Memoria para optar al título de Bioquímico / La enfermedad neurológica conocida como Paraparesia Espástica Tropical, mielopatía asociada al HTLV-I (TSP/HAM) se caracteriza por la degeneración axonal de los haces córtico-espinales. Aunque no se conoce mucho como el HTLV-I afecta selectivamente a los axones más largos del sistema nervioso central (SNC), es la proteína viral Tax secretada desde los linfocitos T-CD4+ el principal candidato por su actividad estimuladora de factores transcripcionales a través de varias vías de señalización. Esta proteína, se encuentra presente en forma crónica en el líquido cefalorraquídeo (LCR), pudiendo alterar el transporte axonal actuando extracelularmente, siendo afectados principalmente los axones más largos por su mayor vulnerabilidad. Estudios in vitro de la proteína Tax muestran que se une a varias proteínas celulares que regulan vías relacionadas con la transcripción y el citoesqueleto, incluyendo fosfatasas y quinasas, por lo que se sugiere que en esta patogenia podría haber un desbalance en el nivel de fosforilación/desfosforilación de las proteínas del citoesqueleto. Se han propuesto como biomarcadores de varias enfermedades neurodegenerativas los niveles de Tau total y/o fosfo-Tau en el LCR. Por lo tanto, los objetivos de esta investigación fueron comparar la fosforilación de Tau presente en el LCR de pacientes con TSP/HAM y sujetos controles, a fin de aclarar si estas proteínas están involucradas en la patogenia de esta enfermedad, y aislar la proteína Tau desde el LCR para posteriores estudios de proteómica de sus fosfoformas. Los niveles de Tau en el LCR y la evaluación del patrón molecular de fosforilación de residuos específicos como Tre181, Ser199, Tre205, Tre231, Ser262, Ser356, Ser396, Ser404 y Ser422 fue realizada por “immunowestern blot” utilizando anticuerpos policlonales monoespecíficos. Con todos los anticuerpos ensayados se observó la presencia de una banda principal de 52 kDa. Los niveles de Tau en el LCR de los TSP/HAM no fueron significativamente distintos de los de controles, y aunque no fue significativamente diferente (p = 0,06), se podría sugerir sólo una anormal hiperfosforilación de Tre181. Si se confirmara este mayor nivel fosforilación en Tre181 trabajando con un número mayor de pacientes o utilizando otros métodos más confiables, sugeriría un aumento en la actividad o una sobre-expresión de dos quinasas dirigidas a Ser/Tre-Pro, GSK3-α y β, Cdk5. Una caracterización completa de la fosforilación de los distintos residuos de Tau en el LCR de los controles y pacientes con TSP/HAM requirió la aplicación adicional de la técnica analítica de Espectrometría de Masas (MS). Por lo tanto, se trató de aislar Tau desde LCR utilizando una columna de afinidad por fosfopéptidos de Ga(III), y dos métodos de inmunoprecipitación, uno usando proteínas A/G acopladas a agarosa y una segunda con unión covalente de los anticuerpos (“Sepharose” activada con CNBr). Ni la columna de Ga(III) ni el primer método de inmunoprecipitación fueron adecuados para posterior análisis por MS. Después de demostrar por SDS/PAGE que el método que usaba los anticuerpos unidos covalentemente mostraba una banda principal de 52 kDa, se eluyó la proteína del gel, tripsinizó y analizó por MS MALDI-TOF. Se observó la posible presencia de proteínas asociadas al citoesqueleto que podrían haber coinmunoprecipitados con Tau. Estos resultados no fueron confirmatorios por el bajo “score” observado. En conclusión, dos de los resultados muestran diferencias entre TSP/HAM y varias enfermedades neurodegenerativas: el no aumento en los niveles de Tau total, y la posible hiperfosforilación de sólo Tre181. Fue importante lograr aislar Tau desde el LCR para futuros estudios de MS / The neurological disorder known as tropical spastic paraparesis / HTLV-I-associated myelopathy (TSP/HAM) is characterized by axonal degeneration of the cortico-spinal tracts. Although the selectivity of HTLV-I towards the longest axons of the central nervous system (CNS) is not fully understood, the main candidate is the secreted viral protein Tax from lymphocytes T-CD4+ that shows a stimulatory activity of transcriptional factors acting through several signaling pathways is the main candidate. This protein, chronically present in CSF, could extracellularly alter axonal transport. The longest axons are mainly affected because they are more vulnerable. In vitro studies on Tax protein have shown the binding of this protein to many cellular proteins that regulate transcription and cytoskeleton related pathways including phosphatases and kinases, therefore an imbalance in the level of cytoskeleton phosphorylated/unphosphorylated proteins could be involved in this pathogeny. Levels of total Tau and/or phospho-Tau in the CSF have been proposed as biomarkers of various neurodegenerative diseases. Hence, the aims of this investigation were to compare Tau phosphorylation present in CSF of TSP/HAM