La majoria dels cultius alimentaris, i en particular els cereals com el blat de moro són deficients en vitamines claus. Les plantes transgèniques podrien ser una solució per mitigar les deficiències de vitamines. No obstant això, en les plantes són limitats els coneixements dels mecanismes que regulen l’acumulació de determinades vitamines, com la vitamina C (àcid ascòrbic, AsA).Per aquesta raó, he investigat el contingut en vitamina C i el mecanisme genètic de les rutes metaboliques que controlen l’acumulació de vitamina C en les plantes de panís i he generat blat de moro transgènic que conté diferents combinacions de gens de la ruta metabòlica de la vitamina C i així, trobar una estratègia per augmentar el contingut d`aquesta vitamina en el endosperm de la llavor del blat de moro. A més a més, com a primer pas, he generat plantes de panís transgèniques que contenen múltiples gens derivats de la bactèria Bacillus thuringiensis amb activitat insecticida. Aquest després serán creaudes amb blat de moro trangénic que conté grans quantitats de vitamines. / Most staple food crops, particularly the major cereals, such as maize are deficient in key vitamins. Transgenic approaches hold great promising promise in alleviating, to a major extend such vitamins deficiencies. However, there is a limited understanding of the regulatory mechanisms that control the accumulation of specific vitamins in plants, such as vitamin C (Ascorbic acid, AsA). For that reason, I analyzed the AsA metabolism and the genetic mechanism of L-galactose biosynthesis pathway controlling ascorbic acid accumulation in corn plants and I also established a combinatorial transgenic corn population comprising different combinations of genes related to AsA metabolism, aiming to provide insight into the interactions among alternative AsA biosynthetic pathways and help in the development of strategies to boost the accumulation of AsA in the endosperm. In addition, I generated transgenic corn plants engineered with multiple insecticidal genes derived from the bacterium Bacillus thuringiensis as a first step in developing corn plants with durable resistance to insect pests. / La mayoría de los cultivos alimentarios, y en particular los cereals como el maíz son deficientes en las vitaminas básicas. Las plantas transgénicas pueden ser una solución muy prometedora para mitigar las deficiencias de vitaminas. Sin embargo, el conocimiento de los mecanismos que regulan la acumulación de determinadas vitaminas en las plantas, es limitado, como por ejemplo la vitamina C (ácido ascórbico, AsA).Para aumentar los conocimientos de la ruta metabolica de la vitamina C en maíz, he analizado el contenido de vitamina C y el mecanismo genético de las rutas metabólicas que controlan la acumulación de está en las plantas de maíz y he generado maíz transgénico que contiene diferentes genes de la ruta metabólica de la vitamina C ya que nos proporcionará una estrategia para augmentar el contenido de esta vitamina en el endospermo de maíz. Además, he generado plantas transgénicas que contienen multiples genes con actividad insecticida derivados de la bacteria Bacillus thuringiensis como primer paso, para obtener plantas resistentes a plagas que más tarde serán cruzadas con maíz nutricionalmente modificado.

INTRODUCCIÓN: La adquisición del fenotipo de resistencia a múltiples fármacos (MDR) en células tumorales las convierte en resistentes a fármacos antineoplásicos y es una de las principales causas del fracaso de la quimioterapia en algunos tumores. La expresión de glicoproteína P (MDR-1, P-gp, ABCB1) contribuye a esta resistencia expulsando los fármacos o regulando la muerte celular programada. Por otro lado, la sobreexpresión de miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 observada en tumores sanguíneos se ha asociado a la resistencia a quimioterapia en varios cánceres humanos. También es importante estudiar alteraciones en las rutas de señalización de MAPKs y la secreción de citocinas en las células con fenotipo MDR. OBJETIVOS: El propósito de este trabajo fue encontrar un estímulo capaz de inducir sensibilidad colateral en células leucémicas murinas y humanas con fenotipo MDR, y caracterizar el tipo de muerte celular inducida. El segundo propósito fue estudiar la contribución de MDR-1, caspasas, proteínas de la familia Bcl-2, MAPKs y citocinas al proceso de sensibilidad colateral. MATERIALES Y MÉTODOS: Para alcanzar nuestros objetivos, usamos células leucémicas murinas L1210 y su sublínea celular resistente L1210R, así como una línea celular procedente de la línea L1210 transfectada con un plásmido que contenía el gen MDR-1 (CBMC-6). Se realizó western-blot para estudiar la expresión de proteínas, inhibición de MAPKs y caspasas y silenciamiento de ARN de MDR-1, Bcl-xL, Bcl-2 y Bax para estudiar el papel de estas proteínas. RESULTADOS: Se encontró que las células leucémicas resistentes con sobreexpresión de P-gp, pero no sus parentales sensibles, son hipersensibles a estrés hipotérmico produciéndose apoptosis a temperaturas por debajo de 4ºC. La transfección de la línea celular parental con un plásmido que contiene P-gp las convierte en sensibles a estrés hipotérmico, demostrando la asociación entre la expresión de P-gp y la muerte celular provocada por el frío. También observamos un incremento de la expresión basal y actividad del fragmento activo de caspasa 3 a temperatura fisiológica (37ºC) en las células MDR. La inhibición de caspasa 3 rescató parcialmente a las células leucémicas MDR de la apoptosis inducida por el frío, lo que sugiere que el mecanismo de muerte celular depende de caspasa 3. Esto demuestra que la expresión de P-gp juega un papel importante en la supervivencia de las células MDR y es acompañada por un proceso de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico. Se observó que la línea parental leucémica (L1210) y la línea celular CBMC-6 presentan una alta expresión de la proteína anti-apoptótica Bcl-xL, mientras que la expresión de Bcl-2 es baja. Por el contrario, en las células L1210R se observó una disminución de la expresión de Bcl-xL y un aumento de Bcl-2. La inhibición de dirigida de proteínas anti-apoptóticas confirma que la expresión de Bcl-xL es un regulador clave de la supervivencia de las células leucémicas. En contraste, el silenciamiento de Bcl-2 muestra que la supervivencia de las células L1210R no depende del nivel de expresión de Bcl-2. Así, nuestros datos demuestran que la supervivencia de la línea celular parental depende de la expresión de Bcl-xL, pero la adquisición del fenotipo MDR elimina esta dependencia y podría depender de varios miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2. Además, los resultados obtenidos en las células