción RVE8-LNK, desde una función sinérgica activadora de genes de reloj que se expresan por la tarde, a una función represora que modula la expresión de genes implicados en la biosíntesis de antocianinas a mitad del día. / Circadian clocks sustain 24-h rhythms in physiology and metabolism that are synchronized with the day/night cycle. In plants, the regulatory network responsible for the generation of rhythms has been broadly investigated over the past years. However, little is known about the intersecting pathways that link the environmental signals with rhythms in cellular metabolism. Here, we examine the role of the circadian components REVEILLE8/LHY-CCA1-LIKE5 (RVE8/LCL5) and NIGHT LIGHT–INDUCIBLE AND CLOCK-REGULATED genes (LNK) shaping the diurnal oscillation of the anthocyanin metabolic pathway. Around dawn, RVE8 up-regulates anthocyanin gene expression by directly associating to the promoters of a subset of anthocyanin biosynthetic genes. The upregulation is overcome at midday by the repressing activity of LNK proteins, as inferred by the increased anthocyanin gene expression in lnk1/lnk2 double mutant plants. Chromatin immunoprecipitation assays using LNK and RVE8 misexpressing plants show that RVE8 binding to target promoters is precluded in LNK overexpressing plants and conversely, binding is enhanced in the absence of functional LNKs, which provides a mechanism by which LNKs antagonize RVE8 function in the regulation of anthocyanin accumulation. Based on their previously described transcriptional coactivating function, our study defines a switch in the regulatory activity of RVE8–LNK interaction, from a synergic coactivating role of eveningexpressed clock genes to a repressive antagonistic function modulating anthocyanin biosynthesis around midday.

La piriculariosis del arroz, causada por el hongo Magnaporthe oryzae, es la enfermedad que más pérdidas genera devastando miles de hectáreas de cultivo anualmente. Los tratamientos antifúngicos frente a esta enfermedad suelen ser de poca utilidad y se vuelven ineficaces en poco tiempo debido a la alta tasa de variación del hongo. Además, dentro del contexto legislativo actual a nivel europeo, se está restringiendo cada vez más la utilización de compuestos antifúngicos de amplio espectro debido a los posibles daños que pueden ocasionar sobre el ecosistema y la salud humana. Una alternativa prometedora al uso de los antifúngicos convencionales son los péptidos antimicrobianos, y más concretamente los péptidos dirigidos capaces de bloquear un proceso esencial para la infección del patógeno. Un paso fundamental en el proceso infectivo del hongo M. oryzae es la formación del apresorio, cuya finalidad es romper la superficie foliar y así penetrar en el mesófilo de la hoja. El desarrollo de compuestos capaces de bloquear específicamente este proceso sin afectar al ciclo vital del hongo constituiría una estrategia ventajosa en el control de la piriculariosis, a priori no tóxica para otros organismos incluido el ser humano. En este trabajo, hemos abordado este objetivo mediante dos aproximaciones, el cribado de una biblioteca combinatoria de péptidos y la modificación de secuencias de AMPs naturales mediante diseño racional. Gracias al conocimiento que se tiene sobre la secuencia y el modo de acción de los péptidos antimicrobianos, hemos diseñado una serie de péptidos capaces de controlar el desarrollo de la piriculariosis mediante inhibición específica de la formación del apresorio en M. oryzae, pero sin afectar a la viabilidad celular. Nuestros resultados indican que péptidos pequeños, como el heptapéptido PAF104, son capaces de reprimir la expresión de los genes MoMSB2 y MoMST11, implicados en la ruta de señalización de la MAPK Pmk1 imprescindible para la formación del apresorio en M. oryzae. Además, demostramos un comportamiento diferencial frente a distintas estructuras infectivas (i.e., apresorio, estructuras similares al apresorio e hifopodios), lo que apoya la idea propuesta por otros investigadores de que los mecanismos moleculares que regulan estás estructuras no son exactamente iguales. Mediante microscopía confocal mostramos que el tratamiento del hongo con MgAPI16 da lugar a apresorios aberrantes y no funcionales. En conclusión la principal aportación de esta investigación es el diseño de una serie de péptidos sintéticos, los heptapéptidos diseñados de novo PAF104, MgAPI24, MgAPI40 y MgAPI47, y el péptido MgAPI16 derivado del péptido antimicrobiano natural CecA, capaces de controlar el desarrollo de la piriculariosis en arroz mediante la inhibición específica de la formación del apresorio. Este trabajo contribuye por tanto al diseño de estrategias de control en protección vegetal basadas en péptidos dirigidos, las cuales deberían ser sostenibles y respetuosas con el medio ambiente. / Rice blast caused by the fungus Magnaporthe oryzae is the most devastating rice disease, causing losses and ravaging thousands of hectares every year. Antifungal treatments are often ineffective and become useless soon due to the high fungus variation rate. Furthermore, within the current legislative framework at European level, it is increasingly restricting the use of broad-spectrum antifungal compounds because of the potential damage that can cause to the ecosystem and human health. One promising alternative to conventional antifungal compounds are the use of antimicrobial peptides, and in particular the target-orientated peptides able to block an essential infective process. A basic step on the development of rice blast diseases is the formation of appressoria, necessary to break the leaf surface and penetrate the mesophyll. To develop novel compounds able to block this process without affecting the life cycle of the fungus could be a promising alternative to control rice blast diseases, a priori no toxic to other organisms including humans. In this work, we board this objective by performing two approaches, the screening of a peptide combinatorial library and the rational design of natural known antimicrobial peptides. We have design a set of peptides able to control the infection caused by M. oryzae by specific inhibition of appressorium formation, but without a lytic effect. Our results show that small peptides, such as the heptapeptide PAF104, represses the gene expression of MoMSB2 and MoMST11, involved in the Pmk1 MAPK pathway essential to M. oryzae appressorium formation. Moreover, the designed peptides showed a differential effect on some infective structures (i.e., appressoria, appressorium-like structures and hyphopodia), supporting that the molecular regulation of these structures is different, an idea previously proposed by other researchers. By confocal microscopy we showed that the appressoria treated with MgAPI16 present aberrant physical and not functional structures. As a conclusion, the main contribution of this work is the design of a set of synthetic peptides, de novo designed heptapeptides PAF104, MgAPI24, MgAPI40 y MgAPI47 and the peptide MgAPI16 derived from the natural antimicrobial peptide Cecropin A, which are able to control rice blast development through the specific inhibition of the appressorium formation in M. oryzae. Therefore, this work contributes to the design of novel strategies based in targeted-orientated peptides for plant protection, which should be environmentally friendly.