Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas Recombinantes y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Los dinucleótidos de adenina nicotinamida (NAD(P)(H)) cumplen un rol fundamental como cofactores enzimáticos, principalmente en reacciones de oxido-reducción. Sus concentraciones intracelulares determinan el estado fisiológico celular, en especial la razón NAD(P)H/NAD(P)+, por lo que es necesario tener métodos que permitan una cuantificación confiable de estas moléculas. Los métodos in vitro e in vivo comúnmente utilizados no permiten determinar el estado redox intracelular con precisión dadas las dificultades analíticas que poseen. El diseño de Sensores Fluorescentes Codificados Genéticamente (GEFS, por su sigla en inglés) ayuda a superar esas dificultades, ya que, estos biosensores permiten la cuantificación in vivo y en tiempo real de moléculas específicas, sin dañar las células estudiadas. Estos sensores se diseñan a partir de la fusión de una proteína fluorescente permutada circularmente con un dominio sensor proteico capaz de generar un cambio conformacional en respuesta a la unión de un ligando específico. Utilizando esta estrategia, muchos GEFS han sido diseñados para la cuantificación in vivo de dinucleótidos. Entre los sensores de dinucleótidos publicados a la fecha de inicio de esta tesis, el sensor Peredox era el único GEFS capaz de detectar la razón NADH/NAD+ intracelular. Peredox utiliza como dominio sensor al represor transcripcional sensible al estado redox T-Rex del organismo Thermus aquaticus. Aunque T-Rex es capaz de unir tanto NADH como NAD+, sólo la unión del dinucleótido reducido induce un cambio conformacional de una forma abierta a una cerrada. Este fenómeno permite a Peredox detectar la razón NADH/NAD+. Usando Peredox y la información estructural de T-Rex como punto de partida, el objetivo de esta tesis fue estudiar los determinantes estructurales de especificidad de dinucleótido con el fin de avanzar hacia la generación de un GEFS capaz de detectar la razón NADPH/NADP+, del cual no hay sensores diseñados a la fecha. Para esto se utilizaron estrategias de Diseño Racional mediante aproximaciones in silico e in vitro. Se determinó experimentalmente que el loop β4-β5 de T-Rex contiene determinantes estructurales de la especificidad por dinucleótido. Mediante análisis de Potenciales Estadísticos, comparación de motivos de especificidad basados en homología y simulaciones de Dinámica Molecular, se determinó los residuos clave en la especificidad por NAD(H) y las mutaciones necesarias para obtener una variante NADPH preferente. Se evaluó el efecto de estas mutaciones en la especificidad por NAD(P)H a través de ensayos in vitro de fluorescencia, obteniéndose un sensor preferente por NADPH. Sin embargo, el sensor no presentó un mecanismo de unión mutuamente excluyente a NADPH y NADP+, condición sine qua non para que un sensor de cuenta de la razón NADPH/NADP+ / Nicotinamide adenine dinucleotides (NAD(P)(H)) play a fundamental role as enzymatic cofactors, mostly on oxidation-reduction reactions. The intracellular concentrations of these dinucleotides determine the cellular physiological state, especially the NAD(P)H/NAD(P)+ ratio, so it is necessary to have methods that allow a reliable quantification of these molecules. The in vitro and in vivo methods commonly used do not allow to determine the intracellular redox state with accuracy, given the analytical difficulties they show. The design of Genetically Encoded Fluorescent Sensors (GEFS) aids to overcome these difficulties, since they can perform real-time in vivo detection of specific molecules, without damaging the cells studied. These sensors are designed from the fusion of a circularly permuted fluorescent protein with a protein sensor domain capable of generating a conformational change in response to the binding of a specific ligand. Using this strategy, many GEFS have been designed for in vivo quantification of dinucleotides. Among the dinucleotide sensors published at the start date of this thesis, the sensor Peredox was the only GEFS capable of detecting intracellular NADH/NAD+ ratio. Peredox uses the redox-sensing transcriptional repressor T-Rex, from Thermus aquaticus, as a sensor domain. Although T-Rex is capable of binding both NADH and NAD+, only the binding of the reduced dinucleotide induces a conformational change from an open to a closed form. This phenomenon allows Peredox to detect the NADH/NAD+ ratio. Using Peredox and the structural information of T-Rex as a starting point, the goal of this thesis was the study of the structural determinants of dinucleotide specificity, with aim to achieve to a GEFS capable of detecting the NADPH/NADP+ ratio. There is no sensor designed for this parameter to date. To achieve this goal, we used Rational Design strategies, through in silico and in vivo aproximations. We determined experimentally that β4-β5 loop of T-Rex contains structural determinants of dinucleotide specificity. Through statistical potential analysis, homology-guided comparison of specificity motifs and Molecular Dynamics simulations, a triple mutant of T-Rex was proposed. The effect of these mutations on the specificity for NAD(P)H was evaluated through in vitro fluorescence assays, obtaining a Peredox variant with NADPH preference. However, the sensor did not show a mutually-exclusive binding fashion of NADPH and NADP+, a sine qua non condition for a sensor of the NADPH/NADP+ ratio / Fondecyt

Tesis Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las hemocianinas, glicoproteínas de alto peso molecular cuya función más conocida es transportar el oxígeno en algunos moluscos, son ampliamente utilizadas en aplicaciones biomédicas y biotecnológicas. La hemocianina más empleada para estos propósitos, conocida como KLH, proviene de la Lapa californiana Keyhole limpet (Megathura crenulata), y en Chile se han descubierto dos hemocianinas sustitutas que provienen de las especies litorales Concholepas concholepas (CCH) y Fissurella latimarginata (FLH). Las hemocianinas se utilizan como carriers de moléculas de haptenos y péptidos, como adyuvantes en vacunas y como inmunoestimulantes no específicos en la terapia contra ciertos tipos de cáncer, pues al ser inoculadas en mamíferos inducen una respuesta inmune adaptativa del tipo Th1, caracterizada por la síntesis de IFN-γ, fundamental en la destrucción de células tumorales e infectadas con patógenos. Los efectos inmunogénicos y antitumorales de las hemocianinas se han atribuido a su tamaño (4-8 MDa), a su estructura cuaternaria didecamérica con múltiples epítopos repetidos, a su xenogenicidad, y a sus azúcares, mayoritariamente N-glicosilaciones heterogéneas y complejas ricas en manosa, que alcanzan un 3-4% (p/p). Se ha demostrado que las N-glicosilaciones tienen funciones estructurales en la hemocianina de Tadorodes pacificus, sin embargo, este aspecto está escasamente estudiado en CCH, FLH y KLH, así