CBMC-6 demuestran que P-gp tiene poca influencia sobre las proteínas de la familia Bcl-2. Resultados similares se obtuvieron bajo condiciones de estrés hipotérmico y exposición al fármaco daunomicina. En relación a la ruta de señalización de MAPKs, demostramos su importancia en el desarrollo del fenotipo MDR, así como en el desarrollo de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico, demostrando que la inhibición de ERK y JNK puede proteger, parcialmente, de la muerte celular inducida por el frío en las células L1210R y CBMC-6. CONCLUSIONES: El proceso de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico está asociado al fenotipo MDR en células murinas, y ocurre a través de un proceso de apoptosis dependiente de caspasas. La expresión y funcionalidad de MDR-1 está asociada a la sensibilidad a hipotermia en células murinas. El desarrollo del fenotipo MDR está acompañado de cambios en la expresión de proteínas Bcl-2, pero éstas no influyen en la sensibilidad colateral. La señalización a través de ERK y JNK está implicada en la sensibilidad colateral observada en las células MDR. La señalización a través de citocinas podría tener un papel importante en la respuesta a estrés de las células MDR. / INTRODUCTION: The acquisition of a multidrug-resistant (MDR) phenotype by tumor cells that renders them unsusceptible to anti-neoplasic agents is one of the main causes of chemotherapy failure in human malignancies. The increased expression of P-glycoprotein (MDR1, P-gp, ABCB1) in tumor cells contributes to drug resistance by extruding chemotherapeutic agents or by regulating programmed cell death. In the other hand, over-expression of anti-apoptotic Bcl-2 family members has been reported in hematologic malignancies and has been associated with chemotherapy resistance in various human cancers. As these findings, it is important to study alterations in MDR cells on MAPKs pathway and citokines secretion. OBJECTIVES: The aim of this work was to find a stimulus able to induce collateral sensitivity in murine and human leukemic MDR cells, and to characterize the type of death induced. The second aim was to study the contribution of MDR-1, caspases, family Bcl-2 proteins, MAPKs and citokines to this collateral sensitivity process. MATERIALS AND METHODS: To reach our objectives we used L1210 murine leukemia cells and its resistant derived cell line L1210R, as well as a transfected with a plasmid containing MDR-1 cell line obtained from L1210 (CBMC-6). It was used western-blot to study proteins expression, inhibition of MAPKs and caspases and RNAm silencing of MDR-1, Bcl-xL, Bcl-2 and Bax family to study the role of this proteins. RESULTS: It was found that resistant leukemic cells with P-gp over-expression, but not their sensitive counterparts, are hypersensitive to cold-induced cell death when exposed to temperatures below 4ºC. Transfection of parental cells with a P-gp-expressing plasmid makes these cells sensitive to cold stress, demonstrating an association between P-gp expression and cell death at low temperatures. Furthermore, we observed increased basal expression and activity of effector caspase-3 at physiological temperature (37ºC) in MDR cells. Treatment with a caspase-3 inhibitor partially rescues MDR leukemic cells from cold-induced apoptosis, which suggests that the cell death mechanism may require caspase-3 activity. Taken together, these findings demonstrate that P-gp expression plays a role in MDR cell survival, and is accompanied by a collateral sensitivity to cold stress. We demonstrate that parental leukemic (L1210) and CBMC-6 cells display high constitutive expression of anti-apoptotic Bcl-xL protein, while Bcl-2 protein expression was very low. By contrast, leukemic cells L1210R display a decrease of Bcl-xL and up-regulation of Bcl-2 protein expression levels. Furthermore, targeted inhibition of individual anti-apoptotic proteins by RNA silencing confirms that Bcl-xL expression is a key regulator of leukemic cells survival. In contrast, the silencing of Bcl-2 shows that L1210R survival doesn’t depend on Bcl-2 expression level. Together, our data demonstrate that parental leukemic cells survival are largely dependent on Bcl-xL protein expression, but acquisition of MDR phenotype by such cells abrogate such survival dependence and suggests that resistant cells became probably dependent on more than one anti-apoptotic protein for survival at physiological conditions. Additionally, the results obtained with CBMC-6 cells demonstrate that P-gp exert slight influence in the expression level of Bcl-2 family members. Similar results were obtained under cold stress and drug exposure. Related to MAPKs signaling pathway, we have addressed it importance in MDR phenotype development, as well as in hypothermia collateral sensitivity, showing that ERK and JNK inhibition can protect, partially, against stress-cold induced-death in L1210R and CBMC-6 cell lines. CONCLUSIONS: Collateral sensitivity to cold stress is associated to MDR phenotype in murine cells, and it occurs by a caspase-dependent apoptosis process in murine cells. Expression and functionality of MDR-1 is strongly associated to hypothermia sensitivity in murine cells. MDR phenotype development is accompanied by changes in Bcl-2 family proteins expression, but it is not shown an association with collateral sensitivity. ERK and JNK signaling pathways are implicated in collateral sensitivity process observed in MDR cells. Citokines signaling could play an important role on MDR cells stress response.

Los glucosinolatos son compuestos cianogénicos naturales que se degradan por la acción de tioglucosidasas endógenas (mirosinasas) para dar lugar a isotiocianatos, tiocianatos y nitrilos; muchos de ellos han captado la atención por sus diversas propiedades biológicas, entre otras, como agentes preventores del cáncer, biopesticidas, antiafrodisiacos. Luego del secuenciamiento del genoma de Arabidopsis, se ha elucidado mejor la ruta de biosíntesis de los glucosinolatos, identificandose los primeros reguladores de la ruta, estudios de su función, así como relaciones evolutivas entre rutas parecidas. / Glucosinolates are natural cyanogenic compounds that are broken down by the action of endogenous tioglucosidases (mirosinases) to produce isothiocyanates, thiocyanate, and nitriles; many of them call the attention to researchers by diverse biological properties, such as cancer preventing, biopesticides, anti-aphrodisiacs. After the sequencing of Arabidopsis genome was completed, the glucosinolates biosynthetic process has been better elucidated, identifying the first regulators of the pathway, function research, and also the evolution relationship between similar pathways.