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / Prostate cancer (PCa) is the second most common cancer in men after lung cancer. Around 1.1 million men worldwide were diagnosed with PCa in 2012. PCa depends essentially on androgen stimulation for growth and cell survival. The androgen receptor (AR) is a nuclear hormone receptor that is activated by androgenic hormones and the protein through which the physiological effects of androgens are mediated. The AR is necessary for normal prostate development, growth and physiology but also has an important role in the progression of PCa. It is an essential regulator of tumor growth, spread and survival of cancer cells in castration-resistant prostate cancer (CRPC), a stage of the disease that has become resistant to the current therapies, and thus represents a potential therapeutic target. The AR is composed of four domains: the N-terminal domain (NTD), which is thought to be intrinsically disordered, the DNA-binding domain (DBD) containing two zinc fingers, the hinge region and the ligand-binding domain (LBD) that binds both testosterone and dihydrotestosterone (DHT). The AR NTD plays a crucial role in the constitutive activity of the AR in tumors from patients with castration resistance. Currently, there is no effective treatment for CRPC. The transactivation by the NTD is independent on androgens and therefore circumvents the two current therapeutic strategies that directly target the androgen signaling axis and aim to prevent binding of androgens to the AR LBD. For this reason, we have characterized the conformational properties of the intrinsically disordered NTD, and in particular the activation function 1 (AF1) region, which contains transactivation units Tau-1 and Tau-5 important for AR transactivation. Due to the intrinsically disordered nature of these regions, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy has been used to assign the protein backbone of AF1* (AR 142-448) and to describe its secondary structure and dynamic characteristics. We found that, in vitro, AF1* has a low tendency to self-associate into a dimer. In addition, regions of AF1* with higher secondary structure propensity and less flexibility are also involved in dimerization of AF1* and coincide with regions previously identified to be functional (core Tau-1 and Tau-5). In this thesis, the role of the AR NTD in transcriptional activation was also investigated at the molecular level. We have studied its interaction with RAP74, a subunit of the general transcription factor IIF (TFIIF). Interaction of the 433WHTLF437 motif of AR, located within the Tau-5 region, with RAP74 enables transactivation in CRPC cells. This novel mechanism could explain aberrant transactivation in cells of castration-resistant patients. Our data suggest that phosphorylation of residues N-terminal to the motif may be necessary for this interaction to occur. Finally, we wished to understand how the AR NTD can be targeted by small molecules. We have studied the mechanism of interaction of EPI-001, a small molecule that has recently been described as a potent inhibitor of AR interacting with the NTD of AR and causing the regression of CRPC. The results showed a specific recognition mechanism by which EPI-001 interacts with a low populated conformation of Tau-5, a conformation that is possibly related to the dimeric state of AF1. / El cáncer de próstata (PCa) es el segundo tipo de cáncer más común en hombres después del cáncer de pulmón. Alrededor de 1.1 millones de hombres en todo el mundo se les diagnosticó PCa durante el año 2012. El cáncer de próstata depende esencialmente de la estimulación de los andrógenos para el crecimiento y la supervivencia celular. El receptor androgénico (AR) es un receptor de hormonas nuclear que es activado por las hormonas andrógenas y la proteína mediante la cual los efectos fisiológicos de los andrógenos se producen. El AR es necesario para el desarrollo normal de la próstata, su crecimiento y fisiología pero también tiene un papel muy importante en la progresión del cáncer de próstata. Por ello, es un regulador esencial para el crecimiento, diseminación y supervivencia de células cancerígenas en tumores de cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC), y por tanto, representa una potencial diana terapéutica. Desde el punto de vista estructural y functional, el AR está compuesto por cuatro dominios: el dominio N-terminal (NTD) que se piensa que es intrínsicamente desordenado, el dominio de unión a DNA (DBD) que contiene dos dedos de zinc, la región bisagra y el dominio de unión de ligando (LBD) que une tanto testosterona como dihidro-testosterona (DHT). El NTD de AR juega un papel crucial en la actividad constitutiva del AR en tumores de pacientes con resistencia a la castración, el cancer de prostata más avanzado. Actualmente no existe un tratamiento efectivo para CRPC. La transactivación del NTD es independiente de los andrógenos y por tanto evita las estrategias actuales de tratamiento dirigidos al eje de señalización de andrógenos. Por esta razón, se ha realizado la caracterización de las propiedades conformacionales del NTD intrínsecamente desordenado del AR y en particular del AF1, la región más potente para la activación del AR que contiene los regiones Tau-1 y Tau-5. Debido a la naturaleza intrínsecamente desordenada de estos regiones, se ha realizado la caracterización por resonancia magnética nuclear (NMR) midiendo los parámetros de NMR que permiten la asignación del esqueleto proteico de AF1 que permiten describir sus características dinámicas y de estructura secundaria. Hemos encontrado que, in vitro, AF1* (AR 142-448) posee una tendencia reducida pero notable a asociarse a sí misma formando un estado dimérico. Además, las regiones de AF1* con una tendencia mayor de estructura secundaria y menor flexibilidad también están involucradas en la dimerización de AF1* y coinciden con las regiones que fueron previamente identificadas como funcionales (regiones centrales de Tau-1 y Tau-5). En esa tesis también se ha investigado el papel del NTD del AR en la activación transcripcional a nivel molecular. Se ha estudiado su interacción con RAP74, una subunidad del factor de transcripción general IIF (TFIIF). La interacción del motivo 433WHTLF437 de AR, localizado en la región Tau-5, permite la transactivación por unión con RAP74 en células CRPC. Este novedoso mecanismo podría explicar la transactivación incorrecta en células de pacientes resistentes a la castración. Nuestros datos sugieren que la fosforilación de residuos en el lado N-terminal del motivo puede ser necesario para que se produzca esta interacción. Por último, se ha buscado una explicación de cómo los compuestos actuales que interaccionan con el AR se unen al NTD. Para ello hemos probado a estudiar el mecanismo de interacción de EPI-001, una molécula pequeña que recientemente se ha descrito como un potente inhibidor de AR que interacciona con el dominio NTD de AR y produce la regresión del proceso cancerígeno durante el estado más avanzado. Los resultados obtenidos muestran un mecanismo de reconocimiento específico por el cual EPI-001 interacciona con una conformación poco poblada de Tau-5, conformación que posiblemente esté relacionada con el estado dimérico de AF1.