patients and control subjects, to elucidate if these proteins are involved in the pathogeny of this disease, and to isolate Tau protein from CSF for further proteomic studies of its phosphoforms. Levels of Tau in CSF and evaluation of the molecular pattern of phosphorylation of selected residues such as Thr181, Ser199, Thr205, Thr231, Ser262, Ser356, Ser396, Ser404 and Ser422 were performed by immunowestern blot, using monospecific polyclonal antibodies. With all the antibodies tested we observed a main band with 52 kDa. The CSF levels of Tau in TSP/HAM were not significantly different from those of controls. Only an abnormal hyperphosphorylation on Thr181, although it was not significantly different (p = 0.06), could be suggested in TSP/HAM patients. If a high phosphorylation level in Thr181 is confirmed by working with a larger number of patients or other more reliable methods, it would suggest an increase in activity or over-expression of two Ser/Thr-pro-directed kinases GSK3-α and β, and Cdk5. A complete characterization of Tau phosphorylation sites in CSF from control and TSP/HAM patients required the use of the additional analytical technique of Mass Spectrometry (MS). Therefore, we tried to isolate Tau from CSF samples using the phosphopeptide affinity column with Ga(III), and two immunoprecipitation methods, one using protein A/G-coupled agarose beads and a second one with covalently bound antibodies (Sepharose activated with CNBr). Neither the Ga(III) column nor the first immunoprecipitation method were adequated for MS analysis. After demonstrating by SDS/PAGE that the method that used covalently bound antibodies showed a main band of 52 kDa, the sample was eluted, trypsinized and analyzed in a Mass Spectrometer MALDITOF. This preliminary study suggested the presence of Tau and of some other cytoskeleton associated proteins that could have been coimmunoprecipited with Tau. The low “score” obtained did not allow reach confirmatory results. In conclusions, two of the results showed differences with various neurodegenerative diseases: lack of changes in Tau levels in CSF, and possible hyperphosphorylation of only threonine 181. It was important to have been able to isolate a Tau form from CSF for further studies of MS

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El alcoholismo está determinado por factores genéticos y medioambientales. El factor genético principal corresponde a los genes que codifican las enzimas que metabolizan el alcohol. El metabolismo hepático del etanol contempla la oxidación del etanol a acetaldehído mediante la deshidrogenasa alcohólica y la posterior oxidación del acetaldehído a acetato, llevada a cabo fundamentalmente por la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2). Un 30-40 % de la población oriental presenta una mutación que genera una ALDH2 sin actividad; al beber alcohol, estos individuos sufren un aumento en el nivel de acetaldehído sanguíneo, lo que trae como consecuencia efectos disfóricos que generan aversión por el alcohol. El fármaco disulfiram, utilizado para el tratamiento del alcoholismo, imita este fenotipo asiático ya que inactiva covalentemente a la ALDH2. Sin embargo, su eficacia farmacológica está contrarrestada por la variabilidad individual, la toxicidad, el requerimiento de ingesta diaria y por la necesidad de que el paciente se comprometa a medicarse. El desarrollo de fármacos alternativos más específicos y de mayor duración es concebible en base a disminuir la cantidad de la enzima ALDH2 disminuyendo la expresión de su gen. Ello se puede efectuar con moléculas capaces de degradar el mRNA de la ALDH2 como las ribozimas, moléculas de RNA que reconocen su blanco por enlaces de Watson y Crick y lo cortan en una secuencia específica. En este trabajo de tesis se determinó si la ribozima de horquilla RzCG20 ―capaz de disminuir la actividad de la ALDH2 en células de hepatoma de rata en cultivo― es capaz de producir el mismo efecto in vivo al entregar, en un vector adenoviral, un gen que codifica dicha ribozima a ratas UChB dependientes de alcohol, de manera que al consumirlo sufran un aumento del acetaldehído sanguíneo cuyos efectos aversivos disminuyan el consumo voluntario de alcohol. Se produjeron y purificaron vectores adenovirales que codifican la ribozima RzCG20, la ribozima control RzCG20c diseñada para unirse a su blanco sin degradarlo, o un RNA no funcional control. Se transdujeron células de hepatoma de rata en cultivo con las preparaciones adenovirales obtenidas para asegurar que eran biológicamente activas, es decir, que eran capaces de disminuir la actividad de la ALDH2. En experimentos in vivo, los vectores adenovirales se inyectaron en la vena de la cola de ratas que voluntariamente beben gran cantidad de alcohol (ratas UChB), determinándose que una sola administración del vector adenoviral codificante de la ribozima RzCG20 a ratas UChB (n=5) disminuye en ~50 % el consumo de alcohol durante 