Tesi realitzada al Centre de Recerca en Agrigenómica (CRAG) / Los estudios realizados sobre la proteína Arv1 en levaduras y animales indican que estaría involucrada en el mantenimiento de la homeostasis lipídica intracelular, aunque se desconoce su función bioquímica concreta. A. thaliana posee los genes ARV AtARV1 y AtARV2, que codifican las proteínas funcionales AtArv1 y AtArv2, respectivamente, ancladas a la membrana del RE. Partiendo de la hipótesis de que las proteínas AtArv interaccionan con otras proteínas para poder ejercer su función biológica, este trabajo se inició con el cribado de un banco de cDNA de plántulas de Arabidopsis empleando AtArv1 como cebo y la técnica de doble híbrido en levadura (MbYTH), donde se identificó que la proteína maMYB interacciona con AtArv1. La proteína maMYB, codificada por un único gen en Arabidopsis, tiene características de un MTTF de la familia MYB, puesto que contiene un dominio citosólico R2R3-MYB en la región C-terminal y dos DTMs en la región N-terminal. En este sentido, se determinó que maMYB se localiza en las membranas del RE y presenta ambos extremos proyectados hacia el citosol. Además, se demostró que la versión truncada maMYB91-309, que contiene el dominio citosólico R2R3-MYB, se localiza en el núcleo y preferentemente en el nucléolo. El análisis del patrón de expresión de la proteína maMYB reveló que lo hace mayoritariamente en raíz y parte aérea de plántulas de Arabidopsis. Empleando una estrategia de silenciamiento inducible basada en el uso de microRNAs artificiales (amiRNA), se obtuvieron líneas mutantes de maMYB condicionales en donde se observó una reducción pronunciada en los niveles de mRNA y proteína maMYB y una alteración severa del desarrollo de las plántulas de Arabidopsis, que se caracterizó por una reducción del tamaño general de la plántula, una disminución de la longitud de la raíz primaria, una inhibición de la formación de raíces laterales y pelos radiculares, una alteración en la forma, el tamaño y el número de las células de las diferentes capas de la raíz, una desestructuración de las células epiteliales de los cotiledones y una alteración en los niveles de los productos finales de la ruta de esteroles y de sus precursores inmediatos. Mediante el estudio de la expresión génica global con la tecnología RNA‐seq se determinó que el silenciamiento de maMYB provoca la desregulación de grupos de genes involucrados en el desarrollo y el crecimiento de la planta, que son coherentes con el fenotipo observado. Tanto en la raíz como en la parte aérea se identificaron genes desregulados involucrados en la elongación celular y relacionados con la pared celular. En la raíz se identificaron genes desregulados relacionados con la síntesis de chalconas, el transporte de auxinas y la morfogénesis de los pelos radiculares. En la parte aérea se identificaron genes desregulados implicados en la síntesis de fenilpropanoides y auxinas y la respuesta a auxinas. Además, los genes desregulados como consecuencia del silenciamiento de maMYB presentan un alto enriquecimiento de genes regulados epigenéticamente a través de la trimetilación de la lisina 27 de la histona H3 (H3K27me3), lo que sugiere que maMYB podría estar relacionado con este proceso necesario para el correcto desarrollo de la planta. Por otro lado, se observó que la sobreexpresión de maMYB91-309 revierte (en mayor o menor medida) el fenotipo causado por el silenciamiento de maMYB, lo cual avala la funcionalidad in vivo del dominio citosólico y el papel de maMYB como MTTF, cuyo dominio R2R3-MYB citosólico necesitaría liberarse por acción de proteasas intramembrana y trasladarse al núcleo donde ejercería su función. Las alteraciones observadas en el desarrollo de los mutantes de silenciamiento de maMYB sugieren que éste sea un MTTF que se libere en respuesta a estímulos de desarrollo. / In yeast and animals, Arv1 protein is involved in the intracellular lipid homeostasis, although its particular biochemistry function remains unknown. A. thaliana has the ARV genes AtARV1 and AtARV2, which codify the functional proteins AtArv1 and AtArv2, respectively, tethered to the ER membrane. Assuming that AtArv proteins need to interact with other proteins to carry out its biological function, this work was initiated with a screening of a cDNA library from Arabidopsis seedlings using AtArv1 as a bait and the yeast two hybrid version MbYTH, where we identified maMYB as an interactor of AtArv1. maMYB protein, codified by a unique gene in Arabidopsis, has characteristics of MYB family MTTF, since it contains a citosolic R2R3-MYB domain at the C-terminal region and two TMDs at the N-terminal region. In this way, we demonstrated that maMYB is localized in the ER membrane facing both extremes to the citosol, and the truncated form maMYB91-309, which contains the R2R3-MYB domain, is localized in the nucleus and preferentially in the nucleolus. The analysis of the expression pattern of maMYB protein revealed that the highest levels were found in the root and the shoot of Arabidopsis seedlings. Using an inducible silencing strategy based on the artificial microRNAs (amiRNAs) technology, we obtained maMYB inducible silencing mutants that showed a strong alteration in the root and shoot development of Arabidopsis seedlings. Through a global expression study using RNA-seq technology, we determined that maMYB silencing causes the deregulation of gene groups involved in plant development and growth, which is coherent with the observed phenotype. Interestingly, we observed that the maMYB91-309 overexpression revert (at more or less extent) the phenotype caused by maMYB silencing, which support the functionality of the citosolic R2R3-MYB domain in vivo and the role of maMYB as a MTTF, whose R2R3-MYB domain may be released by the action of intramembrane proteases and be transported to the nucleus where it may develop its function. The developmental alterations observed in the maMYB silencing mutants suggest that maMYB might be a MTTF released in respond to developmental cues.

Las ribonucleases humanas son un grupo heterogéneo de proteínas pertenecientes a la superfamilia de la Ribonucleasa A. Estas proteínas se caracterizan por su capacidad de hidrolizar ácidos ribonucleicos y por la presencia de actividad antimicrobiana frente diversos organismos patógenos como bacterias, hongos, parásitos y virus. El primer objetivo del presente estudio doctoral se centra en la caracterización de la actividad antimicrobiana y en modelos de membrana de las formas nativas de la ribonucleasa 3 purificadas a partir de eosinófilos. Las distintas formas nativas presentan modificaciones postraduccionales dadas por diversos grados de glicosilación que se correlacionan con la activación de los eosinófilos durante los procesos inflamatorios. El estudio establece la capacidad antimicrobiana de las formas nativas y su actividad en modelos de membrana. Los resultados indican que las modificaciones postrasduccionales modulan la actividad biológica de la RNasa 3, sugiriendo una contribución in vivo en su función fisiológica. Como segundo objetivo de esta tesis, se evaluó por primera vez en nuestro grupo de investigación la actividad antimicótica de las ribonucleasas 3 y 7 frente al hongo Candida albicans, el cual fue elegido como modelo patógeno eucariota. Se determinó y caracterizó la presencia de actividad frente a Candida por parte de ambas ribonucleasas humanas. Por último, el tercer objetivo de esta tesis se centra en la purificación y caracterización de la ribonucleasa 8, la más reciente ribonucleasa humana descrita, identificada inicialmente en placenta. La RNasa 8 presenta un patrón inusual de enlaces disulfuro respecto a sus proteínas homólogas. Este cambio estructural modifica la estabilidad de la proteína y expone regiones que facilitan el proceso de agregación proteica. Fue necesaria la previa optimización de un protocolo alternativo de purificación. Se analizaron sus propiedades antimicrobianas, sugiriendo su posible participación en la respuesta inmunitaria innata. Los resultados del presente estudio corroboran las propiedades antimicrobianas de diversas ribonucleasas humanas miembros de la familia de la RNasa A, sugiriendo una función ancestral en el sistema de defensa innato. El estudio contribuye a la comprensión de su mecanismo de acción y plantea su potencial uso como herramientas terapéuticas. / Human ribonucleases are a heterogeneous group of proteins belonging to the superfamily of RNase A. These proteins are characterized by their ability to hydrolyse ribonucleic acids and the presence of antimicrobial activity against various pathogens including bacteria, fungi, parasites and viruses. The first objective of this doctoral study is focused on the antimicrobial characterization of native Ribonuclease 3 forms purified from eosinophils. Native forms present posttranslational modifications giving different glycosylation grades that modulate their activity during inflammatory processes. This study aims to establish the antimicrobial properties of native forms purified from eosinophils and their activity in a membrane model system. Results indicate that post-translational modifications contribute to the the protein biological activities, suggesting a related physiological role. As a second objective, we evaluated for the first time the antifungal activity of the antimicrobial RNase 3 and RNase 7 against Candida albicans, an eukaryotic pathogen selected as a simple model to test the antimicrobial mechanism of action. Both human ribonucleases displayed a high antifungal activity. Results highlighted a dual mechanism of action, where cell lysis takes place at high protein concentration, while depolarization, cell internalization and cellular RNA degradation is achieved at sublethal doses. Finally, the last objective is focused on the characterization of ribonuclease 8, also called the placental RNase, the most recent human ribonuclease described. RNase 8 has gained and lost one cysteine residue in non-conserved positions in a mechanism called "disulphide shuffling". The protein tendency to aggregate required the design of an alternative purification protocol. We analysed its antimicrobial abilities, suggesting a possible role in innate defence. The results of this study confirmed the high antimicrobial activity of several human ribonucleases from the RNase A superfamily suggesting an ancestral role in the host immune defence response. The study contributed to the understanding of their mechanism of action and set the basis for applied drug design.