como también el rol de los azúcares en sus efectos inmunológicos. Al respecto, se ha descrito que las hemocianinas son endocitadas por células presentadoras de antígenos (APCs) vía receptores de reconocimiento de patógenos de la familia lectina tipo C (CLRs), los cuales reconocen azúcares ricos en manosa, tales como el receptor de manosa (MR), Dectina-1 y Dectina-2, estimulando la secreción de citoquinas que generan un ambiente proinflamatorio benéfico. Sin embargo, no se ha estudiado experimentalmente la contribución de los azúcares sobre la estructura y la respuesta inmunomoduladora y antitumoral de dichas hemocianinas, por lo cual, en base a los antecedentes, se sustenta la siguiente hipótesis: “La eliminación enzimática de N-glicosilaciones en hemocianinas de gastrópodos, tales como KLH, CCH y FLH, disminuye la formación de estructuras didecaméricas y sus propiedades inmunogénicas y antitumorales en mamíferos”. CCH, FLH y KLH fueron N-desglicosiladas enzimáticamente utilizando PNGasa F y también, químicamente con peryodato de sodio como control. Posteriormente fueron analizadas según parámetros bioquímicos que incluyeron dot blot con lectinas, tinción de PAS y Lectin array blot para determinar la presencia de azúcares remanentes, y además, se realizaron análisis mediante SDS-PAGE, microscopía electrónica de transmisión y dicroísmo circular para determinar las modificaciones estructurales. Los resultados principales indicaron que la N-desglicosilación enzimática es parcial, selectiva, y que los azúcares remanentes corresponden principalmente a fucosilaciones. Además, la N-desglicosilación no afectó la estructura secundaria ni el desplegamiento, pero sí la estructura cuaternaria y el replegamiento de estas glicoproteínas. Los estudios inmunoquímicos mediante ELISA demostraron que la unión de hemocianinas desglicosiladas a CLRs quiméricos (MR-Fc, Dectina-1-Fc y Dectina-2-Fc) disminuye, en comparación con la unión de las hemocianinas nativas. Además, se demostró que la unión de hemocianinas al MR y Dectina-2 es específica para manosa, no así la unión a Dectina-1. Estudios mediante citometría de flujo y ELISA, en los que se evaluó el efecto funcional de la N-desglicosilación de las hemocianinas, sobre la unión/incorporación y secreción de citoquinas proinflamatorias en la línea de macrófagos murinos J774.2, demostraron que los N-glúcidos de estas glicoproteínas contribuyen a su unión/incorporación en dichas células, así como a la producción de las citoquinas proinflamatorias TNF-α IL-6 e IL-12p40. Finalmente, se realizaron estudios inmunológicos en los que se evaluó el efecto de la N-desglicosilación de hemocianinas sobre la respuesta humoral específica y antitumoral en un modelo murino de melanoma B16F10. Los resultados demostraron que la N-desglicosilación disminuyó el título de anticuerpos anti-hemocianinas, indicando una respuesta humoral desfavorecida. Respecto al potencial antitumoral, el volumen tumoral y porcentaje de animales con tumor no mostraron diferencias entre hemocianinas nativas y N-desglicosiladas con CCH y FLH, pero sí con KLH, donde se observó un mayor volumen tumoral en el grupo tratado con hemocianina N-desglicosilada. El conjunto de los resultados obtenidos, confirman el rol de los N-glúcidos de CCH, FLH y KLH a nivel de su estructura cuaternaria, y además, sugieren fuertemente que las N-glicosilaciones participan en su reconocimiento por algunos receptores lectina tipo C, así como en su efecto proinflamatorio en células presentadoras de antígenos. Finalmente, la N-desglicosilación disminuye la respuesta humoral anti-hemocianinas, sin embargo, se requieren experimentos adicionales para confirmar su rol en el efecto antitumoral / Hemocyanins are huge glycoproteins with several applications in biomedicine and biotechnology, whose better-known function is to carry oxygen in the hemolymph of some mollusks. The most used hemocyanin is named as KLH, from the keyhole limpet (Megathura crenulata), and two substitute hemocyanins have been described in Chile, from the species Concholepas concholepas (CCH) and Fissurella latimarginata (FLH). Hemocyanins act as non-specific immunostimulants when inoculated in mammals, inducing an adaptative Th1 immune response, characterized by the secretion of IFN-γ, essential in the destruction of tumoral and infected cells. By this property, hemocyanins are widely used in biomedicine as carriers of haptens/peptides, as adjuvants in vaccines, and as immunostimulants in therapies against certain types of cancer. Their immunomodulatory properties have been attributed to their high molecular weight (4-8 MDa), their complex quaternary structure, their xenogenicity and their high and heterogeneous glycan content, mainly mannose-rich N-glycans that reach up to 3-4% (w/w). Studies in the hemocyanin of Todarodes pacificus and other glycoproteins suggest a structural role of N-glycans, however, this role has been scarcely studied in CCH, FLH, KLH, as well as the role of N-glycans on their immunostimulant properties. Hemocyanins are incorporated by antigen presenting cells (APCs) through mannose-recognizing C-type lectin receptors (CLRs), such as mannose receptor (MR), Dectin-1 and Dectin-2, promoting the secretion of beneficial proinflammatory cytokines. Nevertheless, the contribution of glycans to the structure and the immunomodulatory and antitumor properties of CCH, FLH and KLH has not been experimentally demonstrated. Based on the bibliographic background, the proposed hypothesis is that: “The enzymatic N-deglycosylation of gastropods hemocyanins, such as KLH, CCH and FLH, disfavors the quaternary didecameric structure, and their immunogenic and antitumor properties in mammals”. Hemocyanins were enzymatically N-deglycosylated by PNGase F, and as a control, they were chemically deglycosylated by oxidation with sodium periodate. Analyses by dot blot and lectin array blot suggest that N-deglycosylation is selective and partial, leaving fucose-rich residual glycans. Also, analyses by SDS-PAGE, transmission electron microscopy and circular dichroism showed that N-deglycosylation did not affect the secondary structure or unfolding of hemocyanins, but it disfavored the association of subunits to form quaternary structures and their refolding. Moreover, ELISA binding assays showed that the binding of deglycosylated hemocyanins to chimeric CLRs (MR-Fc, Dectin-1-Fc and Dectin-2-Fc) decreased, compared with native hemocyanins. Besides, the binding of hemocyanins to MR and Dectin-2, but not to Dectin-1, was specific for mannose-rich glycans. Experiments by flow cytometry and ELISA, performed in J774.2 macrophage cells, showed a decreased binding and incorporation of N-deglycosylated hemocyanins in these cells, and also showed a decrease in the secretion of proinflammatory cytokines, such as TNF-α, IL-6 and IL-12p40, by N-deglycosylated proteins. Moreover, studies in a B16F10 murine model of melanoma were performed, to study the contribution of N-glycans to the humoral and antitumor responses induced by hemocyanins. ELISA assays showed a decreased antibody titer in mice immunized with N-deglycosylated hemocyanins, compared with their native forms. Nevertheless, no clear effects of N-deglycosylation on antitumor properties were observed, as mice immunized with native and N-deglycosylated CCH and FLH did not showed differences in tumor volume and tumor incidence. In contrast, mice immunized with N-deglycosylated KLH showed an increased tumor volume, compared with the native KLH group. Altogether, these results confirm that the N-glycans of CCH, FLH and KLH are essential for their didecameric structure. Similarly, N-glycans of hemocyanins contribute to their incorporation through CLRs, to the activation of the proinflammatory response by APCs, and to the humoral anti-hemocyanin response. However, further analyses are required to confirm the participation of N-glycans on their antitumor properties / FONDECYT; BIOSONDA; FUCITED

Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las hemocianinas provenientes de los gastrópodos Megathura crenulata, conocida como KLH, Concholepas concholepas (CCH) y Fissurella latimarginata (FLH), presentan propiedades inmunomoduladoras en mamíferos, las cuales han permitido su uso en biomedicina como proteína carrier de antígenos tumorales y como inmunoestimulantes no específicos en el tratamiento de ciertos cáncer. Para explicar esta propiedad se han invocado características tales como su tamaño, xenogenicidad, estructura compleja y contenido de azúcares, siendo este último uno de los rasgos estructurales de importancia en esta Tesis, ya que podrían ser reconocidos por receptores de inmunidad innata de tipo lectinas tipo C (CLRs), presentes en células presentadoras de antígeno (APCs). La endocitocis mediada por CLRs, tales como el receptor de manosa (MR), DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin) o MGL (macrophage galactose lectine), tiene diversas consecuencias en la respuesta inmune y una de ellas es la presentación cruzada de antígenos por APCs, un mecanismo por el cual los péptidos antigénicos de proteínas exógenas, que se presentan normalmente en el contexto de antígenos de Histocompatibilidad de Clase II (MHC II) a linfocitos T CD4+, son cargados en MHC de clase I y presentados a linfocitos T CD8+, células fundamentales en la respuesta inmune celular antitumoral. Siendo las hemocianinas antígenos exógenos, la hipótesis ha sido que: la endocitosis de las hemocianinas mediada por receptores lectinas tipo C en APCs, conduce a su presentación cruzada. Para estudiar la unión de las hemocianinas y los CLRs, se realizaron ensayos de unión in vitro mediante ELISA, entre quimeras recombinantes del MR y DC-SIGN con hemocianinas nativas y desglicosiladas; además de ensayos de inhibición con sus ligandos naturales, en presencia y ausencia de EDTA. Se caracterizó la interacción receptor/ligando utilizando SPR (surface plasmon resonance), permitiendo determinar las constantes de afinidad aparente entre las hemocianinas y dichos receptores. Además, mediante citometría de flujo se realizaron estudios en un modelo artificial de células. CHO que sobre-expresan el MR y, con APCs humanas y murinas. Usando microscopia confocal de fluorescencia y marcadores específicos, se estudió en APCs murinas a qué compartimento intracelular se destinan las hemocianinas. Finalmente, se iniciaron los estudios para determinar si APCs murinas y líneas tumorales internalizan y presentar las hemocianinas en MHC-I. Los principales resultados muestran que las hemocianinas interactúan con más de un receptor, así CCH, FLH y KLH interactúan con MR y DC-SIGN, pero solo FLH y KLH lo hacen con MGL. Además, se demostró en APCs murinas, que la incorporación de hemocianina es inhibida parcialmente por EDTA y D-Manosa. Por otro lado, se observó que el MR participa en la captura de las hemocianinas en células CHO que sobreexpresan el MR; además, que APCs humanas y murinas, que expresan CLRs, internalizan las hemocianinas. También se encontró, que las tres hemocianinas se destinan a compartimentos lisosomales (Lamp-1+) y endosomas tardíos (Rab7+). Sin embargo, no se encontró CCH en endosomas tempranos (Rab5+), a diferencia de FLH y KLH, sugiriendo diferencias en la ruta endocítica que siguen las hemocianinas una vez internalizadas por las APCs. Así, FLH y KLH podrían estar siguiendo una ruta de procesamiento alternativa, que las conduzca a ser presentadas a linfocitos T CD8+. La vía de procesamiento alternativa de las hemocianinas, podría explicar en parte su efecto antitumoral no específico, ya que sumada a la vía de presentación en MHC II, al activar linfocitos T CD8+ vía MHC I, se liberarían citoquinas y factores humorales que indirectamente, activarían la destrucción de células tumorales u otras respuestas específicas latentes, efecto conocido como bystander / Hemocyanins from the gastropod Megathura crenulata (KLH), Concholepas concholepas (CCH) and Fissurella latimarginata (FLH) have mainly been used as non-specific immunostimulants with beneficial clinical outcomes, to prevent the progression of recurrent superficial bladder cancer or as carriers/adjuvants for producing antibodies against tumor-associated antigens in therapeutic vaccines against cancer. However, the mechanism involved in the positive immunomodulatory effects of these proteins has been scarcely studied. An important feature of these hemocyanins is its carbohydrate content, which can reach up to 3% (w/w), being mannose as the most abundant sugar. These oligosaccharides can be recognized by C-type lectin receptors (CLRs) of innate immunity, such as Mannose Receptor (MR), DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin) or MGL (macrophage galactose lectine), present on antigen presenting cells (APCs). Furthermore, these innate receptors have been involved in classical and alternative antigen presentation by MHC I and MHC II to CD8+ and CD4+ lymphocytes, respectively. Hence, we proposed that CLRs-mediated endocytosis of hemocyanins in antigen presenting cells triggers the cross-presentation of these proteins. In this work, we studied the interaction between CLRs and hemocyanins using indirect ELISA and SPR (surface plasmon resonance). We found that CCH, FLH, and KLH bind to MR and DC-SIGN with high affinity constants; additionally FLH and KLH also bind to MGL. Our results demonstrate that the interaction between MR and hemocyanins trigger their endocytosis, analysed by an artificial CHO-MR system. Furthermore, human and murine APCs-expressing CLRs can uptake hemocyanins and ovalbumin. We also found that hemocyanins uptake by murine macrophages and dendritic cells can be partially inhibited by EDTA and D-Mannose. These results suggest an important role of CLRs in endocytosis and signalling transduction of hemocyanins. On the other hand, we studied the cellular destination of hemocyanins in bone marrow derived dendritic cells (BMDCs) using confocal microscopy. FLH and KLH showed a similar localization in Rab5+, Rab7+ and Lamp-1+ compartments. However, CCH was not found in Rab5+ early endosomes, suggesting differential compartmentalization between the hemocyanins. Thus, FLH and KLH could be involved in an alternative processing pathway such as cross-presentation. Finally, we determined if murine APCs could present hemocyanins on MHC I context. Our results showed that in vitro stimulation of macrophages with FLH, but not with CCH or KLH, increased MHC I and MHC II expression, supporting our hypothesis. Hemocyanins cross-presentation could explain one of the mechanisms involved in the antitumoral effect of these proteins, in addition to the classic presentation by MHC II. Moreover, CD8+ lymphocytes activation could promote cytokines and humoral factors release that indirectly trigger other latent immune responses against the tumoral cells, effect known as bystander effect / FONDECYT; CONICYT; BIOSONDA; FUCITED