34 días de un periodo de acceso restringido a etanol (1 h al día). Igual efecto se obtuvo con el adenovirus codificante de la ribozima control RzCG20c; el adenovirus control y el vehículo no disminuyeron el consumo. A los 39 días postinyección, las ratas que recibieron los vectores adenovirales codificantes de las ribozimas evidenciaron una reducción de ~24 % en la actividad de la ALDH2 hepática (medición espectrofotométrica) y un aumento en el acetaldehído sanguíneo dos veces mayor que los animales controles (según cromatografía de gases) luego de una administración intraperitoneal de alcohol (1 g/kg). En conclusión, se demostró actividad biológica específica in vivo de la ribozima RzCG20 y la ribozima control RzCG20c para silenciar el mRNA de la ALDH2: ambas ribozimas lograron una disminución parcial de la actividad de la ALDH2 sin afectar la actividad de otras ALDHs. Las posibles diferencias mecanísticas entre las ribozimas no se manifestaron en sus efectos bioquímicos sugiriendo que la sola unión de la ribozima control RzCG20c a los 17 nucleótidos reconocidos en el mRNA de la ALDH2 es suficiente para reducir, por bloqueo del mRNA, la actividad de la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial en un grado que permite disminuir el consumo de alcohol. En suma, el desarrollo de una terapia génica para el alcoholismo disminuyendo la expresión del mRNA de la ALDH2 mediante ribozimas de horquilla es promisorio.

La helada se caracteriza por el descenso de la temperatura del aire bajo los cero grados Celsius, es uno de los problemas más severos para la agricultura andina, siendo las regiones más afectadas del Perú, aquellas ubicadas entre los 2 500 y 3 500 metros sobre el nivel del mar (m.s.n.m.). Estudios a nivel morfológico y fisiológico indican que las papas nativas constituyen importantes fuentes de genes relacionados con la tolerancia a heladas. Sin embargo, aún son desconocidos los mecanismos moleculares de tolerancia en estas papas. La tecnología de secuenciación de RNA (RNA-seq) es una excelente herramienta para identificar cambios en el perfil de expresión de los genes. En este estudio, utilizando RNA-seq, realizamos un análisis comparativo del transcriptoma de dos variedades de Solanum tuberosum subsp. andigena con respuesta contrastante al estrés de helada. Se alinearon más de 199 millones de lecturas usando el genoma de referencia Solanum tuberosum Group Phureja, que correspondió al 82.3% de las lecturas totales obtenidas tras el secuenciamiento. Se identificaron 279 y 160 genes expresados diferencialmente en Yana Manwa (YM, variedad tolerante al estrés por helada) y Yuraq Gaspar (YG, variedad susceptible), respectivamente. En general, los genes expresados diferencialmente enriquecidos (DEGs) estuvieron implicados en la estructura de la pared celular, metabolismo de carbohidratos, enzimas con actividad antioxidante. Además, identificamos DEGs asociados a diferentes factores de transcripción. Estos resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre los sistemas de regulación de la tolerancia a la congelación de la papa y proporcionan recursos genéticos para estudios posteriores. / Tesis

Memoria para optar al título de Bioquímica / Las asimetrías cerebrales en el eje izquierda-derecha de vertebrados poseen componentes altamente conservados y son un punto importante de estudio para la biología del desarrollo. Entre estas asimetrías, las más estudiadas se encuentran en el epitálamo, una región ubicada en el diencéfalo dorsal de vertebrados cuyas conspicuas asimetrías poseen un importante factor hereditario y de lateralidad. En esta región, se encuentra la presencia de un par de núcleos habenulares (Hb, órgano par), además se encuentra el complejo pineal formado por el órgano pineal (órgano impar) en la línea media y por el órgano parapineal (Opp) que se encuentra a la izquierda y proyecta axones eferentes hacia la habénula ipsilateral. En este trabajo se realizó un estudio comparado entre dos especies de teleósteos, pez cebra (D. rerio) y pez medaka (O. latipes), para intentar dilucidar como se generan las características conservadas y especie-específicas durante la ontogenia del epitálamo. Estudios realizados en nuestro laboratorio demostraron que estos teleósteos poseen variaciones morfotopológicas especie-específicas en la región del epitálamo (heterotopías) y, luego de normalizar los tiempos de desarrollo en ambas especies, se comprobó que también existen variaciones en la temporalidad del desarrollo (heterocronías). La heterocronía más significativa es que las proyecciones Opp de pez medaka se desarrollan antes que en pez cebra. Debido a lo anterior, se puede hipotetizar que las diferencias topológicas observadas entre ambas especies podrían tener relación con la temporalidad de desarrollo de los componentes que forman el circuito Opp-Hb. En este contexto, el momento en que ocurre la interacción entre el Opp y la Hb podría ser un factor