La proteïna catiònica d'eosinòfil (ECP) és una ribonucleasa que es troba als grànuls secundaris dels eosinòfils. Els nivells d'ECP en fluids corporals s'utilitza com a indicador del número i activació dels eosinòfils. L'ECP és tòxica per diversos patògens com són bacteris, paràsits, virus i per cèl·lules de mamífer.Per identificar immunològicament l'ECP s'ha seleccionat una regió específica de la proteïna (D112-P123) com a possible epítop antigènic. La regió D112-P123 no es troba en l'RNasa A, 1, 4 i 5 i és on s'observa una màxima desviació de l'esquelet de la cadena principal de l'ECP i la neurotoxina derivada d'eosinòfil (EDN) amb la qual comparteix un 67% d'identitat de seqüència. S'han immunitzat conills amb un pèptid sintètic (D112-P123) conjugat a una proteïna transportadora i s'han purificat els anticossos policlonals amb una columna d'afinitat amb l'ECP immobilitzada.L'anticòs D112-P123 reconeix específicament l'ECP en condicions reductores i no reductores i no presenta reactivitat creuada amb l'EDN, l'RNasa A i altres proteïnes control. La immunodetecció per transferència Western amb l'anticòs D112-P123 ha mostrat que hi ha una relació lineal entre la quantitat de proteïna (1-75 ng) i el senyal obtingut. S'ha assajat la reactivitat de l'anticòs D112-P123 en fluids corporals i granulòcits. L'anticòs D112-P123 detecta la forma nadiua no glicosilada i les formes glicosilades de l'ECP en granulòcits, esput i plasma. S'ha obtingut una bona correlació entre els nivells d'ECP determinants amb l'anticòs D112-P123 i amb un anticòs que comercialitza Pharmacia & Upjohn (Uppsala, Suècia).Per estudiar la relació entre l'estructura i les activitats biològiques de l'ECP s'han obtingut variants de la proteïna en residus específics de l'ECP. S'han escollit residus catiònics i aromàtics exposats en la superfície de la proteïna (W10K, W35A/R36A, R75A/F76A, R101A/R104A) i de la regió del loop D115-Y122 (R121A, R121A/Y122A, (_ 115-122) ECP i (115-122 EDN) ECP . S'ha estudiat l'efecte de l'ECP i les seves variants en l'activitat ribonucleasa, la disrupció de membranes, la citotoxicitat per bacteris gramnegatius i grampositius i l'inhibició del creixement de cèl·lules de mamífer. També s'ha realitzat una predicció de l'estructura tridimensional dels mutants per modelatge molecular. Les variants de l'ECP no modifiquen substancialment ni l'estructura tridimensional de la proteïna ni l'activitat ribonucleasa.L'activitat sobre membranes de l'ECP i les seves variants s'ha analitzat utilitzant vesícules sintètiques. L'ECP mostra una clara preferència per desestabilitzar vesícules acídiques resultat que suggereix que les càrregues positives de la proteïna són importants per la interacció amb les membranes. L'estudi de l'efecte de les mutacions en l'activitat sobre les membranes ha mostrat que aminoàcids catiònics específics i els triptòfans de la proteïna (W10, W35R36 i R101R104) estan relacionats amb la desestabilitazació de la membrana.Aquests resultats correlacionen bé amb l'efecte dels mutants en la inhibició del creixement de cèl·lules de mamífer. Les regions W35R36 i W10 són essencials per la inhibició de la proliferació. Altres residus catiònics i aromàtics R75F76, R101R104, Y122 tenen un paper secundari en l'inhibició del creixement que es pot explicar per la possible interacció d'aquests residus amb els carbohidrats de la superfície de les cèl·lules de mamífer.La regió W35R36 té un paper essencial en l'activitat bactericida per grampositius i gramnegatius. Els altres residus estudiats tenen efectes diferents en l'activitat bactericida de l'ECP depenent es tracti d' E. coli o S. aureus. Mentre els residus R101R104 i R75F76 són importants per l'activitat bactericida sobre E. coli, els residus W10 i la regió del bucle D115-Y122 són necessaris per l'activitat bactericida sobre S. aureus. Podem concloure que les regions catiòniques i hidrofòbiques estudiades participen en la capacitat de l'ECP per desestabilitzar membranes biològiques i/o en la interacció de la proteïna amb components de la paret bacteriana o amb els carbohidrats de la superfície de cèl·lules de mamífer. / Eosinophil cationic protein (ECP) is a ribonuclease located in the secondary granules of eosinophils. ECP levels in body fluids are used as an indicator of number and activation of eosionophils. ECP is toxic for many pathogens including bacteria, parasites, virus and for mammalian cells.To identify ECP we have selected a specific loop region of the protein (D112-P123) as a putative antigenic epitope. This sequence is absent in RNase A, 1, 4 and 5 and the polypeptide main chain adopts a specific conformation in ECP and also in eosinophil-derived neurotoxin (EDN) which shares 67 % sequence homology with ECP. A synthetic peptide containing the sequence and linked to a carrier protein was used to obtain rabbit polyclonal antibodies which were further purified by an affinity column with ECP as a ligand. D112-P123 antibody specifically recognizes ECP in reducing and nonreducing conditions and does not cross-react with EDN, RNase A or other control proteins. The immunodetection of recombinant ECP by Western blot has shown a lineal relationship between the quantity of protein (1-75 ng) and the signal obtained. The reactivity of the antibody was assayed in different body fluids and granulocytes. D112-P123 antibody detects the glycosylated and nonglycosylated forms of the native ECP in granulocytes, plasma and sputum. A good correlation has been obtained between ECP levels determined by the antibody D112-P123 and by an antibody obtained from a commercial source. To study the relationship between the structure and biological activities of ECP we have obtained variants of the protein in specific amino acids residues. We have chosen cationic and aromatic amino acids located at the protein surface (W10K, W35A/R36A, R75A/F76A and R101A/R104A) and in the loop region D115-Y122 (R121A, R121A/Y122A, (_ 115-122) ECP and (115-122 EDN) ECP.For the wild type form and mutants we have determined the ribonuclease and membrane-lytic activity, the cytotoxicity for gram negative and gram positive bacteria and the mammalian cell growth inhibition. The three dimensional structure of ECP mutants has been predicted by molecular modelling.ECP variants do not show important changes neither on the three dimensional folding nor on the ribonuclease activity of the protein.The lytic-activity of ECP and mutants on cell membranes has been analysed using synthetic lipid vesicles. ECP shows a notable preference to destabilize acidic liposomes which suggests that the electrostatic interaction between membrane and the protein are important for protein binding. The study of the effect of the mutations in the membrane-lytic activity has shown that specific arginine residues and the two tryptophan residues of the protein (W10, W35R36 and R101R104) are related to the membrane destabilization.This results correlate well with the effect of the mutants in the mammalian cell growth inhibition. W35R36 and W10 are essentials for the inhibition of proliferation while other cationic and aromatic residues, R75F76, R101R104 and Y122, play a secondary role which might be explained for the possible interactions of these residues with the carbohydrates on the surface of mammalian cells.W35R36 are essentials for the bactericidal activity for gram positive and negative bacteria. Other amino acid residues have different effects depending on the bacterial strain E. coli or S. aureus. While R101R104 and R75F76 are necessary for the bactericidal activity for E. coli the W10 residue and the loop region D115-Y122 are necessaries for the cytotoxic activity for S. aureus.We can conclude from the studied ECP mutants that specific cationic and hydrophobic residues studied participate on the ability of the protein to destabilize biological membranes and/or in the interaction of the protein with components of the bacterial cell wall or the surface of mammalian cells.