El problema que se espera resolver con la ejecución del proyecto propuesto es lograr la atención a la demanda insatisfecha creciente de servicios básicos esenciales en el Análisis de Bioquímica Clínica (Servicio de Hematología, Servicio de Química Sanguínea, Líquidos biológicos, Examen General de Orina, Coproparasitológico simple seriado, Amebas en fresco y Moco fecal) siendo los beneficiarios la población en general de la localidad de Mallasa que asciende a 7.108 habitantes para proporcionar datos cualitativos y cuantitativos que contribuyan y orienten a la prevención, diagnóstico y tratamiento de enfermedades. Por ende, el impacto esperado y deseado tendrá una relación directamente proporcional con lograr satisfacer dicha demanda y cobertura

Les neurones granulars de cerebel es generen a la capa granular externa i es diferencien i migren a traves de la capa molecular per donar lloc a la capa granular interna durant el desenvolupament postnatal del cerebel. Durant aquest procés de maduració,aquestes neurones necessiten l'aportació constant d'estímuls tròfics. Si no és el cas, moren per apoptosi. Aquesta situació que es dóna in vivo és mimetitzable en un cultiu de CGCs. Aquestes neurones són sensibles a les concentracions extracel·lulars de potassi i moren per apoptosi quan són exposades a 5mM de KCl (K5). Per contra, si s'addiciona al medi factors que s'han descrit que participen del seu manteniment in vivo com IGF-1, BDNF, PACAP, l'estimulació amb l'agonista glutamatèrgic NMDA o KCl 25 mM (K25) aquestes es desenvolupen i sobreviuen durant el cultiu. Les BMPs tenen un paper important en la regulació de la diferenciació de les CGCs i se'ls hi ha atribuït efectes anti-apoptòtics en diferents sistemes. En aquest treball ens varem plantejar l'estudi de les BMPs com a possibles factors tròfics per les CGCs. BMP-6 protegeix les CGCs en front de K5 en estadis madurs del cultiu, mentre que BMP-2 i BMP-7 no. Les BMPs senyalitzen a traves de tetràmers de receptors tipus I i II i l'activació d'aquests promou l'activació i translocació al nucli de les proteïnes Smads. La maquinària de resposta a les BMPs s'expressa en les CGCs in vitro. Tot i així, no detectarem diferències en l'estat d'activació de les Smads en les diferents condicions testades. La supervivència d'aquestes neurones s'ha relacionat principalment a l'activació de tres vies de cinases com són la PI3K-Akt, la via de MEK/ERK i la de JNK. Varem estudiar el grau d'activació d'aquestes en K5 i la possible modulació pel tractament amb BMP-6. Mentre que el tractament amb BMP-6 no produeix diferències en l'activació de les vies PI3K-Akt i JNK, sí que indueix una forta activació a temps curts de la via MEK/ERK quan es compara amb K5. Mitjançant l'ús d'inhibidors de la via hem observat com aquesta és la principal mediadora de l'efecte de BMP-6. En aprofundir en la senyalització que es desencadena per sota l'activació de MEK/ERK hem identificat a CREB com a factor de transcripció involucrat en l'efecte. La seva activació resulta en la regulació a l'alça dels nivells de la proteïna anti-apoptòtica Bcl-2 que resulta en la inhibició de l'activació de la caspasa-3 per K5 i la reducció dels nuclis apoptótics. Per altre banda, en la recerca del nexe d'unió entre l'activació del receptor i l'activació de la via MEK/ERK també hem descrit com BMP-6 és capaç d'activar a Rap-1 deixant la porta oberta a la participació d'aquesta proteïna G monomèrica en l'efecte de BMP-6. Així doncs, les nostres dades suggereixen un paper nou de BMP-6 com a factor tròfic en el desenvolupament de les CGCs i que realitzaria aquesta funció a través de l'activació de la via MEK/ERK/CREB. El tractament amb NMDA promou la supervivència de les CGCs en cultiu. Estudis previs en el nostre laboratori i en altres han relacionat l'activació de la via de PI3K-Akt i la inhibició de JNK amb l'efecte protector del NMDA. L'activació o inhibició de vies de cinases cursa en la modulació de l'activitat de factors de transcripció que resulta en canvis en el transcriptoma. Així, varem estudiar els canvis en l'expressió gènica induïts pel tractament amb NMDA.. Varem observar una inducció de gens corresponents a programes de desenvolupament neuronal, neurogènesi i anti-apoptosi. Mitjançant estudi comparatiu amb el treball de Zhang i cols. obtinguérem una llista de candidats a mediar l'efecte del NMDA: atf3, bdnf, cdp, Crem, Fos, Homer1, Nfil3, Pcsk1, Plagl1, Rem2, Snf1lk, vgf i NR4A1-3(Nur77, Nurr1 i NOR-1). Tot i que tots ells presentaven funcions relacionables amb supervivència cel·lular, ens varem centrar en l'estudi dels membres de la família de NR4a pel seu paper desconegut en el desenvolupament del cerebel. Encara que l'expressió dels missatgers de Nur77, Nurr1 i NOR-1 es correspon amb les dades del array, a nivell proteic només Nurr1 presenta una pujada en els seus nivells després del tractament amb NMDA. La reducció dels nivells de Nurr1 mitjançant shRNA resulta en una reducció de l'efecte de NMDA. Tanmateix, hem descrit que CREB és el responsable de la inducció de Nurr1 en resposta a NMDA i que la reducció en l'efecte del NMDA en presència del shRNA de Nurr1 ve acompanyat per una reducció en els nivells de BDNF. A més a més, Nurr1 i BDNF presenten un patró d'expressió correlatiu en el cerebel durant els dies postnatals que s'atribueixen a la migració de les CGCs des de la EGL a la IGL. Donant força a Nurr1 com a mediador de l'efecte supervivència de l'estimulació del NMDAR durant el desenvolupament del cerebel. / Cerebellar granule neurons (CGCs) are generated in the external granule layer (EGL) and they differentiate and migrate trough the molecular layer to form the internal granule layer (IGL) during the postnatal development of the cerebellum. During its maturation they need trophic support to survive. Otherwise, they die by apoptosis. That situation that occurs in vivo can be mimicked in a culture of CGCs. These neurons are sensitive