importante para definir la citoarquitectura final del circuito. Lo anterior se respalda en el hecho de que en pez cebra las células habenulares tienen distinta temporalidad de proliferación en cada núcleo, lo que genera subnúcleos habenulares lateral y medial, de distintos tamaños. Este rasgo asimétrico sería dependiente de la presencia del órgano parapineal, ya que a cada subnúcleo se han asociado marcadores moleculares cuya expresión suele ser asimétrica, pero ésta se pierde cuando el Opp es ablacionado. Por otra parte, la neurogénesis habenular, posee asimetría izquierda en su inicio, la cual se conserva incluso luego de ablacionar el Opp, lo que la define como un rasgo asimétrico independiente de la presencia del Opp. Luego, si suponemos que estas interacciones son conservadas también en el modelo de pez medaka, las eventuales variaciones heterocrónicas pueden estudiarse para comprender como podrían generarse las diferencias topológicas entre ambos teleósteos. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue dilucidar si estas características se encuentran conservadas y observar de qué manera podría influir el adelantamiento de las proyecciones del Opp. Se esperaba que la neurogénesis habenular de pez medaka inicie de manera asimétrica en el mismo momento de desarrollo que pez cebra. Por otro lado, se esperaba que la proliferación celular, al ser un evento dependiente del Opp, se inicie antes debido al adelantamiento de la ontogenia del Opp. Para estudiar lo anterior se utilizó el marcador pan neuronal HuC, para identificar neuronas diferenciadas y se usaron marcadores moleculares que en pez cebra se asocian al dominio de los subnúcleos habenulares. Los resultados de nuestro estudio demostraron nueva evidencia de heterotopía y heterocronía entre pez cebra y medaka, se descartó la hipótesis planteada, pues la neurogénesis habenular en pez medaka está adelantada pero continúa siendo asimétrica en su inicio, lo que podría indicar que en esta especie sí existe una relación entre el Opp y la neurogénesis habenular. Por otro lado, con el gen nptx2a, ortólogo de narp de pez cebra, se encontró un arreglo topológico diferente a la asimetría izquierda esperada con narp, pues el marcador de pez medaka es más simétrico y se limita a una región más pequeña en ambas habénulas, asemejándose más a una topología propia a la descrita en la habénula derecha de pez cebra. Nuestros estudios respaldan la idea de que las interacciones entre el Opp y la HbI parecen ser más complejas de lo que los estudios en pez cebra revelan. Nuestros resultados sugieren interacciones más tempranas y probablemente bidireccional entre la habénula izquierda y el órgano parapineal / Brain asymmetries along the left-right axis show highly conserved components across vertebrates. Among these asymmetries the most studied is found in the epithalamus, a region located in the dorsal diencephalon. Epithalamic asymmetries are conspicuous and genetically controlled, and are characterised by the presence of left-right differences in morphology and gene expression of the bilaterally paired habenular nuclei and by the left-sided asymmetric position and connectivity to the left habenula (Hb) of the unpaired parapineal organ (PpO), an accesory component of the pineal complex. In this work we performed a comparative study between two species of teleosts, zebrafish (D. rerio) and medaka (O. latipes), to elucidate how the conserved and species-specific features of epithalamic asymmetries are generated during the ontogeny of the epithalamus. Previous studies of our laboratory showed that these teleosts show both topological and temporal variations in the development of epithalamic asymmetries, known as heterotopies and heterochronies, respectively. Among the latter, the most significant difference is observed in the timing of connectivity of the parapineal organ to the left Hb, which in medaka fish begins earlier than in zebrafish. Due to the above, we hypothesised that the topological differences observed between both species could be related to the temporality of development of the components that make up the parapineal-habenula circuit. In this context, the time in which the interaction between the parapineal organ and the habenula occurs could be an important factor in defining the final cytoarchitecture of the circuit. This idea is supported by the fact that in zebrafish the habenular cells have different temporality of proliferation in the left and right nuclei, which generates size differences in the lateral and medial habenular subnuclei on both sides. This asymmetric trait appears to depend on the presence of the parapineal organ, since the asymmetric expression of the molecular markers that have been associated to each habenular sub-nuclei is lost when the parapineal organ is physically removed during development. In contrast, the onset of habenular neurogenesis is asymmetric even after ablating the PpO, which defines