L’LDL electronegativa (LDL(-)) és una LDL modificada present en circulació amb propietats inflamatòries incloent la inducció de l’alliberament de citoquines en cèl·lules relacionades amb l’arteriosclerosi, tals com monòcits i cèl·lules endotelials. Es coneix poc sobre les vies intracel·lulars activades per l’LDL(-), en especial en monòcits. En aquesta tesi s’han estudiat els primers passos a través dels quals l’LDL(-) indueix l’alliberament d’IL-6, IL-10 i MCP-1 en monòcits humans. Concretament, s’han estudiat els components inflamatoris de l’LDL(-) i la seva interacció amb receptors cel·lulars de monòcits. En relació amb els components inflamatoris, es va observar que la ceramida (CER) és, en part, responsable dels efectes inflamatoris de l’LDL(-). La CER es relaciona amb un augment en la susceptibilitat a l’agregació de l’LDL(-) i a la seva inducció de citoquines en monòcits. Aquestes propietats de l’LDL(-) augmenten a 37ºC i disminueixen per la incubació d’aquesta lipoproteina amb l’HDL. El contingut en CER en l’LDL(-) augmenta per acció de l’activitat tipus fosfolipasa C (PLC), intrínseca en l’LDL(-) i que també es veu inhibida per l’HDL. Aquest fet suggereix que l’activitat PLC de l’LDL(-) participa en les modificacions que tenen lloc en l’LDL nativa (LDL(+)) per a la formació de LDL(-). L’enriquiment d’LDL en CER (CER-LDL)) i el tractament d’LDL amb PLC promouen una LDL que mimetitza l’alliberament de citoquines de l’LDL(-). Tanmateix, l’efecte de la CER-LDL és menor al de l’LDL(-), proposant la possible acció d’altres components en l’LDL(-) que podrien contribuir al seus efectes inflamatoris. En l’estudi dels receptors involucrats en l’alliberament d’IL-6, IL-10 i MCP-1 induït per l’LDL(-) en monòcits es va determinar que CD14 i TLR4 juguen un paper central. L’adició dels anticossos antiTLR4 i antiCD14 va disminuir un 70%-80% l’alliberament de citoquines, mentre que antiTLR2 va disminuir l’alliberament sols en un 15-25%. L’alliberament de citoquines també va disminuir al tractar les cèl·lules amb un inhibidor específic de TLR4. Aquest alliberament de citoquines va augmentar en la línia de monòcits THP1 que sobreexpressen CD14 (THP1-CD14). Aquests resultats es van confirmar per silenciament gènic de TLR4 i CD14. Experiments d’unió van mostrar que l’LDL(-) presenta una gran afinitat per CD14 i TLR4; la neutralització d’aquests receptors va disminuir la quantitat d’LDL(-) unida a monòcits. Per immunoassaig es va demostrar que CD14 és el principal receptor involucrat en la unió de LDL(-). L’LDL(-) uneix CD14, es forma un complex amb TLR4 i d’aquesta manera s’activa la senyalització intracel·lular que donarà lloc a l’alliberament de citoquines per aquestes cèl·lules. L’LDL(-) pot, d’altrabanda, interaccionar directament amb TLR4 per activar la senyal intracel·lular. CD14 i TLR4 són receptors que mitjancen l’alliberament de citoquines induït pel lipopolisacàrid (LPS) present en la membrana bacteriana. Els resultats mostren una competència entre LDL(-) i LPS tant per l’efecte inflamatori com per la unió al receptor CD14 de monòcits i de plaques multipou recobertes de CD14. Aquesta competència podria representar una acció compensatòria de l’LDL(-) en casos d’excessiva inflamació. El contingut augmentat en CER present en l’LDL(-) sembla ser el responsable de l’activació del sistema CD14-TLR4, el qual provoca l’alliberament de citoquines en monòcits. L’alliberament de citoquines induït per la CER-LDL en monòcits va disminuir per l’adició de l’inhibidor de TLR4. La secreció de citoquines induïda per la CER-LDL és similar a la de l’LDL(-), excepte pel fet que la CER-LDL no pot activar l’alliberament de citoquines directament per TLR4 i necessita CD14 per a aquest efecte. En conclusió, l’augment del contingut en CER per l’LDL(-) exerceix un paper central en l’alliberament d’IL-6, IL-10 i MCP-1 a través de CD14- TLR4 en monòcits. / Electronegative LDL (LDL(-)) is a minor modified LDL present in circulation with pro-inflammatory effects, including the induction of cytokine release in cells involved in atherosclerosis, such as endothelial and mononuclear cells. However, the cellular pathways activated by LDL(-) are scarcely understood, particularly in monocytes. In this thesis, we aimed to determine the first steps of the mechanisms by which LDL(-) induces IL-6, IL-10 and MCP-1 release in human monocytes. We focussed the study on the inflammatory components of LDL(-) and their interaction with cell receptors in monocytes. Regarding the inflammatory components, we found that ceramide (CER) is, in part, responsible for the inflammation promoted by LDL(-). CER has been related to the increased LDL(-)-susceptibility to aggregation and the induction of cytokine release in monocytes. These properties of LDL(-) are enhanced at 37ºC and diminished by the incubation of this lipoprotein with HDL. CER levels increase in LDL(-) because of the LDL(-)-intrinsic PLC-like activity, which is also counteracted by HDL. This suggests that PLC-like activity of LDL(-) participates in the modifications undertaken in native LDL (LDL(+)) to form LDL(-). The enrichment of LDL with CER (CER-LDL) and its treatment with PLC-like activity mimics the cytokine secretion of LDL(-), although the effect of CER-LDL does not reach that of LDL(-). This suggests that other components linked to LDL(-) could contribute to its inflammatory effects. The study of the receptors involved in the IL-6, IL-10 and MCP-1 release induced by LDL(-) in monocytes revealed that CD14 and TLR4 were pivotal. The addition of antiTLR4 and antiCD14 antibodies decreased cytokine release by 70%-80%, whereas that of TLR2 inhibited it by 15%-25%. The cytokine release was also diminished when cells were treated with a specific TLR4 inhibitor, but this release increased in a monocytic THP1 cell line overexpressing CD14 (THP1-CD14). These results were confirmed by TLR4 and CD14 gene silencing studies. Binding studies showed that LDL(-) presents high affinity to CD14, and in a lesser extent to TLR4; the neutralisation of these receptors decreased the amount of LDL(-) bound to monocytes. Immunoassay techniques elucidated that CD14 is the main receptor involved in LDL(-) binding. LDL(-) binds to CD14 and, then, form a complex with TLR4 to activate the intracellular signalling leading to cytokine release in these cells. However, LDL(-) can alternatively interact with TLR4 to activate the intracellular signalling. CD14 and TLR4 are receptors that mediate the cytokine release induced by the lipopolysaccharide (LPS) present in the bacterial membrane. The results showed a competition between LDL(-) and LPS for both the inflammatory effect and the binding to CD14 receptor in monocytes and in CD14-coated microtiter wells. This competition could represent an LDL(-)-counteracting role in cases of overwhelming inflammation. The increased content of CER present in LDL(-) seems to be responsible for the activation of the CD14-TLR4 system which leads to cytokine secretion in monocytes. The cytokine release induced by CER-LDL in monocytes decreased with the addition of the TLR4 inhibitor. The CER-LDL-induced cytokine secretion in THP1-CD14 cells was much greater than in THP1 cells, which showed almost null cytokine release. This behaviour of CER-LDL is similar to LDL(-), excepting the fact that CER-LDL is not able to induce its cytokine release directly through TLR4 and needs CD14 for this effect. To sum up, the increased content of CER present in LDL(-) plays a key role in the induction of IL-6, IL-10 and MCP-1 release through CD14-TLR4 in monocytes.