to extracellular potassium concentrations and they die by apoptosis when they are exposed to low potassium concentrations (5 mM KCl, K5). In contrast, the presence in the media of molecules that have been described to participate in hte maintenance of these neurons in vivo like IGF-1, BDNF, PACAP, glutamatergic stimulation with the agonist NMDA or depolarizing concentrations of potassium promote the survival of CGCs during the days in vitro.BMPs have an important role in the regulation of CGCs differentiation and they have been described to promote survival against some pro-apoptotic paradigms. In these work we planned to study the eventual effect of BMPs on CGCs survival. BMP-6 protects from K5 induced apoptosis while BMP-2 and -7 do not. We analyzed the presence of the cannonical signaling machinery associated to BMPs in the CGCs in vitro and we observed that all the elements where expressed. However, they do not participate in BMP-6 effect as we do not observe an increase in the nuclear localization of smads in presence of BMP-6. The survival of CGCs have been closely related with the activation status of some signaling pathways like JNK, PI3K/Akt and MEK/ERK. In order to see if they where involved in BMP-6 effect we analyzed their activation. We didn't detect any difference in the JNK and PI3K/Akt pathways in presence or absence of BMP-6. By contrast MEK/ERK pathway was activated in BMP-6 treated cells. We Took in advance of inhibitors to determine the participation in BMP-6 effect and we observed that BMP-6 was mediate by MEK/ERK pathway. We went further in the study of the signaling involved in BMP-6 effect and we have described that CREB is downstream of MEK/ERK pathway activation and that its activation promotes an increase in Bcl-2 levels that results in the inhibition of caspase-3 induced activation of K5 and the reduction of apoptotic nuclei. Moreover, we show that Rap-1 can be a good candidate to be mediating MEK/ERK activation after BMP-6 treatment. Taking together, our data suggest that BMP-6 could be participating in CGCs maintenance during their development in vivo an that this function would be performed by the activation of MEK/ERK/CREB pathway.NMDA treatment promotes CGCs survival in culture. Previous studies in our laboratory have related the activation of PI3K/Akt and the inhibition of JNK with NMDA protective effect. The activation and inhibition of these pathways results in changes in the activation status of transcription factors that promote changes in the transcriptome. In order to analyze the expression changes after NMDA treatment we performed an array with the Genechip® Rat genome 230 Affymetrix platform. We found an enrichment of neuronal development, neurogenesis and anti-apoptotic programs. Moreover, we performed a comparative analysis with the work of Zhang and cols (Zhang et al., 2007) and we obtained a list o f candidates to mediate NMDA effect: atf3, bdnf, cdp, Crem, Fos, Homer1, Nfil3, Pcsk1, Plagl1, Rem2, Snf1lk, vgf i NR4A1-3(Nur77, Nurr1 i NOR-1). All of them are involved in cellular processes that could be related to CGCs survival. However, we focused our attention in Nr4a subfamily members as their role in cerebellum development haven't been explored. We detected the increase in the expression of Nur77, Nurr1 i NOR-1, although only Nurr1 protein levels were increased in presence of NMDA. Reduction of Nurr1 levels by shRNA revealed its participation in NMDA neuroprotection. Additionally, we described that Nurr1, regulated by CREB in NMDA treated cells, promotes an increase in BDNF levels to develop its function in NMDA effect. We also performed a translation to the in vivo situation and as a first approach we studied the expression of Nurr1 and BDNF in the cerebellum during the postnatal development. Both proteins present a similar kinetic and they are induced in the time that is believed to be when CGCs migrate from the EGL to the IGL. In conclusion, this is the first time that Nurr1 have been described as a mediator of NMDA neuroprotection and our results suggest that this situation could be also occurring in vivo.

La vía de señalización celular MEK5-ERK5 juega un papel importante en sistema nervioso, dado que se activa frente a neurotrofinas, frente al estrés oxidativo producido por reactive oxygen species (ROS), tras la isquemia cerebral y tiene un papel en la especificación de fenotipo neuronal. Sin embargo, poco se conoce sobre los sustratos y proteínas que interaccionan con ERK5. En este trabajo se han identificado proteínas que interaccionan con ERK5 en células de neuroblastoma SH-SY5Y mediante el método TAP (Tandem-Affinity Purification). Se han obtenido diversas proteínas que incluyen proteínas de citoesqueleto, chaperonas y proteínas de metabolismo celular. Entre las proteínas identificadas destacan la proteína chaperona Hsp90β y la piruvato kinasa PKM2. Por otro lado, se ha determinado el papel que juega ERK5 en la isquemia cerebral, utilizando el modelo de privación de oxígeno y glucosa (OGD) en cultivos mixtos de neuronas corticales. ERK5 se degrada rápidamente en respuesta a la OGD en cultivos mixtos de neuronas corticales. Esta degradación es mediada por calpaína. ERK5 también se degrada rápidamente in vivo (4 horas) en córtex de cerebros de ratas Sprague-Dawley sometidas a isquemia por oclusión de la arteria cerebral media. En este trabajo se establece que tras la isquemia, la entrada masiva de calcio a través de los receptores de NMDA y la consiguiente activación de calpaína conlleva la degradación de ERK5, produciéndose así una disminución de los niveles totales de esta kinasa. / MEK5-ERK5 pathway plays an important role in nervous system. This pathway is activated in response to neutrophins, oxidative stress induced by reactive oxygen species (ROS), after cerebral ischemia and plays an important role in neuronal fate determination. However, little is known about substrates and proteins that interact with ERK5. This work describes the search for proteins which interact with ERK5 in the cell line SH-SY5Y using Tandem-Affinity Purification (TAP). Using this technique, we obtained different proteins that include citosqueleton components, chaperons and cell metabolism proteins, among which it is worth highlighting Hsp90β and piruvate kinase PKM2.On the other hand, we have established the role of ERK5 in cerebral ischemia, using oxygen and glucose deprivation model (OGD) in rat mixed neuronal cortical cultures. Using this model we observed that ERK5 is quickly degraded in response to OGD, and that calpain is responsible for ERK5 degradation. ERK5 is also quickly (4 hours) degraded in vivo in cerebral cortex from Sprague-Dawley rats subjected to middle cerebral artery occlusion. On this work we establish that after cerebral ischemia, massive income of calcium mediated by NMDA receptors and resulting activation of calpain entails ERK5 degradation, producing a decrease in total levels of this kinase.