a type of asymmetry that is independent of the parapineal organ. Based on the above and if we assume that these types of asymmetries are also conserved in medaka, the heterochronic variations can be studied as a possible factor that explains how the topological differences of epithalamic asymmetry between both teleosts are generated. Therefore, the aim of this work was to have a first mechanistic approach to this question and investigate the timing and organisation of habenular neurogenesis in medaka and relate this to the pattern observed in zebrafish and the advancement of parapineal projections in both species. Habenular neurogenesis of medaka was expected to start asymmetrically at the same time as in zebrafish while cell proliferation, being an event dependent of the parapineal organ, it was expected to start earlier due to overtaking of parapineal projections in this species. The pan-neuronal marker HuC was used to identify differentiated neurons and molecular subnuclei. The results of this study provided new evidence of heterotopic and heterochronic shifts between zebrafish and medaka that appear to rule out our hypothesis. The onset of habenular neurogenesis in medaka was asymmetric as in zebrafish but appeared at an earlier stage. This observation suggest that in contrast to zebrafish, the onset of asymmetric habenular neurogenesis in medaka has some type of dependency on the parapineal organ. This possibility can be assesed in the future by performing parapineal ablation in medaka. On the other hand, using the medaka nptx2a gene, an ortholog of zebrafish narp, we observed a different topological arrangement with a more restricted and fairly symmetric habenular expression, in contrast to the broad and pronounced left-sided asymmetric expression observed in zebrafish. This expression pattern resembles the topology described in the right habenula of zebrafish. In summary, our studies support the idea that interactions between the parapineal organ and the left Hb are more complex than the studies of zebrafish suggest. These interactions appear to have an earlier onset and show a bi-directional nature / FONDECYT; CONICYT; FONDAP; Iniciativa Científica Milenio, ICM P-09-015-F

Memoria para optar al título de Bioquímico / En la actualidad, la postergación de la maternidad, se ha vuelto una tendencia cada vez más preponderante en las mujeres. Esto debido al mayor acceso a la educación, oportunidades laborales y métodos para el control de la natalidad. Por consiguiente, cuando la mujer decide ser madre más allá de los 30 años de edad, ya se aproxima al periodo de subfertilidad, etapa en donde la reserva folicular ovárica disminuye considerablemente, al igual que las probabilidades de éxito de un embarazo. Por lo anterior, es que ha tomado gran importancia el estudio del funcionamiento ovárico durante el envejecimiento reproductivo y de los factores involucrados en dicho proceso. En la regulación del desarrollo folicular, participan una pluralidad de factores destinados a controlar cada etapa. En la última década, ha tomado especial protagonismo una citoquina denominada Factor Inhibidor de Leucemia (LIF), conocida ampliamente en el ámbito reproductivo por ser de vital importancia en el proceso de implantación uterina y, además, por participar en el desarrollo folicular ovárico, promoviendo la transición de folículos primordiales a primarios en rata y favoreciendo el proceso ovulatorio en primates. Sin embargo, se cree que sus acciones se encontrarían bajo la regulación de Kisspeptina (KP), un neuropéptido clave en el control del eje Hipotálamo-Pituitaria-Gónadas (HPG). De ser así, esto cobraría aún mayor importancia durante el periodo de subfertilidad, etapa en la que se ha demostrado que ocurre un aumento significativo en los niveles de expresión de KP en el ovario. Tomando en cuenta estos antecedentes, se postuló que “KP induce la expresión de LIF en ovario de rata durante el período de subfertilidad”. El objetivo general del presente trabajo consistió en determinar la expresión de LIF en ovarios de ratas Sprague Dawley en los periodos fértil y subfértil y estudiar los efectos de la adición de KP sobre la expresión de LIF durante ambos periodos. Los resultados muestran que: 1) los niveles de mRNA de LIF en el ovario no varían durante el envejecimiento reproductivo; 2) los niveles de proteína de LIF se encuentran aumentados durante el período fértil; y 3) la adición de KP produce un aumento en el contenido proteico intraovárico de LIF durante el periodo fértil, sugiriendo una posible regulación de KP sobre LIF en este estadio. Por consiguiente, los resultados obtenidos no avalan la hipótesis planteada puesto que el tratamiento de los ovarios con KP no tuvo efecto sobre la expresión de LIF durante el periodo subfértil. Sin embargo, los resultados sugieren que KP participa en la regulación de LIF en el periodo fértil / At present, the postponement of maternity has become