La Serum Amiloide A3 (M‐SAA3) mamària és una proteïna de fase aguda expressada principalment a la glàndula mamària. Els nivells d’expressió de la M‐SAA3 varia en diferents situacions fisiològiques, el que suggereix un rol important a nivell funcional. Per tal d’analitzar les propietats de la proteïna, es van dur a terme quatre estudis. En el primer, la M‐SAA3 va ser expressada de forma recombinant en un sistema bacterià. Aquest pas és important ja que ens proporciona una font de proteïna, en casos en que la purificació de fonts naturals representa clarament un coll d’ampolla. Es va obtenir la seqüència de dues isoformes, però només una va ser expressada recombinantment. La principal diferència entre les dues formes era una deleció en la regió del motiu SNARE, el que suggeria que aquest motiu pot estar implicat en una activitat antibacteriana directe. A més, en el primer estudi es va analitzar la primera funcionalitat. La M‐SAA3 activava la fagocitosi mediada per macròfags, incrementant el nombre de macròfags actiu i la seva capacitat fagocítica. En el segon estudi es va analitzar l’efecte protector a nivell gastrointestinal. La M‐SAA3 clarament reduïa la translocació de bacteris enteropatògens en cèl∙lules CaCo‐2, una línia d’epiteli intestinal comercial. La M‐SAA3 també afectava la expressió de MUC3 i IL‐8, incrementant els seus nivells, el que connecta de forma directa la proteïna amb la resposta immune innata. En el tercer estudi, es va desenvolupar un model intestinal en boví a partir de cultius ex vivo de Plaques de Peyer. Aquests cultius ex vivo ofereixen un ambient únic on coexisteixen diferents tipus cel∙lulars i una aproximació més realista a la situació in vivo. En aquest context la infecció també va ser disminuïda i la M‐SAA3 incrementava els nivells de IL‐8 i INFγ. Per contra, les mucines no es van veure afectades, i la protecció va ser assolida per sobre‐expressió de Occludina i Claudina‐ 2, proteïnes que formen les tight junctions, encarregades de segellar la barrera epitelial. A més, es va demostrar que la M‐SAA3 activa cèl∙lules dendrítiques, incrementant l’expressió de citoquines i marcadors de maduració, migració i presentació d’antigen. En el quart i últim estudi, es va avaluar la possible aplicabilitat a nivell de la industria lletera. La M‐SAA3 va ser infosa intra‐mamàriament durant el secat, un període on es deixa de munyir les vaques per tal d’afavorir la regeneració cel∙lular i augmentar la seva productivitat. La M‐SAA3 va incrementar paràmetres relacionats amb una activació de l’involució tals com les metaloproteinases. Els nivells de proteïna i greix també eren augmentats i es va observar un augment numèric del recompte de cèl∙lules somàtiques. També es va observar que la proteïna incrementava l’expressió de IL‐8 i TNFα en cultius primaris de glàndula mamària, i també inhibia la infecció bacteriana. Finalment, les cèl∙lules dendrítiques també eren activades en absència d’infecció / Mammary Serum Amyloid A3 (M‐SAA3) is an acute phase protein mainly expressed in the mammary gland. The levels of the protein vary in different physiological situations, indicating that may play an important functional role. In order to analyze the protein properties four studies were performed. In the first study, the protein was recombinantly produced in a bacterial expression system. This was important, as difficulty in protein purification from natural sources is a clear bottleneck for functional studies. Two M‐SAA3 isoforms were obtained, but only one succeeded in the recombinant expression. Interestingly, the main difference was in a 3 amino acid deletion in the SNARE motif, which could be implicated in the direct bacterial killing. Moreover, the first functional role was evaluated. M‐SAA3 clearly enhanced macrophages phagocytosis, increasing both the number of active macrophages and the phagocytic capacity. In the second study, the protective effect at a gastrointestinal level was assessed. M‐SAA3 protein inhibited the translocation of enteropathogenic bacteria in CaCo‐2 cells, a commercial intestinal epithelial cell line. In addition, M‐SAA3 protein increased the expression of MUC3 and IL‐8, which directly connected the protein with the innate immune response activation. In the third study, a bovine intestinal model was developed using ex vivo Peyer’s Patches cultures. The ex vivo methodology offered a unique environment where different cell types coexist, and indeed, represent a more similar approach to an in vivo situation. In this context, the infection was also prevented, and a clear innate immune response was activated. M‐SAA3 clearly activated the expression of IL‐8, INFγ but in this case, mucins were not up‐regulated. The bacterial translocation was achieved by an increase in the Occludin and Claudin‐2 expression, tight junction genes that directly participate in the sealing of the epithelial barrier. Furthermore, the M‐SAA3 directly activated dendritic cells functions, increasing their cytokine expression profile and cellular markers related to maturation, migration and antigen presentation. In the fourth and last study, the potential applicability in dairy industry was evaluated. M‐SAA3 was infused in the mammary gland at dry off, a period of milking cessation which permits the mammary gland regeneration for an optimal production in following lactations. M‐SAA3 increased parameters related to an increased involution of the mammary gland, such as metalloproteinases. Also protein and fat were increased and a numerical increase in the somatic cell count was observed. In addition, M‐SAA3 raised the IL‐8 and TNFα levels in primary mammary gland cultures, and inhibited bacterial infection. Finally, dendritic cells were also activated by M‐SAA3 in absence of infection.