Durant les últimes dècades, l'agregació de proteïnes ha esdevingut un tema d’investigació molt dinàmic que s'estén transversalment per diferents camps de recerca, incloent la bioquímica, la biotecnologia, la biomedicina i la nanotecnologia. D'una banda, l'acumulació de proteïnes en dipòsits amiloids insolubles constitueix una característica comuna de molts trastorns humans, coneguts com a malalties conformacionals. D'altra banda, des d'un punt de vista biotecnològic, l’agregació proteica representa un obstacle habitual en la producció de proteïnes recombinants, que en general s'acumulen en forma de cossos d’inclusió intracel·lulars. Malgrat que els cossos d’inclusió han estat tradicionalment considerats partícules desestructurades i amb molt poc interès, nombroses evidències indiquen que aquests agregats contenen estructura de tipus amiloid, la qual cosa aplana el camí per a emprar-los en l'estudi de l’agregació amiloid. La tesi que aquí es presenta recapitula la feina pertanyent a una sèrie de publicacions relatives a l’agregació amiloid de proteïnes en l'espai intracel·lular. En tres d'aquests treballs, s'utilitzen tres models cel·lulars diferents filogenèticament distants (bacteris, llevats i plantes) per abordar l’estudi de la formació de dipòsits proteics amb l'objectiu de caracteritzar-los i analitzar-ne el seu impacte en el metabolisme cel·lular. En una publicació complementària, explotem els agregats bacterians per tal de desenvolupar un assaig de screening in vitro per trobar moduladors de l’agregació amiloid. Finalment, també s'inclouen dues obres de revisió sobre la deposició de proteïnes en bacteris i el paper d’aquest organisme com a model per a l'estudi de l'agregació amiloid. Les dades obtingudes de tots aquests estudis indiquen que l'agregació en conformació amiloid és una propietat genèrica dels polipèptids i un fenomen omnipresent a la natura. No obstant, l'aparició d'aquests dipòsits en l'entorn cel·lular pot anar acompanyada d'un cert grau de toxicitat. Aquí, analitzem l'efecte d'envelliment promogut pels cossos d'inclusió intracel·lulars en cèl·lules bacterianes. A més, descrivim com les cèl·lules procariotes i eucariotes estan dotades d'una poderosa maquinària de qualitat proteica que permet fer front a aquesta situació perjudicial. Addicionalment, la caracterització en profunditat dels agregats proteics en bacteris i del seu procés de formació permet utilitzar-los com a eina en la recerca d'inhibidors de l'agregació amiloid amb potencial interès biomèdic i farmacèutic. En general doncs, aquesta tesi aprofundeix en l'estudi de l'agregació amiloid de proteïnes i amplia el coneixement per a emprar organismes simples com models cel·lulars rellevants. / During the last decades, protein aggregation has become a dynamic research topic extending across distinct investigation fields, including biochemistry, biotechnology, biomedicine and nanotechnology. On one side, the accumulation of proteins into insoluble amyloid deposits constitutes a common hallmark of many human disorders, known as conformational diseases. On the other side, from a biotechnological point of view, protein deposition is regarded as a usual hindrance in the production of recombinant proteins, which generally assemble into intracellular inclusion bodies. Although inclusion bodies were traditionally considered unstructured particles lacking of interest, the increasing number of evidences indicating that these aggregates contain amyloid-like structure pave the way for employing them in the study of amyloid deposition. The thesis presented here recapitulates the work belonging to a set of publications concerning amyloid protein aggregation in the intracellular space. In three of these works, we use three distinct cellular models phylogenetically distant (bacteria, yeast and plants) to address the formation of protein deposits with the aim to characterize them and to analyze their impact in the cellular metabolism. In a complementary publication, we exploit bacterial aggregates to develop an in vitro screening assay for amyloid modulators. Finally, we also include two revision works about protein deposition in bacteria and its role as model in the study of amyloid aggregation. The data collected from these studies indicate that aggregation into amyloid structures is a general property of polypeptides and a ubiquitous phenomenon in Nature. However, the apparition of these deposits in the cellular environment can be accompanied by a certain degree of toxicity. Here, we analyze the aging effect promoted by intracellular inclusion bodies in bacterial cells. In addition, we report how both prokaryotic and eukaryotic cells are endowed with a powerful protein quality machinery to challenge this damaging scenario. Moreover, the deep characterization of bacterial protein aggregates and their formation process permits their use as a tool in the searching for amyloid aggregation inhibitors with putative biomedical and pharmaceutical interest. Overall, this thesis delves into the study of amyloid protein aggregation and adds insights to employ simple organisms as relevant cellular models.

El PCI es una proteína de 39 aminoácidos con una estructura globular central de 27 residuos y dos colas, N- terminal y C- terminal. La parte globular de la proteína presenta una hélice 310, como única estructura secundaria regular, así como 4 bucles ("loops") y está estabilizada por tres puentes disulfuro formados por las cisteínas C8- C27, C12- C24 y C18- C34. La presencia de estos puentes disulfuro nos permite estudiar el replegamiento del PCI a través de la captura de los intermediarios que se forman en el proceso de plegamiento a partir de la proteína reducida. Esto permite conocer el número de intermediarios dependientes de disulfuro, su diversidad, su estructura y sus propiedades, proporcionándonos información sobre el mecanismo de plegamiento.En una primera fase del presente trabajo, hemos estudiado el aislamiento y la purificación de los intermediarios con tres puentes disulfuro (denominados "scrambled species") a partir de la mezcla de intermediarios que se obtiene tras efectuar el replegamiento del PCI a partir de PCI purificado o a partir de cultivos de E. Coli que expresan PCI. Así mismo, hemos realizado una caracterización estructural de los intermediarios "scrambled" aislados en forma pura, se han determinado sus constantes de inhibición, éstas son del orden mM (unas 1000 veces superiores a la estimada para el PCI nativo). También se ha determinado cuáles son las cisteínas implicadas en cada uno de los puentes disulfuro de la estructura de tales especies mediante digestión proteolítica y mediante reducción química parcial de un puente disulfuro. Finalmente se ha realizado un análisis conformacional por estudios de Dicroísmo Circular y Resonancia Magnética Nuclear, técnicas que nos han permitido observar que tales intermediarios no presentan una estructura mayoritaria definida.En una segunda fase, hemos estudiado la última etapa del camino de plegamiento del PCI, etapa donde las especies '"scrambled"" rompen y vuelven a formar sus puentes disulfuro para dar lugar a la estructura nativa. Con este fin se ha estudiado la estabilidad relativa de estos intermediarios frente a agentes desnaturalizantes y se han llevado a cabo experimentos cinéticos de su evolución a estructura nativa. Estos experimentos han probado que el plegamiento del PCI no tiene lugar a través de una vía única sino que se dan múltiples vías paralelas. Se han observado que los intermediarios que son más estables frente a agentes desnaturalizantes son los que presentan una evolución más lenta hacia la forma nativa.Finalmente en una tercera fase, se ha estudiado la influencia de agentes redox en la producción de PCI recombinante y en otras proteínas relacionadas. Se observó que la expresión de éstos en E. Coli, en forma secretada al medio, se acumulaba gran parte de la proteína en forma de intermediarios tipo "scrambled". Se ha determinado que la forma más eficiente para convertir estas especies en proteína nativa, consiste en la adición al medio tras el cultivo de agentes redox para catalizar el proceso de "reshuffling". De esta forma se consiguen importantes mejoras en el rendimiento de la producción. / Potato carboxipeptidase inhibitor (PCI) contains 39 amino acids. 