an increasingly preponderant trend in women. This is due to the increased access to education, job opportunities and methods for birth control. Therefore, when women decide to become mothers beyond the age of 30, they are approaching the period of subfertility, a stage in which the ovarian follicular reserve decreases considerably, as well as the probabilities of a successful pregnancy. Due to the above, the study of ovarian function during reproductive aging and the factors involved in this process has taken great importance. In the regulation of follicular development, a plurality of factors are involved in controlling each stage. In the last decade, the Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) has played a prominent role, a cytokine widely known in the reproductive field by its role in the uterine implantation process and, in addition, by its participation in ovarian follicular development, promoting the transition from primordial to primary follicles in rat and favoring the ovulatory process in primates. Nevertheless, it is thought that their actions would be under the regulation of Kisspeptin (KP), a key neuropeptide in the control of the Hypothalamus-Pituitary-Gonads (HPG) axis. If so, this would be even more important during the subfertility period, a stage in which it has been shown to occur a significant increase in KP expression levels in the ovary. Considering this background, it was postulated that, "KP induces LIF expression in the rat ovary during the subfertility period". The main objective of the present work was to determine the expression of LIF in ovaries of fertile and subfertile Sprague Dawley rats and to study the effects of the addition of KP on the expression of LIF during both periods. Our results revealed that: 1) LIF mRNA levels in the ovary did not change during reproductive aging; 2) LIF protein levels were increased during the fertile period; and 3) the addition of KP in an in vitro system, produces an increase in the intraovarian protein content of LIF during the fertile period. These data suggest a possible regulation of LIF by KP during this stage of development. Therefore, we concluded that the results obtained do not support the hypothesis of a stimulatory role of KP on LIF expression, since the treatment of the ovaries with KP did not affect the expression of LIF during the subfertile period. Nevertheless, our results suggest that KP may participate in the regulation of LIF expression during the fertile period

Memoria para optar al título de Bioquímico / La regulación de la circulación pulmonar en el periodo de perinatal es fundamental en la mantención de una presión arterial media (mPAP) y una resistencia vascular disminuida. Una desregulación del tono arterial pulmonar basal puede llevar a patologías tal como hipertensión pulmonar. Está descrito que la regulación del tono arterial pulmonar basal es resultado de un equilibrio de agentes constrictores y relajantes. La principal vía de transducción de señales involucrada según la bibliografía es la de sGC-cGMP-PKG, sGC es activado por compuestos gaseosos como NO (producido en la capa endotelial por eNOS) y en menor proporción por CO, que puede ser producido endógenamente por hemoxigenasas. Existen antecedentes de la estimulación de la vía sGC-cGMP mediante la administración exógena de hemina en modelos de ovejas recién nacidas (RNOV) hipertensas. Se desconocen los efectos de la inducción de la respuesta dependiente de cGMP en un modelo de RNOV normotenso. Nuestra hipótesis es que la administración de hemina produce en la circulación pulmonar neonatal una exacerbación de la vía vasodilatadora dependiente de cGMP. Se utilizaron RNOV normotensas de nivel de mar, dividiéndolas en dos grupos al azar. Se les administró hemina (15mg/Kg peso) o control (Vehículo de NaOH 0,01N y PBS 1x) desde el 5to día de vida, durante 10 días. Al día 17 de vida se eutanizó y se recolectaron tejidos para el estudio funcional ex vivo con miografías de alambre de la vía dependiente de cGMP en arterias pequeñas de pulmón, e in vitro con PCR de la expresión génica de sus componentes y por ELISA para evaluar el contenido de cGMP del tejido pulmonar. Los resultados muestran un aumento del contenido total de cGMP en el grupo con administración de hemina y aumento de la funcionalidad dependiente de cGMP por lo que se acepta la hipótesis de la memoria. Estos resultados contrastan con la respuesta in vivo donde no se modificó la mPAP entre ambos grupos. Se concluye que la regulación del tono vascular basal primordialmente no depende del equilibrio de los agentes vasoactivos como es descrito en la bibliografía del tema estudiado y por lo tanto se cuestiona la supuesta regulación de la circulación pulmonar basal del periodo perinatal / The pulmonary circulation’s regulation in the perinatal period it is fundamental in the maintenance of mPAP and RVP decreased. A deregulation of basal pulmonary arterial tone