Tesis por compendio de publicaciones / Objetivos: el objetivo fundamental de esta Memoria consiste en profundizar en el mecanismo de acción de la tirosinasa. Se centra la atención de este estudio sobre la actividad monofenolasa y se profundiza en el proceso de inactivación suicida. Se investiga la aportación de cada una de las actividades monofenolasa y difenolasa en dicho proceso. Se aborda la caracterización cinética de monofenoles de interés fisiológico. Metodología: 1. Profundizar en el mecanismo cinético de actuación de la enzima en sus actividades monofenolasa y difenolasa. 2. Estudiar la hidroxilación de umbeliferona a esculetina en la ruta de biosíntesis de cumarinas. 3. Establecer una metodología para investigar si un monofenol es inhibidor o sustrato alternativo de la enzima con la ayuda del peróxido de hidrógeno. 4. Diferenciar las actividades monofenolasa y difenolasa en su implicación en el proceso de inactivación suicida. 5. Profundizar en el estudio del mecanismo de inactivación suicida de la enzima en su acción sobre o-difenoles mediante la determinación del efecto isotópico generado en un medio deuterado. 6. Estudiar y analizar los procesos de catálisis e inactivación en la acción de tirosinasa sobre tres tipos de sustratos: o-difenoles, o-aminofenoles y o-fenilendiaminas. 7. Estudiar la acción de tirosinasa sobre hidroxihidroquinona en los procesos de catálisis e inactivación. 8. Estudiar la reacción de tirosinasa con hidroquinona, un monofenol, utilizado como despigmentante. 9. Caracterizar cinéticamente a hidroquinona como un sustrato de tirosinasa con la ayuda del peróxido de hidrógeno. 10. Estudiar la influencia de ácido ascórbico sobre el proceso de hidroxilación de hidroquinona por tirosinasa. 10. Caracterizar cinéticamente a hidroquinona como un sustrato de tirosinasa con la ayuda de cantidades catalíticas de o-difenol y ácido ascórbico. Resultados: 1. Se ha demostrado que tirosinasa podría participar en la ruta de biosíntesis de cumarinas hidroxilando umbeliferona a esculetina. 2. Peróxido de hidrógeno ayuda a demostrar si un monofenol es sustrato o inhibidor de tirosinasa actuando sobre la forma (metatirosinasa) y transformándola en la forma (oxitirosinasa). 3. Los estudios cinéticos con TBF/TBC demuestran que la enzima se inactiva únicamente al actuar sobre o-difenoles. 4. Un conjunto de estudios de efecto isotópico con D2O han puesto de manifiesto que existe una etapa muy lenta en la que se transfiere un protón. Esta etapa podría ser previa a la inactivación suicida. 5. La catálisis de la oxidación de o-difenoles, o-aminofenoles y o-fenilendiaminas, sigue un mecanismo similar: oxidación/ reducción simultánea sobre los dos átomos de cobre. 6. El proceso de inactivación suicida en la acción de la enzima sobre estos sustratos parece seguir un mismo mecanismo, que podría ser la oxidación/ reducción de uno de los átomos de cobre. 7. Los efectos electrónicos de los sustituyentes de C-4 de o-difenoles, o-aminofenoles y o-fenilendiaminas en las etapas de catálisis e inactivación son más importantes en los o-difenoles y o-aminofenles. 8. El producto de hidroxilación de hidroquinona, la hidroxihidroquinona, es un sustrato suicida de la enzima. 9. Se ha puesto de manifiesto que hidroquinona, un agente despigmentante, es un sustrato de tirosinasa. 10. Se ha demostrado que tirosinasa actúa sobre hidroquinona en presencia de oxígeno molecular y peróxido de hidrógeno, ya que este último pasa metatirosinasa (inactiva sobre hidroquinona) a oxitirosinasa (activa sobre hidroquinona). 11. También se ha puesto de manifiesto que tirosinasa actúa sobre hidroquinona en presencia de oxígeno y ácido ascórbico a altas concentraciones, por el paso de metatirosinasa a desoxitirosinasa. Del mismo modo, cantidades catalíticas de tert-butilcatecol y ácido ascórbico en concentraciones de orden micromolar consiguen la acción de tirosinasa sobre hidroquinona a través del paso de metatirosinasa a desoxitirosinasa. / Objectives: The main objective of this report is to deepen the mechanism of action of tyrosinase. The focus of this study is on the monophenolase activity and deepened in the process of suicide inactivation. The contribution of each of the monophenolase and diphenolase activities in this process is investigated. In this regard, the kinetic characterization of monophenols with physiological interest is studied. 1. Deepen in the kinetic mechanism of tyrosinase in their monophenolase and diphenolase activities. 2. Study the hydroxilation of umbelliferone to scueltin in the cumarin biosynthesis pathway. 3. Establish a methodology to investigate if one monophenol is inhibitor or alternative substrate of tyrosinase with the aid of hydrogen peroxide. 4. Discriminate between the monophenolase and diphenolase activities in its involvement on the suicide inactivation process. 5. Deepen the study of suicide inactivation process of tyrosinase in its action on o-diphenols through the determination of isotopic effect generated in a deuterated medium. 6. Study and analyse the catalysis and inactivation processes in the action of tyrosinase on tree types of substrates: o-diphenols, o-aminophenols and o-phenylendiamines. 7. Study the tyrosinase action on hydroxyhydroquinone in the catalysis and inactivation processes. 8. Investigate the action of tyrosinase on a monophenol, hydroquinone, used as lightening. 9. Kinetically characterize to hydroquinone as a substrate of tyrosinase with the aid of hydrogen peroxide. 10. Study the ascorbic acid influence on the hydroquinone hydroxylation process by tyrosinase. 11. Kinetically characterize to hydroquinone as a substrate of tyrosinase with the help of catalytic amounts of o-diphenol and ascorbic acid. Results: 1. It has been shown that tyrosinase could be involved in the biosynthesis pathway of the coumarins by the hydroxylation of umbelliferone to esculetin. 2. Hydrogen peroxide helps to demonstrate whether a monophenol is a substrate or an inhibitor of tyrosinase acting on the form (metatyrosinase) and converting it into the form (oxytyrosinase). 3. The kinetic studies with TBF / TBC show that the enzyme is only inactivated when it acts on o-diphenols. 4. A set of studies of the isotopic effect in D2O have shown that there is a very slow step in which a proton is transferred. It could be considered as a previous step of the suicide inactivation. 5. The catalysis of the oxidation of o-diphenols, aminophenols and o-phenylenediamines occurs through a similar mechanism: simultaneous oxidation / reduction of the two copper atoms. 6. The process of suicide inactivation in the action of the enzyme on these substrates seems to follow the same mechanism which could suppose the oxidation / reduction of one of the copper atoms. 7. The electronic effects of the substituents on the carbon atom C-4 of o-diphenols, o-aminophenols and o-phenylenediamines during the catalytic and inactivation steps are more significant in the case of the o-diphenols and o-aminophenols. 8. The product of the hydroxylation of hydroquinone, hydroxyhydroquinone, is a suicide substrate of the enzyme. 9. It has been shown that hydroquinone, a depigmenting agent, is a substrate of tyrosinase. 10. It has been shown that tyrosinase acts on hydroquinone in the presence of molecular oxygen and hydrogen peroxide because the latter converts metatyrosinase (inactive on hydroquinone) to oxytyrosinase (active on hydroquinone). 11. It has also been found that tyrosinase acts on hydroquinone in the presence of molecular oxygen and ascorbic acid at high concentrations, by transforming metatyrosinase to desoxytyrosinase. Similarly, catalytic amounts of tert-butylcatechol and ascorbic acid at micromolar concentrations induce the action of tyrosinase on hydroquinone by the conversion of metatyrosinase to desoxytyrosinase step.