En este proyecto de tesis, hemos desarrollado 3 nuevos procedimientos por electroforesis capilar (CZE) para el estudio de pacientes con errores congénitos del metabolismo. Es un proyecto de investigación de base tecnológica, ya que se han aplicado los conocimientos de la doctoranda en Química para un desarrollo de procedimientos complejos, que os han permitido avanzar en la identificación de pacientes con enfermedades metabólicas. Estos avances se han plasmado en 3 publicaciones científicas en revistas internacionales. En el primer objetivo, hemos aplicado un procedimiento previamente validado en nuestro laboratorio para el diagnóstico de pacientes con defectos congénitos de la glicosilación (CDG). Gracias a este nuevo procedimiento, hemos podido identificar dos nuevos pacientes que habían pasado desapercibidos con los métodos de análisis convencionales (Casado et al, Cerebellum 2012). Además, el mayor grado de automatización de nuestro procedimiento frente al clásico por isoelectroenfoque permite analizar series más largas de pacientes y cuantificar las diferentes forma s de sialotransferrina en función de su grado de glicosilación, que es el biomarcador para los defectos CDG. En el segundo objetivo, nos propusimos estandarizar la cuantificación del neurotransmisor GABA en líquido cefalorraquídeo de pacientes neuropediátricos, ya que no existían referencias previas que detallaran dicho procedimiento (las disponibles, se basan principalmente en experimentación animal). Conseguimos separar GABA de glutamina, aminoácido que coeluía con el GABA y que está unas 5.000 veces más concentrado. Una vez superados los obstáculos técnicos, establecimos valores de referencia de GABA para una población pediátrica y estudiamos diferentes pacientes con trastornos neurológicos de la infancia. A destacar, que se demostró la utilidad de la determinación de GABA para la monitorización de tratamientos antiepilépticos, ya que muchos de ellos modulan el metabolismo del GABA para reducir las crisis epilépticas. Este trabajo ha sido publicado en la revista Electrophoresis (Casado et al, 2013). En el último objetivo, nos propusimos desarrollar un nuevo procedimiento para el análisis de oligosacáridos en orina, como herramienta para el estudio de pacientes con enfermedades lisosmales y del metabolismo de carbohidratos. En ese caso, la única alternativa tradicional es la cromatografía en capa fina, método no automatizable, largo y poco sensible. Hemos conseguido desarrollar un procedimiento por CZE y detección de fluorescencia inducida por láser que mejora considerablemente el método utilizado convencionalmente en la mayoría de laboratorios que estudian a este tipo de pacientes. Este nuevo procedimiento ha sido recientemente aceptado para publicación (Casado et al, Anal Bioanal Chem 2014). / In this thesis project, we have developed 3 new capillary electrophoresis (CZE) procedures for the study of patients with inborn errors of metabolism. This project has a technical approach, se we have taken advantage of the Chemistry knowledge of the student candidate, which allowed us to progress in the identification of new patients with inborn errors of metabolism and other neurological conditions in paediatric patients. These advances have been published in 3 different international scientific journals. In the first aim, we have applied a previously validated procedure in our laboratory for the diagnosis of patients with congenital disorders of glycosylation (CDG). We were able to identify 2 new cases with a very mild phenotype, who were misdiagnosed with the classical diagnostic procedures (Casado et al, Cerebellum 2012). Moreover, this method allows the analysis of large series of patients, since it is automatable. Furthermore, it allows the quantification of the different forms of sialotransferrin according to its glycosylation pattern, which is the more important biomarker for the study of patients with CDG syndromes. In the second aim, we standardized the quantification of the neurotransmitter GABA in cerebrospinal fluid of neuropediatric patients, since there was not scientific references about this topic (only procedures for the analysis of GABA in animal models were available). We got to separate GABA from glutamine, which co-eluted with GABA and it is about 5,000 times more concentrated than GABA is. Once these technical problems were solved, we established reference values for a paediatric population and we analyzed GABA in a cohort of neuropaediatric patients. As a milestone, we demonstrated that GABA analysis may be useful for the monitoring of antiepileptic therapy, since several antiepileptic drugs modulate GABA metabolism. This work has been published in Electrophoresis journal (Casado et al, 2013). For the last aim, we planned to develop a new procedure for the analysis of urinary oligosaccharides, as a diagnostic tool for the study of patients under the suspicion of having some lysosomal storage diseases and also those with some carbohydrate metabolism defects. The only diagnostic tool generally accepted for this purpose is a thin layer chromatography method (TLC), which is time-consuming, not automatable and probably no sensitive enough for identification of some patients with mild phenotypes. We have developed a new CZE procedure with laser-induced fluorescence detection which dramatically improves the conventional TLC method. The description and validation of this new procedure has been recently accepted for publication (Casado et al, Anal Bioanal Chem 2014).