can lead to pathologies as pulmonary hypertension. It is described that the basal pulmonary arterial tone regulation it is given by a balance between constrictors and dilators agents. The main signal transduction pathway involver according to research it is the sGC-cGMP-PKG one, sGC can be activated by gaseous compounds as NO (produced on the endothelial layer by eNOS) and in a minor degree by CO, which can be produced endogenously by hemoxygenases. The data showed that exogenous hemin administration in hypertensive newborn lamb can stimulate the sGC-cGMP pathway. It is unknown of the effects of the induction of cGMP-dependent response in a pulmonary normotensive newborn sheep model. Our hypothesis it’s that hemin administration lead to an exacerbation of the cGMP pathway on the pulmonary circulation regulation. Normotensive newborn sheep were used from lowlands, dividing them on two random groups. Hemin (15mg/Kg weight) or control (Vehicle 0.01N NaOH and PBS 1x) was administered from the 5th day of life, for 10 days. On day 17 postnatal life the animal was euthanized and tissues were collected for the ex vivo study with wire myographies of functional study of the cGMP dependent pathway in small pulmonary arteries, and in vitro with PCR of the mRNA expression of the components of the pathway and ELISA technique for cGMP content of lung tissue. The results showed an increase in the total cGMP content in hemin group administration and an increase in cGMP-dependent functionality hence accepting the hypothesis of this study. This results contrast with the in vivo response where mPAP was unmodificated. It is concluded that the basal pulmonary circulation tone regulation is not dependent of the balance between the vasoactive agents as described by a lot of researchers of the studied topic and therefore, the supposed regulation of the basal pulmonary circulation of the perinatal period is questioned

Memoria para optar al título de Bioquímico / Las neuronas son células que permiten la conducción nerviosa mediante potenciales de acción. Para lograr esto, evolucionaron y desarrollaron una proyección altamente especializada llamada axón, en la cual se concentran canales iónicos de membrana que permiten el flujo de iones. Los canales de sodio activados por voltaje (Nav) son los canales iónicos que permiten la generación y propagación de los potenciales de acción. En el caso de los axones mielinizados, estos se concentran en el segmento inicial del axón y en los nodos de Ranvier, constricciones simétricas de la vaina de mielina donde se regenera el potencial de acción. Su abundancia y distribución a lo largo del axón no son fijas, sino que varían durante procesos como desarrollo y regeneración axonal. Se sabe que los axones son capaces de sintetizar proteínas localmente. A la fecha se ha reportado que la síntesis axonal de proteínas se ve aumentada en respuesta a daño axonal. Sin embargo, se desconoce si proteínas de membrana también son sintetizadas y traficadas localmente. En este contexto se ha reportado un aumento de Nav luego de daño axonal. El objetivo de este trabajo es establecer si la síntesis axonal de proteínas y la ruta secretoria local contribuyen a reestablecer los niveles de Nav en nodos de Ranvier luego de daño axonal. Para evaluar esto, se utilizó un modelo de daño axonal generado a partir de la transección de nervio ciático de rata. Se inhibió la síntesis y ruta secretoria axonal mediante la aplicación in vivo de cicloheximida (CHX) y brefeldina A (BFA) respectivamente. Ambos fármacos fueron inyectados independientemente en el nervio transectado. Se evaluó su efecto sobre la abundancia y distribución de Nav mediante inmunofluorescencia y western blot. En primer lugar, se corroboró que el daño axonal produce un aumento de los Nav en los nodos de Ranvier. Esta sobreexpresión de los canales de sodio activados por voltaje producto de daño axonal es bloqueada al inhibir la síntesis y ruta secretoria axonal con herramientas farmacológicas. Estos datos sugieren la existencia de una ruta biosintética y de tráfico axonal capaz de mediar el rápido aumento de Nav en procesos de regeneración axonal / Neurons are highly polarized cells that evolved to transmit nerve impulses. To achieve this function, they developed a process called the axon that concentrates ion channels. Voltage gated sodium channels (Nav) are responsible for generating and propagating action potentials. In myelinated axons, these proteins are concentrated at the axon initial segment (AIS) and at the nodes of Ranvier. Nodes are symmetric constrictions of the myelin sheath where action potentials are regenerated. The availability and distribution of Nav are plastic, meaning they change during developmental stages or regeneration. It is currently known that axonal protein synthesis in enhanced in response to axonal injury. However, it is still unknown whether local protein synthesis controls the abundance of