Els microorganismes estan exposats a canvis en l’ambient que poden implicar una situació d’estrès. El llevat Saccharomyces cerevisiae prefereix condicions acides per proliferar; per tant, l’alcalinització del medi extern li empitjora el creixement. Per superar aquest estrès, el llevat activa diverses vies de senyalització que conformen una complexa xarxa reguladora, provocant un remodelament transcripcional. La via de la calcineurina, activada per l’increment de calci citosòlic en condicions alcalines, governa l’expressió gènica a través del factor de transcripció Crz1. Un estrès alcalí és detectat per la proteïna transmembrana Rim21, un component de la via Rim101, que desencadena una cascada de senyalització provocant l’activació per proteòlisi de Rim101. Aquest factor de transcripció reprimeix l’expressió de NRG1, un altre repressor transcripcional, induint així l’expressió de determinats gens indirectament. La quinasa Snf1 també s’activa per estrès alcalí i té varies dianes a través de les quals controla diferents processos. Entre aquestes, Snf1 inhibeix els repressors Mig1/Mig2 i Nrg1/Nrg2, alleugerint la repressió d’un grup divers de gens. Addicionalment, un increment del pH extern activa la via de senyalització PHO, relacionada amb l’escassetat de fosfat, provocant la inactivació del complex Pho80-Pho85 i la subseqüent acumulació de Pho4 al nucli. Aquest factor de transcripció, conjuntament amb Pho2, és responsable de l’expressió del reguló PHO, la funció del qual és mantenir els nivells de fosfat intracel·lular. El gen ENA1, que codifica una Na+-ATPasa, és un clar exemple de coregulació per diferents vies de senyalització. La seva inducció alcalina depèn de Crz1 i de l’alliberament de la repressió de Nrg1, Mig i Mig2, els quals son inhibits per Rim101 i Snf1. Pho89 és un cotransportador de sodi/fosfat d’alta afinitat membre del reguló PHO. Apart de ser induït per Pho4, sota condicions alcalines l’expressió de PHO89 també depèn de Crz1, sent l’únic gen del reguló PHO que mostra aquesta regulació. En aquest treball ens centrem en la xarxa reguladora que controla la inducció alcalina de PHO89 i el seu possible paper en la resposta a aquest estrès. Mostrem com l’expressió de PHO89 en condicions d’escassetat de fosfat és més feble i retardada en comparació amb l’expressió a pH bàsic. Per altra banda, l’expressió de Pho84, l’altre transportador de fosfat d’alta afinitat, és més potent en condicions de baix fosfat que en condicions d’estrès alcalí. L’efecte de la via de la calcineurina sobre PHO89 es produeix exclusivament a través de Crz1, i aquest factor de transcripció s’uneix al seu promotor poc després de l’estrès alcalí. La via Rim101 també indueix PHO89 en condicions de pH bàsic a través de NRG1. En condicions alcalines, la quinasa Snf1 és fosforilada i és responsable de la fosforilació dels repressors Mig1 i Mig2, que surten del nucli. Tot i això, només Mig2 té un paper rellevant en la repressió de PHO89. A més a més, la mutació reg1, que presenta una Snf1 hiperactiva, provoca un increment dels nivells de PHO89 al llarg del temps. En aquest treball també mostrem la possible relació entre Pho89 i Ena1 en un ambient alcalí. Tots dos gens comparteixen els mateixos factors reguladors que permeten la seva expressió sincrònica després d’un estrès per pH bàsic. Quan l’adquisició de fosfat depèn exclusivament de Pho89, l’absència de ENA1 confereix un fort fenotip de sensibilitat a pH alcalí. En aquesta mateixa situació, les cèl·lules presenten un increment substancial en la concentració de sodi intracel·lular, suggerint que aquesta pot ser la causa dels seus problemes de creixement. Aquests resultats indiquen que la coregulació entre Ena1 i Pho89 permetria el seu acoblament funcional, ja que la capacitat per expulsar sodi de Ena1 serviria de mecanisme de detoxificació, permetent un continu cotransport Na+/Pi en condicions alcalines. / Microorganisms are exposed to slight changes in the environment, which may imply a stressful situation. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae prefers acidic conditions to proliferate; hence, an alkalinization of the external medium impairs its growth. To cope with this stress, S. cerevisiae activates several signaling pathways that create a complex regulatory network, leading to a profound remodeling of the transcriptional profile. The calcineurin pathway, activated by an increase of cytosolic calcium occurring in alkaline conditions, governs gene expression through the transcription factor Crz1. Moreover, high pH stress is sensed by the transmembrane protein Rim21, a component of the Rim101 pathway, which starts a signaling cascade resulting in the proteolytic activation of Rim101. This transcription factor represses the expression of NRG1, another transcriptional repressor, thus indirectly inducing the expression of certain genes. The Snf1 kinase is also activated by alkaline stress and has several targets through which it controls different processes. Among them, Snf1 inhibits the repressors Mig1/Mig2 and Nrg1/Nrg2, alleviating the repression of a diverse group of genes. Furthermore, an increase of the external pH also triggers the PHO signaling pathway, related to phosphate scarcity, causing the inactivation of the Pho80-Pho85 complex and the subsequent accumulation of Pho4 into the nucleus. This transcription factor, along with Pho2, is responsible for the expression of the PHO regulon, the function of which is to maintain the intracellular phosphate pool. The Na+-ATPase-encoding gene ENA1 is an excellent example of coregulation by different signaling pathways. The alkaline induction of this gene depends on Crz1 and on release from the repression by Nrg1, Mig1, and Mig2, triggered by activation of Rim101 and Snf1. Pho89 is a high-affinity sodium/phosphate cotransporter belonging to the PHO regulon. Apart from being upregulated by Pho4, under alkaline conditions PHO89 expression is also dependent on Crz1, being the only PHO gene to display such regulation. In this work we focus on the regulatory network driving the alkaline induction of PHO89 and its possible role in the high pH stress response. We show that the transcriptional profiles of PHO89 between alkaline and phosphate starvation conditions differ considerably, with a much weaker and delayed expression on the latter. In contrast, the expression of Pho84, the other high-affinity phosphate transporter, is stronger in low phosphate conditions than under alkaline stress. The calcineurin effect on PHO89 is mediated exclusively through Crz1, and this transcription factor is bound to its promoter shortly after the alkaline induction. The Rim101 pathway also upregulates PHO89 during high pH stress by impinging on NRG1. After the alkaline stress, the Snf1 kinase is phosphorylated and mediates the phosphorylation of the repressors Mig1 and Mig2, which exit the nucleus under these same conditions. However, only Mig2 has a relevant role in repressing PHO89. Furthermore, the reg1 mutation, which leads to a hyperactive Snf1, results in increased Pho89 levels over time, indicating the importance of Snf1 in the alkaline expression of this transporter. In this study we also show the putative relationship between Pho89 and Ena1 in an alkaline environment. Both genes share several regulatory factors which allow their synchronous expression after high pH stress. Interestingly, when cells rely exclusively on Pho89 for phosphate uptake, the absence of ENA1 confers a strong alkali-sensitive phenotype. In this same situation, cells display a substantial increase in their intracellular sodium concentration, suggesting that this might be the cause of impaired growth. These results point towards the idea that the coregulation exhibited by Ena1 and Pho89 could allow their functional coupling, and that the Na+ extrusion ability of Ena1 could serve as a detoxifying mechanism necessary to support continuous Pho89 Na+/Pi cotransport under alkaline conditions.