27 residue composed the central globular structure and the rest composed the queue N- terminal and C- terminal. The globular part of the protein presents an helix 310, as the only secondary structure regular, and 4 loops. The protein is stabilised by tree disulfide bridges composed by the cystines: C8-C27, C12- C24 I C18- C34.The presents of this disulfide bridges let us to study the refolding of PCI by trapping the intermediates formed during the folding pathway of the reduced protein. This process let us know the number of intermediates disulfide dependents, his diversity, his structure and his proprieties, giving us information of the folding pathway.In a first stage of this work, we studied how to isolate and purification the intermediates with tree disulfide bridges (denominated "scrambled spices") by the intermediates obtained from the refolding of PCI, from the PCI purification or from E.Coli cultives. With the pure "scrambled" intermediates we have done a structural characterisation and we have defined their inhibitor constants. Also we defined which are the cystines implicated in each disulfide bridge by proteolysis and by partial chemical reduction to one disulfide bridge. Finaly we have done a conformacional analysis by Circular Dicroism and Nuclear Magnetic Resonance. This techniques reveal us that the intermediates don't have a main structure defined.In a second stage, we have been studied the last step of the folding pathway from PCI. During this step the scrambled spices break and refold their disulfide bridges to give the native structure. We studied the relative stability of the intermediates in front of disnatured agents and kinetics experiments of their evolution a native structure. This experiments reveal that the folding of the PCI isn't by one path, it is by multiple parallel pathways. We have seen that the most stable intermediates in front of disnature agents are the most slow to native structure.Finally in a third stage, we studied the effect of redox agents in the production of recombinant PCI and other relation proteins. We have seen that most protein was accumulate in intermediates type scrambled during the E.Coli expression. We determined that the most efficient conversion to the native form is by the addition of agents redox in the medium after the grow, this agents catalite the reshuffling process. By this form we have good improve in the production rendiment.

The embryo in grasses, at grain maturity, comprises the embryonic axis and the scutellum. The scutellum is supposed to be the single cotyledon in the monocotyledoneus embryos and is attached to the embryo axis in the scutelar node. The embryo has the highest concentration of lipid and lipid soluble vitamins in cereal grains. The embryo in grasses, at grain maturity, comprises the embryonic axis and the scutellum. The scutellum is supposed to be the single cotyledon in the monocotyledoneus embryos and is attached to the embryo axis in the scutelar node. The embryo has the highest concentration of lipid and lipid soluble vitamins in cereal grains. The embryonic axis originates the root, leaves and stem of the new plant. In the mature seed, the embryo axis is formed by the primary root, protected by the coleorhiza, and the stem tip with five or six short internodes and leaf primordia which, as a whole, form the plumule that is surrounded by the coleoptile. The name scutellum (small shield, in latin) derives from its shield-like shape and it liesbetween the embryonic axis and endosperm. Dissected scutellum constitutes 11% or the kernel mass, and about 90% of the embryo. During germination, scutellar epithelial cells suffer an elongation that increases the contact surface between the endosperm and the scutellum and facilitates the transport of the nutrients from the endosperm to the embryo. Scutellar cell elongation is inhibited by ABA and salicylic acid, basic and acid pH and high concentrations of sorbitol. Exogenous gibberellins stimulate elongation, but a reduction in gibberellin synthesis or perception does not inhibit it. Elongation is inhibited by sucrose, but not glucose. Transcription and translation inhibitors reduce scutellar cell elongation, indicating that transcription and translation are necessary for the elongation process. Scutellar epithelium cells play specific roles during germination different to parenchymal cells. So, we expect some differences in the gene expression pattern of this tissue. That’s why we construct a cDNA library using RNA extracted from scutellar epithelial cells 1 day after imbibition and selected them using array hybridization comparing the mRNA accumulated in epithelial cells with the mRNA accumulated in the other scutellar tissues. We identified 30 genes up-regulated in the epithelium. A high proportion of these genes are involved in metabolic processes, the production of energy or in the transport of peptides into the embryo. The roles of 43% of these genes remains undetermined, 27% of them are involved in metabolic processes, 13% in protein synthesis or processing and 7% in cell structure. One of the identified genes from the macroarrays is a peptide transporter: ZmPTR1. It encodes a non-characterized maize peptide transporter protein which has 587 amino acids with a calculated molecular mass of 64.52 kDa. This maize transporter is predominantly expressed in the scutellar epithelium during germination. ZmPTR1 is also expressed to a less extent in the radicle and the hypocotyl. ZmPTR1 is located in the tonoplast and has high sequence similarity with tonoplast di- and tripeptide transporters AtPTR2, AtPTR4 and AtPTR6 from Arabidopsis thaliana. ZmPTR1 is able to transport at least Ala-Ala dipeptide across the membrane and could have a role in the intracellular transport of di- and tripeptides. Seed germination is a complex process that requires cell division, expansion and differentiation. It involves the activation of many metabolic pathways and signal transduction processes, which require a great quantity of energy and stored materials which are provided by seed reserves (oil, storage proteins and starch) and the synthesis and/or activation of many proteins. Plant seeds store triacylglycerols (TAGs) into oil bodies (OBs), specialized organelles which serve as an energy reserve during germination and post-germinative growth. Protein composition analysis of oil bodies from maize embryos during germination identified, in addition to the previously characterized OB-associated proteins, other proteins of diverse function: an embryonic protein DC-8, a globulin 2, 4 proteins with enzymatic activity (protein disulfide isomerase, xylose isomerase, strictosidine synthase and precursor and ATP synthase beta chain), a protein similar to karyopherin- beta-3 (Kap) and a stress induced membrane pore protein involved in membrane transport. Quantitative subproteomic analysis of germinating related changes in the oil bodies of maize scutellum between dry seeds and 2 dai seeds allowed the identification of new proteins interacting with oil bodies in dry seeds or in germinating seeds. In dry seeds: oleosins, cupins, disulfide isomerases, a nucleoside phosphate kinase, a class IV heat shock protein, an embryonic protein DC-8, a 60S acidic ribosomal protein P0 and a rubber elongation factor protein. In germinating seeds: oleosins, mitochondrial protein Tim17, prohibitin-2 and a manganese superoxide dismutase (Mn-SOD). / ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DEL ESCUTELO DE MAÍZ DURANTE LAS PRIMERAS ETAPAS DE LA GERMINACIÓN Durante la germinación, las células epiteliales del escutelo sufren una elongación que aumenta la superficie de contacto entre el endospermo y el embrión y facilita el transporte de los nutrientes del endospermo al embrión. La elongación de las células del escutelo es inhibida por ABA y ácido salicílico, pH básico y ácido y altas concentraciones de sorbitol. Las giberelinas exógenas estimulan la elongación, pero una reducción en la síntesis de giberelinas o percepción no la inhiben. La elongación es inhibida por la sacarosa, pero no la glucosa. Los inhibidores de la transcripción y traducción reducen el alargamiento de las células escutelares, lo que indica que la transcripción y la traducción son necesarias para el proceso de alargamiento. Se identificaron 30 genes que muestran una expresión diferencial significativa en las células epiteliales del escutelo de un día después de la imbibición. Las funciones de un 43% de estos genes no se conoce, el 27% de ellos están involucrados en los procesos metabólicos, el 13% en la síntesis o la transformación de proteínas y el 7% en la estructura celular. ZmPTR1 codifica un transportador de maíz péptido no ha sido previamente caracterizado, se expresa predominantemente en el epitelio escutelar durante la germinación. ZmPTR1 se expresa también en menor medida en la radícula y del hipocotilo. La proteína ZmPTR1 se localiza en el tonoplasto y es homóloga a las otras proteínas transportadoras de di-y tripéptidos AtPTR2, AtPTR4 y AtPTR6 de Arabidopsis thaliana. ZmPTR1 es capaz de transportar al menos el dipéptido Ala-Ala. El análisis proteómico de las proteínas asociadas a los cuerpos lipídicos en escutelo de maíz durante la germinación ha permitido la identificación de, además de proteínas previamente caracterizadas asociadas OB, otras proteínas de funciones diversas. El Análisis cuantitativo subproteómico de los cambios relacionados con los cuerpos lipídicos en el escutelo de maíz entre semillas secas y semillas 2 dias después de la germinación permitieron la identificación de nuevas proteínas que interactúan con los cuerpos lipídicos en las semillas secas o en la germinación de las semillas.