membrane proteins in the axon and if Nav are subject to this regulation. The aim of this work is to study if Nav upregulation after axonal injury is related with axonal protein synthesis and the axonal secretory route. To evaluate this, we used an axonal injury model generated from the transection of the rat sciatic nerve. Local synthesis and the function of the axonal secretory route were inhibited in vivo using cycloheximide (CHX) or brefeldin A (BFA) respectively. Both drugs were injected in the nerve right after transection. The effect on Nav was evaluated by immunofluorescence and western blot. First, we corroborated that axonal injury enhances Nav at nodes of Ranvier. This upregulation disappears when axonal protein synthesis or the local secretory route were inhibited. Our data suggest the existence of an axonal synthetic and trafficking route capable of mediating the fast Nav upregulation during axonal regeneration / ICM, número de proyecto P09-015-F; Fondecyt, 1140617

Memoria para optar al título de Bioquímico / Las proteínas dulces Taumatina (Tau) y Brazeina (Bra), son proteínas no tóxicas, las cuales son 2.000 a 3.000 veces más dulces que la sacarosa y 10 veces más dulces que la Stevia, pero con la ventaja de tener un sabor similar a la sacarosa. En la actualidad, se han utilizado como edulcorantes y potenciadores naturales del sabor en diferentes alimentos. Al igual que la Stevia, no aporta calorías y es un alimento apto para diabéticos. Por estas razones, la expresión de Tau y Bra, podría ser una estrategia útil para mejorar el sabor de frutos, haciéndolos más dulces, sin añadir calorías y carbohidratos. Además, también se ha descrito que estas proteínas son similares a proteínas con actividad anti patógenos (taumatina) o a péptidos antimicrobianos (brazeina) en plantas, lo que las hace también atractivas para ésta aplicación biotecnológica. En el contexto de este trabajo y con el fin de expresar los genes tau y bra en frutos, se generaron los vectores pPG-taubra, pPG-tau, pPG-bra, 35SCaMV-tau y 35SCaMV-bra, tres con promotor fruto específico y dos con promotor constitutivo. En la presente memoria de título, se analizó la funcionalidad de los vectores a través de la transformación transitoria de frutos de tomate y hojas de tabaco. Se obtuvo que 4 de los 5 vectores son funcionales para expresar el transgen. Luego, se prosiguió con la transformación estable de tomate y tabaco, con dichos vectores de expresión. Durante esta memoria de título, se estandarizó con éxito la transformación de tomate usando hojas como explantes y se comparó con la transformación estable a partir de explantes de cotiledón. La correcta transformación y expresión de los transgenes tau y bra fue evaluada por PCR y RT-PCR, respectivamente en líneas de tomate y tabaco, se obtuvo 5 y 2 líneas de tomate transgénicas (por PCR) para taubra y bra, respectivamente. En tabaco se obtuvo 4 líneas transgénicas que expresan el transgen tau y 4 líneas transgénicas que expresan bra / The sweet proteins Thaumatin (Tau) and Brazzein (Bra), are non-toxic proteins, of 2,000 to 3,000 fold sweeter than sucrose and 10 times sweeter than stevia but with the advantage of having a more similar flavor to sucrose. At present, they have been used as sweeteners and natural flavor enhancers in different foods. As proteins they do not provide calories and are suitable for diabetics. For these reasons, the expression of Tau and Bra could be a useful strategy to improve fruit flavor, making it sweeter, without adding calories and carbohydrates. In addition, these proteins are similar to proteins with anti-pathogenic activity (thaumatin) or antimicrobial peptides (brazeine) in plants, which makes them also attractive for biotechnological applications in this field. In the context of this work and in order to express the tau and bra genes, they were generated five expression vectors for these proteins, pPG-taubra, pPG-tau, pPG-bra, 35SCaMV-tau and 35SCaMV-bra, were generated. Three of them with a fruit specific promoter and two with a constitutive promoter. In the present thesis, the functionality of these vectors was achieved through the transient transformation of tomato fruits and tobacco leaves. We obtained that four of the five vectors were functional permitting the expression of the transgene. Then, the stable transformation of tomato and tobacco was carried out to express the transgenes in fruits and leaves, respectively. During this thesis, tomato transformation using leaves as explants was successfully standardized and compared with stable transformation from cotyledon explants. The correct transformation and expression of the tau and bra transgenes was evaluated by PCR and RT-PCR, respectively. In conclusion five and two transgenic tomato plants for the fusion protein taubra and bra were obtained (by PCR). Also, four transgenic tobacco lines each, for tau and bra which express the transgene (by RT-PCR), were obtained