El present treball es centra en l’estudi de la producció de proteïnes recombinants en línies cel·∙lulars de mamífer. Concretament, s’ha realitzat l’estudi de tres estratègies de bioprocés, totes elles basades en el cultiu de cèl·∙lules HEK293. Com a proteïna model per a l’expressió de proteïnes heteròlogues s’ha triat la proteïna CapPCV2, la qual conforma la càpsida viral del Circovirus porcí serotip 2 (PCV2). Aquest virus és l’agent causal de PCVDS (porcine circovirus diseases o malaties derivades de circovirus porcí). Aquest terme engloba un conjunt de malalties i síndromes que tenen un elevat impacte econòmic en la indústria porcina. El projecte s’ha enfocat des de la perspectiva de desenvolupament i optimització del bioprocés i, en conseqüència, l’increment de la producció volumètrica ha estat la força impulsora de tot el treball. En primer lloc es presenten els estudis per a la selecció del medi de cultiu i suplements nutricionals. El creixement cel·∙lular depèn en gran mesura de les característiques nutricionals i fisicoquímiques del medi en que se les cultiva. Per tant, trobar el medi adequat és un dels factors clau per a l’expansió del cultiu cel·∙lular. L’estudi inicial de medis de cultiu va permetre augmentar sis vegades la densitat de cèl·∙lules viables en comparació al medi original en que es cultivaven. D’altra banda, s’han explorat diferents estratègies de cultiu, i com a resultat s’ha implementat una estratègia de fed-­‐batch que ha permès arribar a densitats cel·∙lulars de 26.8x106 cell/mL. En el segon i tercer capítol de resultats, s’avaluen tres estratègies diferents per a la producció de la proteïna recombinant CapPCV2 (r-­‐CapPCV2). La primera estratègia ha estat la infecció de cèl·∙lules HEK293 amb un vector adenoviral que codifica el gen de la CapPCV2 (vector generat dins del treball d’aquesta tesis doctoral). Els paràmetres d’infecció s’han estudiat en profunditat per tal de trobar els paràmetres d’infecció (medi de cultiu, MOI (multiplicitat d’infecció), TOI (temps d’infecció) i TOH (temps de recollida)) per a la millora de la producció de la proteïna i el vector adenoviral. La segona i tercera estratègia estan basades en la generació de línies cel·∙lulars estables. Concretament, s’ha generat una línia cel·∙lular productora de r-­‐CapPCV2 a partir de la integració a l’atzar del vector plasmídic en el genoma de la cèl·∙lula. D’altra banda, s’han generat línies cel·∙lulars amb la integració dirigida del gen en llocs prèviament caracteritzats com d’altra transcripció genètica. La integració dirigida s’ha efectuat mitjançant la tecnologia RMCE (recombinant mediated cassette exchange, o bescanvi de casset mitjançada per recombinació). Després de la comparació de les productivitats específiques i volumètriques aconseguides amb cada estratègia, el millor productor va ser seleccionat. Nogensmenys, r-­‐CapPCV2 es produeix en quantitats molt baixes i per tant no ha sigut possible dissenyar un procés de producció rentable i altres alternatives de producció s’haurien d’estudiar en un futur. Finalment, l’estudi d’un comportament metabòlic particular observat en les cèl.lules en cultiu s’ha adreçat des d’una perspectiva fisiològica i metabòlica. A certes condicions extracel·∙lulars, s’ha observat que les cèl·∙lules HEK293 poden consumir de manera simultània glucosa i lactat durant el seu creixement exponencial. Després d’un ampli estudi d’aquestes condicions, s’ha determinat que el canvi de la producció d’àcid làctic (que és el principal problema dels cultius d’alta densitat de cèl·∙lules de mamífer) cap al consum d’aquest metabòlit pot ser generat des de el començament del cultiu quan el pH és de 6.6 i la concentració de lactat és de 4-­‐8mM. En aquestes condicions, ni el creixement cel·∙lular ni la producció de proteïna es veuen afectades negativament. A la llum d’aquests resultats, es genera la hipòtesi de que les cèl·∙lules HEK293 poden co-­‐transportar el lactat extracel.lular i els protons com un mecanisme de detoxificació del pH. D’altra banda, l’aplicació de l’anàlisi de balanç de fluxos (FBA) ha revelat que quan la glucosa i el lactat es consumeixen simultàniament s’aconsegueix un metabolisme “equilibrat”, és a dir els fluxos de la glicòlisi i el cicle TCA esdevenen similars, evitant l’acumulació de piruvat en el citosol, la seva transformació a làctic i finalment la secreció d’aquest metabòlit. Aquest comportament és totalment oposat al que s’observa de forma general en els cultius de cèl.lules de mamífer en creixement exponencial, on els elevats fluxos de la glicòlisi troben una limitació en els fluxos d’entrada a la mitocòndria (és a dir, del cicle TCA) i conseqüentment el lactat és produït i secretat al medi. La construcció d’un model metabòlic i l’aplicació de FBA permetrà fer prediccions in silico de comportaments metabòlics causats per la sobreexpressió o el silenciament de gens diana. Aquesta estratègia obre la possibilitat de generar línies cel·∙lulars que presentin un metabolisme optimitzat per tal d’estudiar estratègies de cultiu més eficients per a l’increment de la densitat cel·∙lular i productivitat de proteïna recombinant. / The thesis is focused on the study of recombinant protein production in mammalian cell lines. In particular, the study of three different approaches of different bioprocesses based on HEK293 cells has been addressed. As a model protein for recombinant expression, CapPCV2 has been selected. This protein makes up the viral capsid of Porcine circovirus serotype 2 (PCV2), which is the causative agent of PCVDs (porcine circovirus diseases), a group of diseases with major impact in pig’s industry worldwide. This project has been addressed from the perspective of bioprocess development and optimization and therefore, the increment of volumetric production of cells, virus and proteins have been the driving force of the research. Firstly, cell culture media and nutritional supplementation studies are presented. Cell growth relies in high extent to the nutritional and physicochemical characteristics of the media in which cells are cultured and therefore, finding the proper cell media is one of the key factors for cell culture expansion. The initial media study resulted in a 6-­‐fold increment of the maximal viable cell achieved in the original media. Besides, different cell culture strategies have been explored, which resulted in a fed-­‐batch strategy that allowed reaching maximal viable cell densities of 26.8x106 cell/mL, which represents 13-­‐fold increment on maximal viable cell density originally reached. In the second and third chapter of results, three different approaches for the expression of recombinant CapPCV2 (r-­‐CapPCV2) are evaluated and discussed. As a first approach, a viral recombinant adenovirus encoding for the gene CapPCV2 has been generated and used as viral vector for the production of the recombinant protein in HEK293 