La apolipoproteina J (apoJ) o clusterina (CLU) es una chaperona extracelular que forma parte del sistema de control que actúa para estabilizar las proteínas agregadas. Hay evidencias que muestran la existencia de una relación entre la apoJ y el desarrollo de arteriosclerosis ya que se ha visto que la expresión y la deposición de apoJ están aumentadas en zonas de lesión arteriosclerótica mientras que está ausente en la pared arterial sana. Una porción importante de la apoJ se asocia a las lipoproteínas en plasma, siendo más abundante en la HDL pero también hay una pequeña parte unida a la LDL y VLDL. La primera parte de la presente tesis se centra en el papel de la apoJ sobre las propiedades aterogénicas de la LDL. Hemos visto que la apoJ se une en la circulación plasmática preferentemente a las partículas de LDL agregadas. Experimentos llevados a cabo con LDL deplecionada de apoJ muestran que es más susceptible a agregarse que la LDL total. Por otro lado, la adición de apoJ purificada previene la agregación de la LDL. Estos datos demuestran un papel protector de la apoJ en la inhibición de la agregación de la LDL, que es un proceso clave en el desarollo de la arterioesclerosis. La segunda parte analiza la distribución relativa de la apoJ entre las diferentes lipoproteínas y en forma libre. Nuestros datos muestran que un 20% de la apoJ circulante en plasma está asociado a las lipoproteínas y el 80% en forma libre. Clasificando a los pacientes por el perfil lipídico se observó que en los individuos hiperlipémicos presentan una concentración mayor de apoJ que los normolipémicos. Esto indica que la concentración de apoJ en suero es dependiente del perfil lipoproteico, y está asociada positivamente con la concentración de colesterol y triglicéridos. En pacientes normolipémicos un 30% de la apoJ está asociada a lipoproteínas, mientras que en pacientes hiperlipémicos el porcentaje disminuye a un 17% en hipercolesterolémicos y un 15% en hipertrigliceridémicos. / Apolipoprotein J (apoJ) or clusterin (CLU) is an extracellular chaperone involved in the quality control system which acts stabilizing the aggregated proteins. Growing evidence shows the existence of a relationship between apoJ and the development of arteriosclerosis. ApoJ expression is increased in areas of atherosclerotic lesion while it is absent in healthy arterial wall. A major portion of the apoJ is associated with plasma lipoproteins, and although it is more abundant in HDL, there is also a small fraction bound to LDL and VLDL. The first part of this thesis focuses on the role of apoJ on the atherogenic properties of LDL. Our experiments show that apoJ binds preferentially to aggregated LDL particles in circulation. Experiments with LDL depleted of apoJ (LDL/J-) shows that it is more susceptible to aggregation than total LDL. Furthermore, the addition of purified apoJ prevents LDL aggregation. These data demonstrate a protective role of apoJ in LDL aggregation, which is a key event in the development of the atherosclerotic process. The second part analyzes the relative distribution of apoJ between the different lipoproteins and in free form. Our data show that 20% of circulating apoJ in plasma is bound to lipoproteins and 80% is in free form. Classifying patients by the lipid profile we observed that hyperlipidemic individuals have higher apoJ concentration than normolipemics. This indicates that the apoJ concentration in blood is dependent on the lipoprotein profile, and is positively associated with the concentration of cholesterol and triglycerides. In normolipidemic patients 30% of apoJ is associated with lipoproteins, while in hyperlipidemic patients the percentage decreases to 17% in hypercholesterolemic subjects and to 15% in hypertriglyceridemic subjects.

Las tiorredoxinas (Trx) son proteínas pequeñas y ubicuas implicadas en la reducción de los enlaces disulfuro de sus proteínas diana. El grupo de las Trxs está organizado en distintas clases. Los animales cuentan con sólo dos tipos, una citoplasmática y otra mitocondrial. En plantas hay, al menos, diez familias de TRXs con más de 40 miembros presentes en casi todos los compartimentos celulares. En mitocondrias vegetales sólo se han descrito dos tipos de Trxs; la Trxh en álamo (Populus) y la Trxo1 en Arabidopsis (A. thaliana) y guisante (Pisum sativum), donde ha sido también co-localizada en el núcleo. En esta Tesis hemos llevado a cabo diferentes aproximaciones experimentales con el fin de estudiar con detalle algunas de las posibles funciones de la Trxo1 en células vegetales. En primer lugar, hemos identificado posibles proteínas diana nucleares de PsTrxo1 a través de la utilización de técnicas de cromatografía de afinidad. La identificación de la proteína PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular) y el componente regulador de rutas de ácido abcísico, el receptor de pirabactina 1 (PYR1) establece nuevas funciones para la PsTrxo1 relacionadas con la síntesis de ADN, ciclo celular, metabolismo hormonal y respuesta al estrés. Otra de las funciones descubiertas para esta Trxo1 durante esta Tesis ha sido su papel durante la germinación de la semilla de Arabidopsis. Ensayos de expresión de AtTrxo1 han señalado un alto nivel durante la germinación, particularmente en el embrión de las semillas sugiriendo un papel para AtTrxo1 durante la movilización de reservas en este proceso. Además, ensayos de germinación mostraron que las semillas del mutante KO AtTrxo1 germinaban antes que las semillas silvestres (Wt) en condiciones salinas, si bien, bajo condiciones estándar de crecimiento, ambos genotipos germinaban y se desarrollaban normalmente sugiriendo la importancia de la Trxo1 en el proceso germinativo y la adaptación a la salinidad. La escasa información relativa a la regulación transcripcional de las Trxs vegetales nos condujo en la búsqueda de elementos cis-trans en el promotor de AtTrxo1. Para ello, se realizaron estudios filogenéticos donde se identificaron seis elementos en cis-funcionalmente relevantes que fueron validados por ensayos de β-glucuronidasa. Posteriormente, los ensayos de un híbrido en levadura nos permitieron identificar más de 30 factores de transcripción pertenecientes a seis familias diferentes como posibles reguladores de la expresión de AtTrxo1. Entre ellos, bZIP9 mostró una fuerte interacción con pAtTrxo1 y se comportó como un posible regulador positivo de AtTrxo1, mientras que AZF2, un factor de dedo de zinc fuertemente relacionado con la respuesta a salinidad, se mostró como un posible represor. Finalmente, se iniciaron estudios de muerte celular. Para ello, utilizamos cultivos de células TBY-2 que sobre-expresaban PsTrxo1 y H2O2 como un inductor de PCD (Programmed Cell Death). La respuesta de las células dependió de la intensidad del tratamiento aplicado. Una concentración 15 mM H2O2 provocó una ligera disminución en la viabilidad del cultivo celular sin diferencias entre líneas. Sin embargo, concentraciones superiores a 35 mM causaron un efecto diferenciador sobre la viabilidad de ambas líneas y la línea sobre-expresante murió varios días después que la línea control. En este sentido, las células sobre-expresantes presentaron un menor estrés oxidativo y diferentes marcadores de PCD que justificaron el retraso observado en la muerte celular. En conclusión, estos resultados podrían sugerir la implicación de PsTrxo1 en la tolerancia de TBY-2 a un tratamiento con H2O2 y en el proceso de muerte celular desarrollado en estas condiciones. / Thioredoxins (Trxs) are ubiquitous small proteins involved in the reduction of disulfide bonds of target proteins. Trxs´ group is organized in different types. Animals contain only two types, one cytoplasmic and one mitochondrial. In plants there are at least ten families of Trxs with more than 40 members present in almost all the cellular compartments. In plant mitochondria only two types