Les plantes disposen d’una sèrie de fotoreceptors que informen de manera contínua sobre les característiques lumíniques ambientals, permetent optimitzar el seu creixement i desenvolupament. Els fitocroms són els fotoreceptors millor caracteritzats, que absorbeixen en la regió del roig (R) i del roig llunyà (FR). De tots els processos que regulen, la síndrome de fugida de l’ombra o SAS (de l’anglès shade avoidance syndrome) és probablement el més important en plantes crescudes en llum. La SAS es refereix al conjunt de respostes induïdes en plantes creixent en alta densitat o sota una coberta vegetal. Malgrat la complexitat d’aquestes respostes, la SAS s’indueix per un sol senyal ambiental, que és la disminució de la raó R:FR, la percepció de la qual pels fitocroms inicia una xarxa transcripcional. En el nostre laboratori ens hem centrat en un grup de gens l’expressió dels quals està ràpida i directament alterada per llum de baixa raó R:FR o ombra simulada, anomenant-los gens PAR (de l’anglès phytochrome rapidly regulated). En la present tesi s’ha aprofundit en l’estudi de la cadena de transducció de la senyal en la SAS en Arabidopsis thaliana, emfatitzant en els punts de connexió amb les rutes transcripcionals hormonals. Resultats d’aquesta tesi, que es complementen amb d’altres obtinguts anteriorment en el grup, demostren que un dels gens PAR, ATHB4, que codifica per un factor de transcripció del tipus Homeo-Domain Leucine-Zipper (HD-ZIP subfamília II), té un paper en la senyalització de la SAS com a un modulador complex en aquestes respostes, involucrant diferents hormones en la seva acció. Per dur-ho a terme es van fer aproximacions amb mutants de guany de funció (de sobreexpressió constitutiva amb activitat induïble) i de pèrdua de funció. Particularment s’ha caracteritzat fisiològica, molecular i histològicament el doble mutant athb4hat3, resultats que mostren una disminució de la resposta a diferents estímuls (hormonals i de llum) d’aquest doble mutant. També hem investigat el paper d’ATHB4 com a regulador del desenvolupament vegetal coactuant amb HAT3 a través d’estudis histològics i moleculars del doble mutant ahb4hat3, el qual mostra fortes alteracions morfològiques relacionades amb la polaritat en el desenvolupament. Per aprofundir, hem investigat el paper dels quatre membres més propers (pertanyents a HD-Zip II) en les respostes SAS i al control hormonal a nivell molecular i/o fisiològic utilitzant línies de sobreexpressió i de pèrdua de funció, englobant els resultats en un possible mòdul regulador de determinades respostes de la planta. Aquesta hipòtesi ve recolzada pels resultats que els identifiquen com a gens reguladors complexos d’aquesta resposta. En paral•lel, hem estudiat l’expressió de SAUR15, un gen de resposta a auxines, BRs i ombra simulada; el qual està regulada per ATHB4 de manera directa. S’han identificat elements E-box i AREs, i s’ha estudiat el seu paper en les respostes a ombra i a hormones. Els nostres resultats mostren que aquests elements no són imprescindibles per a la correcta resposta del promotor als estímuls aplicats. Una altra aproximació fou l’estudi de la resposta SAS de mutants específics de brassinosteroides i auxines (els quals estan relacionats amb la modulació de l’expressió de SAUR15), on resultats de la tesi suggereixen una connexió entre BRs i la resposta a ombra simulada. Els resultats obtinguts en quant a components moleculars involucrats en les respostes SAS provenen de l’anàlisi de tota la plàntula sencera. Donat que els llocs de percepció de la llum i de l’acció poden estar físicament separats a la planta, vam estudiar la importància de la comunicació a llarga distància per entendre com la planta creix i es desenvolupa regulada per la llum durant la SAS, obtenint com a resultat que tant els cotilèdons com el meristem apical són importants, però no imprescindibles, en aquesta resposta. / "Hormonal and genetic control of shade avoidance syndrome in Arabidopsis thaliana " Plants sense the presence of competing neighboring vegetation as a change in light quality: i.e. they sense the reduced ratio of red light to far-red light. The responses to shade are generally referred to as the shade avoidance syndrome (SAS), and involve various developmental changes intended to outgrow or outcompete the neighboring plants. In this thesis we analyzed the function of ATHB4, a gene encoding a homeodomain-leucine zipper (HD-Zip) class-II transcription factor from Arabidopsis thaliana, the expression of which is rapidly and directly upregulated after proximity perception by the phytochrome photoreceptors. Our results, altogether with previous studies in my group, suggest that some members of this small gene subfamily can modulate SAS responses by controlling auxin, brassinosteroid and gibberellin molecular and/or physiological responsiveness. In particular, we propose ATHB4 as a new shade signaling component that participates in integrating shade perception and hormone-mediated growth. To get this conclusion we perform experiments with overexpression and loss-of-function lines. We specially characterized double mutant athb4hat3, which has strong morphological alterations, and which let us find a connection point between light and development concerning polarity.