cells. Besides, a deep study of the main parameters that affect the infection performance has been carried out and discussed in order to find the best media, MOI (multiplicity of infection), TOI (time of infection) and TOH (time of harvest) for adenovirus and recombinant protein production. This study was performed with an adenovirus expressing the reporter gene GFP and thereafter, the best infection parameters encountered were applied for the production of r-­‐CapPCV2 (media: SFMTransFx-­‐293 supplemented with 4mM glutaMAX, 5% FBS and 10%CB5; MOI:1; TOI:1x106 cell/mL) and TOH:48hpi). The second and third strategies are both based on the generation of stable producer cell lines, but one strategy relies on illegitimate (or random) integration of the gene in the HEK293 genome ,whereas the other strategy is a site-­‐directed integration of the gene in previously characterized hot-­‐spots (i.e. high-­‐active transcribed regions from genome). The site-­‐directed integration was performed using RMCE technology (Recombinant mediated cassette exchange). After the comparison of the specific and volumetric productivities achieved with each approach, the best producer has been selected. Nevertheless, r-­‐CapPCV2 was poorly produced so it was unfeasible to develop/design a cost-­‐effective industrial bioprocess and other alternatives must be studied in the future. Finally, the study of an unexpected metabolic behaviour observed in HEK293 cells cultured in our lab has been addressed from a physiologic and metabolic perspective. HEK293 cells could concomitantly consume glucose and lactate in exponentially growing cultures at particular environmental conditions. After a deep study of these conditions, it was found out that the switch from lactate secretion (which is the main drawback of mammalian high cell density cultures) to lactate consumption can be triggered from the beginning of cell culture at pH0=6.6 together with the addition of 4-­‐12mM of lactate to media. Remarkably, under these conditions nor cell growth neither protein production were negatively affected. Form these results, we hypothesize that HEK293 can co-­‐transport lactate and H+ to the cytosol as a pH-­‐detoxification mechanism. Moreover, the application of flux balance analysis permitted to find out that when lactate and glucose are consumed together a “more balanced” metabolism is achieved, meaning that glycolytic and TCA fluxes became similar, avoiding pyruvate accumulation at the cytosol and consequently, lactate formation. This is totally opposed to the extensively observed metabolism of exponentially growing mammalian cell lines, where the high flux through the glycolytic pathway encounters a limitation on the fluxes entering the mitochondria (hence, the TCA cycle) and consequently lactate is produced and secreted to media. The construction of a HEK293 metabolic model and the application of FBA will allow making in silico predictions of metabolic beahaviours after the upregulation or downregulation of target genes. This strategy may open the possibility of generate engineered HEK293 cell lines with an optimised metabolism in order to study more efficient cell culture strategies towards the achievement of higher cell densities and product titres.

La via de la PI3K/PKB juga un paper molt important en el sistema nerviós central durant el desenvolupament neuronal. PDK1 és la màster quinasa que s’encarrega de coordinar les diverses senyals de la PI3K, regulant diferencialment l’activació de diferents AGC quinases. A fi d’estudiar el paper de PDK1 al sistema nerviós central, vàrem generar dos models de ratolí que presentaven mutats dos dominis funcionals d’aquesta quinasa: el PH-domain i el PIF-pocket. En aquesta tesi es desenvolupa la caracterització del model de ratolí knock-in condicional que expressa la mutació L155E de PDK1 a sistema nerviós central. Aquesta mutació resulta en la inhabilitació del domini PIF-pocket de PDK1 i per tant en una disrupció del mecanisme d’activació de totes les AGC quinases que no presenten PH-domain, com són RSK, SGK i S6K, però no PKB. La manca d’activació d’aquestes quinases no resulta essencial per les respostes de supervivència i viabilitat cel·lular, però sí que impedeix el correcte desenvolupament neuronal, el que es tradueix en un dèficit de la polarització i diferenciació neuronal. Els defectes en aquests processos neuronals resulten en una reducció de la mida cerebral i en alteracions fisiològiques de regions del cervell com el còrtex o l’hipocamp. Aquestes alteracions impliquen una reducció en la connectivitat neuronal i en la comunicació entre interneurones gabaèrgiques i neurones piramidals, possiblement causada per dèficits en els processos de migració durant el desenvolupament. Tot això condueix a un model de ratolí que presenta alterada la seva conducta davant l’estrès i emula els símptomes negatius i cognitius de trastorns psiquiàtrics com l’esquizofrènia. Aquests resultats mostren la rellevància de PDK1, orquestrant la via de la PI3K, tant durant el desenvolupament neuronal com en la consolidació del correcte funcionament del cervell. / The PI3K/PKB signalling pathway plays an indispensable role in the central nervous system during neuronal development. PDK1 is the master kinase which orchestrates the PI3K signals by regulating the activation of AGC kinases. In order to elucidate the role of PDK1 in the central nervous system, two conditional knockin mice models were generated based on the disruption of two functional domains of PDK1 that are essential for substrate activation: the PH-domain and the PIF-pocket. In this thesis, I generated and characterized the brain-specific PDK1 conditional knockin mice which express the L155E mutation within the nervous system. This mutation disrupts the PDK1 PIF-pocket domain impairing the activation of RSK, SGK and S6K, whereas PKB activation was not affected. Deficits in the PIF-pocket dependent kinases activation were not translated into a significant deregulation of the neuronal survival, whilst neuronal polarization and differentiation were severely impaired. The abnormal neuronal development resulted in microcephaly as well as a huge neuronal circuitry reduction in the cortex and hippocampus brain areas. These physiological alterations broke the communication between the gabaergic and the pyramidal neurons, probably due to a deregulation in the neuronal migration process. Mice expressing the PDK1 L155E mutation in the central nervous system were vulnerable in front of stress insults, with behavioural outputs that reproduced a new model for negative and cognitive symptoms related to psychiatric disorders such as schizophrenia. Altogether, these studies show us the relevance of PDK1, acting as the master kinase involved in PI3K signalling pathway regulation, in neuronal development leading to the appropriate consolidation of cerebral functions.