of Trx have been described, Trxh found in Populus and Trxo1 type in Arabidopsis (A. thaliana) and pea (Pisum sativum), where it has been also co-localized in the nucleus. In this thesis we have carried out different experimental approaches in order to study in greater depth some of the possible functions of the Trxo1 in plant cells. Firstly, we have identified specific potential nuclear targets of PsTrxo1 using affinity chromatographic techniques. The identification of PCNA protein (Proliferating Cell Nuclear Antigen) and the pyrabactin resistance 1 (PYR1) regulatory component of abscisic acid (ABA) receptor establishes new functions of PsTrxo1 related to DNA synthesis, cell cycle, hormonal metabolism and stress response. The role of Trxo1 in seed germination has been studied in this Thesis. Expression assays of AtTrxo1 pointed out a high level during germination, particularly in seeds embryo suggesting the feasible role of AtTrxo1 in storage proteins mobilization occurring in this process. In addition, germination tests showed that mutant seeds (KO AtTrxo1) germinated earlier than wild type seeds (Wt) in saline conditions, although under standard growth conditions, both genotypes germinated and developed normally, suggesting the importance of Trxo1 in germination and adaptation to salinity. The scarce information on the transcriptional regulation of plant Trxs led us to search cis-trans elements in the promoter of AtTrxo1. For this purpose, phylogenetic studies were done and six cis-functionally relevant elements were found. These elements were validated performing tests of β-glucuronidase. Subsequently, one hybrid assays in yeast allowed us to identify more than 30 transcription factors belonging to six different families showed as feasible regulators of AtTrxo1 expression. Among them, bZIP9 showed a strong interaction with pAtTrxo1 and it was identified as a positive regulator, while AZF2, a transcription factor strongly related with salinity response, was identified as a feasible AtTrxo1 repressor. Finally, we initiated different studies on the possible involvement of Trxo1 in cell death. We used overexpressing PsTrxo1 TBY-2 cell cultures and H2O2 as a PCD (Programmed Cell Death) inductor. The response of cells depended on the severity of the treatment. A concentration of 15 mM H2O2 caused a slight decrease in the viability of the cell culture with no differences between control versus overexpressing line. However, concentrations above 35 mM caused a differentiating effect on the viability and the over-expressing line died several days after the control line. In this situation, over-expressing cells presented lower oxidative stress and several PCD markers justifying the observed delay in cell death. In conclusion, these results could suggest the involvement of PsTrxo1 in TBY-2 of H2O2 treatment and in the cell death process developed in these conditions.

La proteïna CK2 és una serina/treonina quinasa present en tots els organismes eucariotes i que actua sobre una àmplia varietat de substrats cel·lulars, implicats en una àmplia gamma de funcions diferents, moltes de les quals són essencials per la cèl·lula. De fet, CK2 ha estat considerada com una proteïna quinasa essencial per la viabilitat de les cèl·lules eucariotes. Les alteracions de CK2 en una àmplia varietat de tumors malignes s’han confirmat en diversos estudis, mostrant-se una activitat quinasa i nivells de subunitats catalítiques incrementades en diferents tipus de tumors humans. Curiosament el paper de CK2 en el carcinoma renal de cèl·lules clares (ccRCC) –un càncer altament agressiu i que constitueix la major part de càncers renals humans- ha estat poc estudiada, malgrat el fet que un informe preliminar indicava que en aquest tipus de tumor la subunitat reguladora CK2β augmentava fins i tot en quantitats superiors que la subunitat catalítica CK2α. L’objectiu d’aquest treball ha estat profunditzar en el coneixement de la situació de CK2 en el ccRCC i estudiar com alteracions i desregulacions entre les seves subunitats poden afectar a la progressió del ccRCC. Amb aquesta finalitat s’han usat d’extractes de teixits i Tissue MicroArrays (TMAs) de biòpsies de pacients amb ccRCC i amb línies renals humanes derivades de túbul proximal silenciades de forma estable per les subunitats reguladores CK2β o les catalítiques CK2α de CK2, les quals han estat usades com a model ex vivo per l’estudi de la patologia. Els resultats obtinguts en aquest treball indiquen que en el ccRCC, no només apareixen alteracions en l’expressió dels nivells de CK2β (donant lloc a relacions CK2α/CK2β diferents en funció del grau i estadiatge tumoral) sinó que hi ha també canvis significatius en les localitzacions d’aquestes subunitats en les etapes més primerencs del tumor. D’altra banda, la disminució de l’expressió mitjançant el silenciament estable de les subunitats reguladores o catalítiques en línies renals humanes, fa que les línies adquireixin un fenotip EMT parcial, presentant característiques pròpies de cèl·lules mesenquimàtiques tals com la pèrdua del marcador epitelial E-cadherina, així com canvis en la morfologia i capacitat de creixement independent d’ancoratge. El fet que alteracions en les relacions de les subunitats de CK2 donin lloc a aquestes propietats mesenquimàtiques, acompanyades per canvis en les seves propietats migratòries i proliferatives, suggereix que alteracions en les relacions entre les subunitats durant el procés neoplàsic participarien en les diferents etapes de la progressió tumoral. / Protein kinase CK2 is a serine /threonine kinase present in all eukaryotes which acts on a wide variety of cellular substrates involved in a wide range of different functions, many of which are essential for the cell. In fact, CK2 has been considered as a protein kinase essential for the viability of eukaryotic cells. The alterations of CK2 in a wide variety of malignancies have been confirmed in different studies, showing increased kinase activity and catalytic subunit levels in different types of human tumours. Interestingly, the involvement of CK2 in clear cell Renal Cell Carcinoma (ccRCC) -a highly aggressive cancer that constitutes most of the human renal cancers- has been little studied despite the fact that a preliminary report indicated that in this type of tumour the regulatory CK2β subunit increased even in higher amounts than the catalytic CK2α subunit. The aim of this work was to deepen in the knowledge of the status of CK2 in ccRCC tumours and to study how alterations and deregulations between its subunits can affect ccRCC progression. To this purpose we have made use of tissue extracts and Tissue MicroArrays (TMAs) from biopsies of ccRCC human tumours and human renal proximal tubular cell lines stably silenced either for the regulatory CK2β or the catalytic CK2α subunits of CK2, which have been used as an ex vivo model for the study of this pathology. The results obtained in this study indicate that in ccRCC, CK2 shows not only alterations in the CK2β expression levels (resulting in different CK2α/CK2β ratios depending on tumour grading and staging) but there are also significant changes in the localizations of these subunits in the early stages of this tumour. Moreover, the decrease in expression through the stable silencing of the catalytic or regulatory subunits of CK2 in human renal cell lines, provokes the acquisition of a partial-EMT phenotype, showing mesenchymal cell properties such as the loss of epithelial marker E-cadherin, as well as changes in their morphology and anchorage independent growth capacity. The fact that changes in CK2 subunits ratios give rise to those mesenchymal properties, accompanied by changes in their proliferative and migratory properties, suggest that alterations in the ratios between these subunits during the neoplasic process participates at different stages of tumour progression.

La proteïna quinasa CK2 és una serina/treonina quinasa molt conservada i ubiqua en organismes eucariotes, implicada en diversos processos cel·lulars importants com proliferació o tumorigénesis. L'enzim de mamífers està format por dues subunitats catalítiques (a y/o a') y dues subunitats reguladores (b) encara que també s'ha descrit l'existència de subunitats catalítiques lliures. La regulació de l'activitat CK2 no és una regulació clàssica mitjançant segons missatgers o fosforilació, de fet la subunitat catalítica té activitat constitutiva. Es postula que la regulació es podria dur a terme per variació de la localització subcel.lular mitjançant interacció con proteïnes adscrites a compartiments subcel.lulares concrets. La proteïna xaperona grp94 (94 kDa-glucose regulated protein) és una proteïna d'estrès que pertany a la família de les hsp90 i que es localitza al Reticle Endoplásmic (RE) de totes les cèl·lules eucariotes. S'expressa constitutivament en condiciones normals y es sobreexpressa en situacions d'estrès com depleció de calci, inhibició de la glicosilació, infecció vírica, agents reductores etc. Utilitzant tècniques de Ressonància Plasmònica, Far Western y Pull down demostrem que el domini carboxi terminal de grp94 interacciona amb la subunitat catalítica de CK2 (CK2a) però no amb la subunitat reguladora ni amb l'holoenzim (a2b2). S'ha pogut mapejar la regió d'interacció entre ambdues proteïnes, utilizant diversos mutants de CK2a, així la regió s'ha delimitat a una regió de lisines (K74-77) molt conservada entre las CK2a de diferents espècies. D'altra banda s'ha demostrat que grp94 té activitat xaperona in vitro sobre CK2a i citrat sintasa (CS). Utilizant assajos d'agregació induïda por xoc tèrmic y tècniques de microscòpia electrònica s'ha determinat que grp94 es capaç d'inhibir l'agregación de CK2a i CS. L'activitat xaperona depén fortament de l'estat d'oligomerització de grp94, de forma que en condicions reductores en que grp94 perd la seva estructura quaternària, la capacitat d'inhibir agregació de proteïnes està disminuïda. S'ha estudiat també la distribució subcel·lular de CK2 i grp94 en un model animal de rates genèticament obeses (fa/fa). Aquestes rates són hiperinsulinèmiques i resistents a insulina degut a una down-regulation del receptor de insulina. S'había descrit en cèl·lules en cultiu que el tractament amb dosis altes d'insulina induïa la sínstesi de grp94. S'ha observat que no hi ha variació ni en els nivells ni en la distribució subcel·lular de grp94 però si hi ha variació tan en els nivells com en la distribució de CK2, que disminueix marcadament en citosol i augmenta en les fraccions membranoses. / Protein kinase CK2 is a highly conserved and ubiquitously distributed serin/threonin kinase described in all eukaryotic organisms. CK2 has been implied in different cellular processes as proliferation or cancer. The mammalian enzyme is composed of two catalytic subunits (a and/or a') and two regulatory subunits (b), but have been described free catalytic and regulatory subunits. Regulation of CK2 is not a classic regulation through second messengers or phosphorylation, furthermore the catalytic subunit posses constitutive activity and it has been postulated that regulation could be done by changes in subcellular distribution due to interaction with different proteins from defined subcellular compartments. The protein chaperone grp94 (94 kDa-glucose regulated protein) belongs to the hsp90 family and is localized in the Endoplasmic Reticulum (ER) of all eukaryotic cells. Is constitutively expressed in absence of stress and is overexpressed under stress conditions as calcium depletion, virus infection, reducing agents etc. In the present work using techniques as Surface Plasmon Ressonance (SPR), Far Western and Pull down assays we have demonstrated that carboxy-terminal domain of grp94 interacts with the catalytic subunit of CK2 (CK2a) but not with the regulatory subunit or with the holoenzyme (a2b2). We mapped the interacting region using different mutants of CK2a, and we delimited the interacting domain to the cluster of lysines present in the helix aC(K74-77) on CK2a. This basic cluster is highly conserved in CK2a from different species but is not present in other kinases of the same family. Furthermore we demonstrated that grp94 has chaperone activity in vitro on CK2a and citrate synthase (CS). Light scattering of aggregated samples (aggregation promoted by heat shock) and electronic microscope imaging of aggregated samples have demonstrated that grp94 is able to protect CK2a and CS from aggregation. Chaperone activity depends on the maintenance of oligomeric state of grp94, then in reducing conditions when grp94 has lost its quaternary structure the ability to inhibit aggregation is diminished. In this work we also have been studied the subcellular distribution of CK2 and grp94 in an animal model of genetically obese rats (fa/fa). Zucker fa/fa rats are hyperinsulinemics and insulin resistant due to a down-regulation of insulin receptor. Additionally it has been described that in cultured cells insulin promoted the overexpression of grp94. In our model there is no variation of the levels or distribution of grp94 but exist differences in the levels and distribution of CK2 in liver of obese rats. In this rats CK2 is lower in the cytosolic fraction and increase in membranous fractions.